CN107354222A - 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法 - Google Patents

用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107354222A
CN107354222A CN201710761216.3A CN201710761216A CN107354222A CN 107354222 A CN107354222 A CN 107354222A CN 201710761216 A CN201710761216 A CN 201710761216A CN 107354222 A CN107354222 A CN 107354222A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
pairs
primer pairs
eucalyptus
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710761216.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107354222B (zh
Inventor
周长品
李昌荣
李发根
翁启杰
陈升侃
王莉
甘四明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Original Assignee
Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry filed Critical Research Institute of Tropical Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority to CN201710761216.3A priority Critical patent/CN107354222B/zh
Publication of CN107354222A publication Critical patent/CN107354222A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107354222B publication Critical patent/CN107354222B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了用于鉴定桉树无性系的STR引物、PCR试剂盒及方法。本发明通过大量的STR标记分型检测，筛选出了8对多态性高、扩增条带清晰的桉树STR引物用于鉴定桉树无性系，并建立了多重荧光检测体系。将该STR引物组用于鉴定桉树无性系，具有效率高、检测准确、操作方便等优势。本发明可有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益；并可为今后快速进行桉树种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、无性系指纹图谱构建和鉴定提供重要的技术支撑。

Description

用于鉴定桉树无性系的STR引物、PCR试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及用于鉴定桉树无性系的STR引物及其应用。
背景技术
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)树种的总称，是全球三大造林树种之一。桉树因其遗传多样性丰富、生长迅速、木材产量高和适应性强等特点，在华南地区广泛种植，为缓解我国木材供求紧张的局面发挥了重要的作用。
生产中桉树主要以无性系进行繁殖，随着无性系扩繁代数的增加、推广范围的扩大和流通市场的拓展，无性系混乱的问题日益严重，一些无性系名称在组培室和苗圃中被错误记录，市场上还存在以次充好、将表型相似的不良无性系作为优良无性系销售的现象，这极大地损害了种植者的效益。此外，一些单位将别人培育的无性系重新命名、据为己有，不利于知识产权的保护。因此，对桉树无性系进行鉴别尤为重要。
国际植物新品种保护联盟(UPOV,International Union for the Protection ofNew Varieties of Plants)对无性系鉴定的传统方法包括：叶片形态、树皮纹理以及果实性状等一系列形态学以及其它的一些解剖学特征，不同人判定标准难以统一，极易造成鉴定不准确，影响生产。DNA分子标记，尤其是短串联重复序列(short tandem repeat,STR)具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，可以为某一品种提供独特的多态性信息，可以用于植物品种准确的检测和鉴定。目前DNA分子标记已广泛应用于许多农作物的种质资源鉴定，桉树中也相继在不同无性系开展了一定的DNA指纹图谱分析工作，但仍没有一套简单易行的STR检测体系和常用桉树无性系的检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对目前桉树无性系种植情况和现有鉴定方法的缺点与不足，提供一组用于鉴定桉树无性系的STR引物组，其可以在桉树常用无性系中进行快捷、方便鉴定的应用。本发明通过构建桉树无性系的分子鉴定体系，建立桉树无性系指纹图谱，能有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益，提高桉树商品林发展良种化程度。
本发明的第一个目的是提供用于鉴定桉树无性系的STR引物组。
本发明的用于鉴定桉树无性系的STR引物组，包括以下8对引物：
(1)EUCeSSR0475引物对：其正向引物如SEQ ID NO.1所示，其反向引物如SEQ IDNO.2所示；
(2)EUCeSSR0204引物对：其正向引物如SEQ ID NO.3所示，其反向引物如SEQ IDNO.4所示；
(3)EUCeSSR419引物对：其正向引物如SEQ ID NO.5所示，其反向引物如SEQ IDNO.6所示；
(4)EUCeSSR1128引物对：其正向引物如SEQ ID NO.7所示，其反向引物如SEQ IDNO.8所示；
(5)EUCeSSR298引物对：其正向引物如SEQ ID NO.9所示，其反向引物如SEQ IDNO.10所示；
(6)EUCeSSR0176引物对：其正向引物如SEQ ID NO.11所示，其反向引物如SEQ IDNO.12所示；
