CN116200521B - 一种鉴别红松无性系的ssr标记引物组及指纹图谱的构建方法和应用 - Google Patents

一种鉴别红松无性系的ssr标记引物组及指纹图谱的构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种鉴别红松无性系的SSR标记引物组及指纹图谱的构建方法和应用，它涉及SSR分子标记技术领域，本发明提供了SSR标记引物组，并基于其构建指纹图谱：(1)红松总DNA提取，(2)利用SSR引物进行PCR扩增，(3)PCR扩增产物毛细管电泳，(4)指纹图谱构建；其中：步骤(2)利用公开的11对SSR引物进行红松DNA的PCR扩增，所得产物经毛细管电泳检测所得的带型结果，组合形成每个无性系的SSR指纹图谱，根据指纹图谱的差异，再区分无性系。本发明可以快速、准确、高效的从分子水平为红松无性系鉴定、良种选育和遗传改良提供可靠的依据，为中国红松遗传资源保存、评价与利用提供参考。

Description

一种鉴别红松无性系的SSR标记引物组及指纹图谱的构建方 法和应用
技术领域
本发明涉及SSR分子标记技术领域，具体涉及一种鉴别红松无性系的SSR标记引物组及指纹图谱的构建方法和应用。
背景技术
红松(Pinμskoraiensis)，松科(Pinaceae)松属(Pinμs L)，国家重点保存的二级野生植物，也是我国东北林区的乡土树种。原产于我国东北长白山到小兴安岭，常同鱼鳞松、红皮云杉组成混交林。耐寒性强，喜微酸性土或中性土。木材轻软、细致、纹理直、耐腐蚀性强，为建筑、桥梁、枕木、家具优良用材；树皮可提取栲胶，树干可采松脂，是能够提供木材，纸浆和油脂的良好树种，此外红松的果实由于具有非常高的营养价值，含有大量的粗蛋白，粗脂肪，多糖和粗纤维以及维生素，矿物质和微量元素而成为最受欢迎的松仁产品，为产地主要造林树种，又为观赏树。
传统的林木鉴定主要依靠营养器官和生殖器官的形态性状差异，受环境和生长阶段的影响很大，但是无性系间的形态差异较小，一些外观形态易受到环境因素的影响，因此难以从形态学上对不同无性系进行鉴定，极易出现无意识的混种、混系等现象，或者有意识的侵权现象，给生产、科研和良种保护及推广等工作带来极大的不方便。随着分子生物学的不断发展，DNA分子标记被广泛应用于种质资源鉴定和揭示树木种内的遗传多样性等。
由于SSR标记可以从分子水平进行鉴定，能够精确到单个核苷酸水平，稳定性高、重复性好、多态性好，更有说服力，而且能够鉴定所检测位点是纯合还是杂合。合成荧光引物进行PCR扩增，然后用毛细管电泳仪对产物进行毛细管电泳，根据不同的峰值检测多态性并构建指纹图谱，此种方法比聚丙烯酰胺凝胶电泳法更易于实现自动化读值，实现规模化检测，且准确可靠。然而，到目前为止国内外尚没有利用荧光SSR标记技术对红松无性系鉴别及指纹图谱构建的系统性应用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别红松无性系的SSR标记引物组及指纹图谱的构建方法和应用。
本发明的一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组，所述的引物组如下：
标记p49上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；
标记p70上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
标记p72上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
标记p79上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；
标记p82上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；
标记EPD11上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQID NO.12所示；
标记NFPK-34上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
标记P6*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；
标记P45*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.18所示；
标记P51*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.20所示；
标记P52*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.22所示。
进一步地，所述标记p49的上游引物、标记p70的上游引物、标记P6*的上游引物的5’端均连接有荧光标签FAM；
所述标记p72的上游引物、标记p79的上游引物、标记P45*的上游引物的5’端均连接有荧光标签HEX；
所述标记p82的上游引物、标记P52*的上游引物的5’端均连接有荧光标签ROX；
所述标记EPD11的上游引物、标记NFPK-34的上游引物、标记P51*的上游引物的5’端均连接有荧光标签TAM。
进一步地，所述的试剂盒含有上述SSR标记引物组。
一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组在红松种质资源、遗传多样性评价、亲缘关系分析、分子标记辅助育种和构建SSR指纹图谱中的应用。
采用所述的一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组的构建指纹图谱的方法如下：
(1)红松基因组DNA提取；
(2)以步骤(1)提取的红松总DNA样品为模板，采用权利要求1或2所述的11对引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
(3)使用毛细管电泳检测步骤(2)获得的PCR扩增产物等位基因数目及大小；
(4)根据步骤(3)的检测结果，形成红松无性系的SSR指纹图谱。
进一步地，步骤(2)中的扩增体系为10μL：
进一步地，步骤(2)中的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，Tm下退火30秒，72°延伸15秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
进一步地，步骤(3)中毛细管电泳检测的步骤为：取步骤(2)的PCR扩增产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。
进一步地，所述毛细管电泳检测为用毛细管电泳仪ABI 3730XL检测，所述检测的参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。
进一步地，步骤(4)中根据步骤(3)的检测结果，形成红松无性系的SSR指纹图谱具体为：根据每对SSR引物的峰值大小，组合形成红松无性系的SSR指纹图谱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明基于毛细管电泳利用11对荧光SSR引物组及其构建指纹图谱，不仅是一种从分子水平上快速、高效鉴定红松无性系的方法，还能够用来进行遗传多样性评价，同时为红松的引种和遗传育种选择亲本提供科学的理论依据，为红松种质资源管理和知识产权保护等方面奠定坚实的基础。
2、本发明基于毛细管电泳利用11对荧光SSR引物组及其构建指纹图谱，结合了SSR标记与毛细管荧光检测的优点，克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳的不足，不仅能准确读出产物片段的大小，精确度达到1bp之内，而且成本较低，极具应用价值。
3、本发明基于毛细管电泳利用11对荧光SSR引物组及其构建指纹图谱，采用特异性的SSR引物组进行红松无性系鉴定，特异性高，扩增效率好，能快速鉴定红松的不同无性系，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。
附图说明
图1为实施例1的荧光SSR引物对p70的部分PCR扩增产物毛细管电泳图；
图2为实施例1的荧光SSR引物对p72的部分PCR扩增产物毛细管电泳图；
图3为实施例1的荧光SSR引物对p82的部分PCR扩增产物毛细管电泳图；
图4为实施例1例的荧光SSR引物对EPD11的部分PCR扩增产物毛细管电泳图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
实施例1
1、引物：
本实施例的11对多态性高且通用性好的引物如表1所示。
表1用于红松无性系鉴别和指纹图谱构建的SSR引物
2、样品来源：
本实施例以161个红松无性系为供试材料。分别采集自黑龙江省苇河、林口、鹤岗、渤海、铁力、吉林省露水河、三岔子7个红松种子园，每个无性系采集5个分株，共收集到805株样本，采集到的嫩叶放在做好标记的自封袋中，并冷藏运输至实验室-20℃储存。
3、基因组DNA的提取
取红松无性系的针叶、使用天根生化科技(北京)有限公司植物基因组DNA提取试剂盒(DP-320)按照说明书进行提取。
4、利用SSR引物进行PCR扩增：
以第2部分提取的红松总DNA样品为模板，采用第1部分的11对荧光标记引物进行SSR-PCR扩增。
上述SSR-PCR扩增体系采用10μL体系：DNA(20ng/μL)0.5μL，Easy-Taq DNA聚合酶0.2μL、dNTP 0.8μL、10×Buffer 1.0μL、10μM浓度的正反向引物各0.25μL，灭菌去离子水7μL。
上述SSR-PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，Tm下退火30秒，72°延伸15秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
5、毛细管电泳检测
取PCR扩增产物在ABI 3730xl测序仪上电泳(上海生工)，毛细管电泳检测的步骤为：取PCR扩增产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。所用参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。
6、SSR指纹图谱构建及分子鉴定
对电泳结果数据整理分析，根据每对SSR引物的峰值，组合形成每个无性系的SSR指纹图谱，按照11个引物的扩增片段大小可区分各个无性系。上述11对SSR引物组以及构建的指纹图谱见表2。
表2SSR引物构建的部分红松无性系指纹图谱
结果表明：利用本实施例提供的一组SSR引物组合可将以上红松无性系完全区分开，部分引物对应的SSR位点在不同红松无性系中基因分型情况见图1-图4。这些引物在不同材料中可扩增出不同片段大小，具有明显的多态性，能快速、准确、高效的完成红松无性系鉴定。
上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (10)