(7)EUCeSSR181引物对：其正向引物如SEQ ID NO.13所示，其反向引物如SEQ IDNO.14所示；
(8)EUCeSSR304引物对：其正向引物如SEQ ID NO.15所示，其反向引物如SEQ IDNO.16所示。
本发明的第二个目的是提供用于鉴定桉树无性系的PCR试剂盒，包括上述的用于鉴定桉树无性系的STR引物组。
优选，所述的PCR试剂盒，包括2x Type-it Multiplex PCR Master Mix 5μL，RNase-Free Water 1μL，Primers 2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA 2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。
优选，所述的PCR试剂盒，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR0176引物对、EUCeSSR181引物对、EUCeSSR304引物对标记的荧光物质依次分别是ROX、6-FAM、TAMRA、ROX、TAMRA、6-FAM、HEX、ROX。
本发明的第三个目的是提供鉴定桉树无性系的方法。
所述的鉴定桉树无性系的方法，包括以下步骤：
a.提取待测桉树无性系的DNA；
b.以步骤a提取的桉树无性系的DNA为模板，利用权利要求1所述的鉴定桉树无性系的STR引物组进行多重PCR扩增，得到PCR产物；
c.对PCR产物进行分型，与桉树无性系STR指纹图谱进行比对，确定待测桉树无性系的名称。
优选，所述的方法，所述的步骤b中的多重PCR扩增，其反应体系为：2x Type-itMultiplex PCR Master Mix 5μL，RNase-Free Water 1μL，Primers 2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA 2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。上述多重PCR扩增是利用Type-it Microsatellite PCR Kit试剂盒进行(QIAGEN公司，目录号：206241)。
优选，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR0176引物对、EUCeSSR181引物对、EUCeSSR304引物对标记的荧光物质依次分别是ROX、6-FAM、TAMRA、ROX、TAMRA、6-FAM、HEX、ROX。
优选，所述的步骤b中的多重PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，30个循环；60℃延伸30min；20℃保温。
本发明的优点在于：
(1)本发明通过大量的STR标记(400余个)分型检测，筛选出了8对多态性高、扩增条带清晰的桉树STR引物，并优化建立了多重荧光检测体系，具有带型好、多态性高、通过荧光易区分的特点。本发明方法具有实验效率高、检测准确、操作方便等优势。可为今后快速进行桉树种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、无性系指纹图谱构建和鉴定提供重要的技术支撑。
(2)利用上述方法，构建了58个国内常用桉树无性系的指纹图谱，并成功的对上述无性系进行了鉴定；大大减少了对桉树无性系鉴定的工作量，仅需利用8对STR引物、通过一次PCR就可鉴别桉树无性系。该方法可有效甄别假冒和错乱的无性系，切实保障良种培育人和营林种植者的权益。
附图说明
图1是STR多重荧光检测体系对桉树无性系LL280、Q9、Z10-42和DH32-13的检测情况。
图2是58个桉树无性系基于8对STR引物的遗传聚类图，其中桉树无性系Guangzhou1与LH1为同一无性系。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。多重PCR扩增利用Type-it Microsatellite PCR Kit试剂盒进行(QIAGEN公司，目录号：206241)。荧光标记引物委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
实施例1
(1)桉树无性系DNA的提取
收集桉树无性系(表1)叶片，利用CTAB法提取桉树基因组DNA，置于冰箱冷冻，以备使用。
表1 58份桉树无性系
秤好58份桉树无性系(表1)叶样0.3g左右，在液氮中研碎，转移至2mL离心管中，并加入1mL CTAB提取液，60～65℃保温45～60min左右，10min摇动一次。取出样品管，4℃、12000rpm离心10min，取上清液。加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，封口，摇匀；4℃、12000rpm离心10min，取上清液。加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，12 000rpm离心10min，取上清液。向上清液中加入冷藏的、2/3体积的异丙醇，轻轻晃动混匀，静置-20℃下1小时以上。12 000rpm离心10min，倒掉上清液，加1mL 70％和95％乙醇水溶液各洗一次，洗后将管倒置于卫生纸上吸干，真空浓缩仪中真空干燥5min左右。加入1×TE 110μL，沉淀浸泡5～10min，弹动或振荡以充分溶解DNA。稍离心，溶液转入1.5mL离心管中，10 000rpm离心5min，取上清液到另一1.5mL离心管。放-80℃长期保存。
所述的CTAB提取液包括如下成分：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，l.4mol/L NaCl，2％CTAB(w/v)，2％PVP(聚乙烯毗咯烷酮)，1％β-琉基乙醇(每次提取之前混合均匀后使用)。所述的1×TE包括如下成分：10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，PH＝8.0。
(2)多重PCR扩增的STR标记的位点选择
以本单位实验室开发的400余对SSR标记引物为引物、步骤(1)提取的DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为10μl，包括：1μL 10×buffer(100mM Tris-HCl pH9.0,80mM(NH4)2SO4,100mM KCl，0.5％NP-40)，2.0mM的MgCl2，25μM各dNTP，0.5μM前向引物和后向引物，0.5U Taq酶(上海申能博彩公司)，10pmol荧光-dUTP(加拿大Fermentas)，约20ng DNA。PCR扩增在DNA Engine扩增仪上进行(美国Bio-Rad)，扩增程序为：94℃4min；20次循环：94℃30s，70-60℃30s且每循环降低0.5℃，72℃1min；再26次循环：94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。SSR标记的检测利用ABI 3130xl测序仪(美国Applied Biosystems)进行。1μL PCR产物与9.34μL超纯甲酰胺、0.16μL内标GeneScan 500-LIZ(美国AppliedBiosystems)混匀，95℃变性5min、立即冰上冷却。上机操作参考仪器说明，利用相应软件GeneMapper 4.0(美国Applied Biosystems)进行标记检测与判读。
通过上述过程筛选多态性高、分型结果较好的STR标记。共筛选出8对STR引物，用于接下来的实验，分别为EUCeSSR0475、EUCeSSR0204、EUCeSSR419、EUCeSSR1128、EUCeSSR298、EUCeSSR0176、EUCeSSR181和EUCeSSR304引物对，具体引物序列如表2所示(其正向引物、反向引物依次分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.16所示)。
(3)STR引物对桉树无性系的检测
以步骤(2)筛选的STR引物对、结合STR标记的片段大小设计合成不同的荧光引物，8对STR引物在正向引物的5'端所加的荧光依次为：EUCeSSR0475-ROX、EUCeSSR0204-6-FAM、EUCeSSR419-TAMRA、EUCeSSR1128-ROX、EUCeSSR298-TAMRA、EUCeSSR0176-6-FAM、EUCeSSR181-HEX、EUCeSSR304-ROX(如表2所示)。
表2 8对STR引物序列及荧光标记情况
将STR引物进行单基因座荧光引物扩增，扩增产物使用遗传分析仪检测样本峰面积，根据峰面积选择合成的引物浓度。复合扩增的引物浓度根据各个单扩增引物浓度进行进一步的调整。最后将所有标记整合在1次PCR和毛细管电泳中完成检测，即建立优化的STR多重荧光检测体系，具体如下：
优化的STR多重荧光检测体系中各STR引物终浓度情况详见表3，其中每个STR引物对中的正向引物和反向引物终浓度相同；
表3 STR引物终浓度
扩增体系如表4所示；
表4扩增体系
PCR扩增程序为：
95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，30个循环；60℃延伸30min；20℃保温。
以步骤(1)提取的DNA为模板，按照上述优化后的STR多重荧光检测体系，进行多重PCR扩增，得到PCR产物。
(4)多重PCR扩增产物的毛细管电泳检测
利用5色荧光Matrix(6-FAM、HEX、TAMRA、ROX，分子量内标为LIZ，无锡中德美联公司)对3130XL遗传分析仪进行光谱校正。取步骤(3)中获得的PCR产物1μL，加入到9.5μL缓冲液(9.34μL高纯甲酰胺+0.16μL GeneScan LIZ 500分子量内标)中混合均匀，在PCR仪上经95℃变性5min，4℃保存4min。变性后的PCR产物在ABI 3130xl遗传分析仪上进行基因分型。STR多重荧光检测体系对部分桉树无性系的检测结果如图1所示。
(5)桉树无性系的指纹图谱
用GeneMapper4.0软件进行不同无性系的特征谱带分析，构建桉树无性系STR指纹图谱(表4)，表4中，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。利用NTSYS-pc version2.1构建无性系间的聚类图(图2)。图2中桉树无性系Guangzhou1与LH1为同一无性系，其检测结果与实际一致。
表4桉树无性系STR指纹图谱
(6)未知桉树无性系的检测
利用上述方法，提取待检测桉树无性系的基因组DNA，进行多重荧光STR标记的PCR扩增，将扩增产物利用遗传分析仪进行基因分型，获得该无性系相应位点的扩增情况，若检测结果与上述桉树无性系STR指纹图谱中的碱基大小(bp)完全一致，即获得该未知桉树无性系的品系名称。同时也可以对多个未知桉树无性系进行上述检测，根据分型结果确认样本间的亲缘关系。
序列表
<110> 中国林业科学研究院热带林业研究所
<120> 用于鉴定桉树无性系的STR引物、PCR试剂盒及方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagcaacc gagttcaatg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcttccacc gccatttt 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcttcttcgc ctcgtcctcg ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agccattctt gcggatggtg cc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcttttctt gagcaatagg tc 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctcgaaacg acgaaccc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ataataatgc tggctttctg 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgcccatc ttcttcct 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggctagag cagttggg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatgagcagt ctcgtcca 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatcgccgaa tcggagca 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgcaattat cccccaacca 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcccgctgaa gtgtttgt 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtggtagga gggtttgg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtccaaaggc agaagatg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggaaagaa ggatacgg 18