1.一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组，其特征在于所述的引物组由以下引物组成：
标记p49上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
标记p70上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
标记p72上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；
标记p79上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；
标记p82上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；
标记EPD11上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
标记NFPK-34上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQID NO.14所示；
标记P6*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示；
标记P45*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示；
标记P51*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示和
标记P52*上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组，其特征在于所述标记p49的上游引物、标记p70的上游引物、标记P6*的上游引物的5’端均连接有荧光标签FAM；
所述标记p72的上游引物、标记p79的上游引物、标记P45*的上游引物的5’端均连接有荧光标签HEX；
所述标记p82的上游引物、标记P52*的上游引物的5’端均连接有荧光标签ROX；
所述标记EPD11的上游引物、标记NFPK-34的上游引物、标记P51*的上游引物的5’端均连接有荧光标签TAM。
3.一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒含有权利要求1或2 的SSR标记引物组。
4.如权利要求1所述的一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组在红松无性系鉴定和构建红松无性系SSR指纹图谱中的应用。
5.采用权利要求1或2所述的一种基于毛细管电泳技术鉴别红松无性系的SSR标记引物组的构建指纹图谱的方法，其特征在于所述的构建构建指纹图谱的方法如下：
（1）红松基因组DNA提取；
（2）以步骤（1）提取的红松总DNA样品为模板，采用权利要求1或2所述的11对引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
（3）使用毛细管电泳检测步骤（2）获得的 PCR扩增产物等位基因数目及大小；
（4）根据步骤（3）的检测结果，形成红松无性系的SSR指纹图谱。
6.根据权利要求5所述的构建指纹图谱的方法，其特征在于步骤（2）中的扩增体系为10μL：
。
7.根据权利要求5所述的构建指纹图谱的方法，其特征在于步骤（2）中的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3分钟； 94℃变性30秒，Tm下退火30秒，72°延伸15秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
8.根据权利要求5所述的构建指纹图谱的方法，其特征在于步骤（3）中毛细管电泳检测的步骤为：取步骤（2）的PCR扩增产物各0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL 混合加入PCR板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测。
9.根据权利要求8所述的构建指纹图谱的方法，其特征在于所述毛细管电泳检测为用毛细管电泳仪ABI 3730XL检测，所述检测的参数如下：工作电压15.0kV，进样电压1.6kV，喷射持续时间15s，稳压电流30.0μA。
10.根据权利要求5所述的构建指纹图谱的方法，其特征在于步骤（4）中根据步骤（3）的检测结果，形成红松无性系的SSR指纹图谱具体为：根据每对SSR引物的峰值大小，组合形成红松无性系的SSR指纹图谱。
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Genetic diversity analysis and fingerprint construction of Korean pine (Pinus koraiensis) clonal seed orchard;Pingyu Yan等;《Front. Plant Sci》(第第13期期);第1-12页 *

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CN116200521A (zh) 2023-06-02

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