Claims (9)

1.用于鉴定桉树无性系的STR引物组，其特征在于，包括以下8对引物：
EUCeSSR0475引物对：其正向引物如SEQ ID NO.1所示，其反向引物如SEQ ID NO.2所示；
EUCeSSR0204引物对：其正向引物如SEQ ID NO.3所示，其反向引物如SEQ ID NO.4所示；
EUCeSSR419引物对：其正向引物如SEQ ID NO.5所示，其反向引物如SEQ ID NO.6所示；
EUCeSSR1128引物对：其正向引物如SEQ ID NO.7所示，其反向引物如SEQ ID NO.8所示；
EUCeSSR298引物对：其正向引物如SEQ ID NO.9所示，其反向引物如SEQ ID NO.10所示；
EUCeSSR0176引物对：其正向引物如SEQ ID NO.11所示，其反向引物如SEQ ID NO.12所示；
EUCeSSR181引物对：其正向引物如SEQ ID NO.13所示，其反向引物如SEQ ID NO.14所示；
EUCeSSR304引物对：其正向引物如SEQ ID NO.15所示，其反向引物如SEQ ID NO.16所示。
2.用于鉴定桉树无性系的PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于鉴定桉树无性系的STR引物组。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征在于，包括2x Type-it Multiplex PCRMaster Mix 5μL，RNase-Free Water 1μL，Primers 2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA 2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。
4.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在正向引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR0176引物对、EUCeSSR181引物对、EUCeSSR304引物对标记的荧光物质依次分别是ROX、6-FAM、TAMRA、ROX、TAMRA、6-FAM、HEX、ROX。
5.权利要求1所述的用于鉴定桉树无性系的STR引物组或权利要求2所述的用于鉴定桉树无性系的PCR试剂盒在鉴定桉树无性系中的应用。
6.鉴定桉树无性系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.提取待测桉树无性系的DNA；
b.以步骤a提取的桉树无性系的DNA为模板，利用权利要求1所述的鉴定桉树无性系的STR引物组进行多重PCR扩增，得到PCR产物；
c.对PCR产物进行分型，与桉树无性系STR指纹图谱进行比对，确定待测桉树无性系的名称。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中的多重PCR扩增，其反应体系为：2x Type-it Multiplex PCR Master Mix 5μL，RNase-Free Water 1μL，Primers 2μL，30ng/μL待测桉树无性系的DNA 2μL；其中Primers包含的各引物对在反应体系中的终浓度为：EUCeSSR0475引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR0204引物对的正向、反向引物各为0.05μM，EUCeSSR419引物对的正向、反向引物各为0.15μM，EUCeSSR1128引物对的正向、反向引物各为0.33μM，EUCeSSR298引物对的正向、反向引物各为0.19μM，EUCeSSR0176引物对的正向、反向引物各为0.06μM，EUCeSSR181引物对的正向、反向引物各为0.17μM，EUCeSSR304引物对的正向、反向引物各为0.87μM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Primers包含的每个引物对中，至少有一条引物是经过荧光物质标记的，荧光物质加在引物的5'端，EUCeSSR0475引物对、EUCeSSR0204引物对、EUCeSSR419引物对、EUCeSSR1128引物对、EUCeSSR298引物对、EUCeSSR0176引物对、EUCeSSR181引物对、EUCeSSR304引物对标记的荧光物质依次分别是ROX、6-FAM、TAMRA、ROX、TAMRA、6-FAM、HEX、ROX。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中的多重PCR扩增，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火90s、72℃延伸30s，30个循环；60℃延伸30min；20℃保温。
CN201710761216.3A 2017-08-30 2017-08-30 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法 Expired - Fee Related CN107354222B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710761216.3A CN107354222B (zh) 2017-08-30 2017-08-30 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710761216.3A CN107354222B (zh) 2017-08-30 2017-08-30 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107354222A true CN107354222A (zh) 2017-11-17
CN107354222B CN107354222B (zh) 2020-10-30

Family

ID=60289690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710761216.3A Expired - Fee Related CN107354222B (zh) 2017-08-30 2017-08-30 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107354222B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706265A (zh) * 2019-03-11 2019-05-03 中国林业科学研究院热带林业研究所 一种snp组合及其在桉树无性系鉴定中的应用
CN110093436A (zh) * 2019-03-27 2019-08-06 中国林业科学研究院热带林业研究所 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009132860A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Biotype Ag Substances and methods for a dna based profiling assay
WO2014200348A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Keygene N.V. Directed strategies for improving phenotypic traits
JP5799600B2 (ja) * 2011-06-17 2015-10-28 王子ホールディングス株式会社 ユーカリ属の種間雑種の樹種識別法
CN106811513A (zh) * 2015-12-01 2017-06-09 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 桉树成分实时荧光pcr检测方法及其试剂盒
CN107385052A (zh) * 2017-08-08 2017-11-24 中国林业科学研究院热带林业研究所 用于鉴定桉树无性系的str引物及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009132860A1 (en) * 2008-04-28 2009-11-05 Biotype Ag Substances and methods for a dna based profiling assay
JP5799600B2 (ja) * 2011-06-17 2015-10-28 王子ホールディングス株式会社 ユーカリ属の種間雑種の樹種識別法
WO2014200348A1 (en) * 2013-06-14 2014-12-18 Keygene N.V. Directed strategies for improving phenotypic traits
CN106811513A (zh) * 2015-12-01 2017-06-09 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 桉树成分实时荧光pcr检测方法及其试剂盒
CN107385052A (zh) * 2017-08-08 2017-11-24 中国林业科学研究院热带林业研究所 用于鉴定桉树无性系的str引物及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTA FERNANDEZ ET AL: "Validation of reference genes for real-time qRT-PCR normalization during cold acclimation in Eucalyptus globulus", 《TREES》 *
周长品: "《万方数据知识服务平台》", 17 August 2015 *
李淑娴等: "桉树EST序列中微卫星含量及相关特征", 《植物学报》 *
郭鑫等: "桉树SSR-PCR体系优化及引物筛选应用", 《分子植物育种》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109706265A (zh) * 2019-03-11 2019-05-03 中国林业科学研究院热带林业研究所 一种snp组合及其在桉树无性系鉴定中的应用
CN109706265B (zh) * 2019-03-11 2022-04-01 中国林业科学研究院热带林业研究所 一种snp组合及其在桉树无性系鉴定中的应用
CN110093436A (zh) * 2019-03-27 2019-08-06 中国林业科学研究院热带林业研究所 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107354222B (zh) 2020-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106636393B (zh) 与南瓜皮色基因连锁的snp分子标记及其应用
Singh et al. Evaluation of microsatellite markers for genetic diversity analysis among sugarcane species and commercial hybrids
Perez‐Jiménez et al. Analysis of genetic diversity of southern Spain fig tree (Ficus carica L.) and reference materials as a tool for breeding and conservation
CN103966210B (zh) 桃ssap分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用
CN106755483A (zh) 一种鉴定嘎拉苹果后代植株的ssr分子标记ii及其应用
CN107502665B (zh) 基于毛细管电泳荧光ssr指纹图谱鉴别刺槐品种的方法
CN107354222A (zh) 用于鉴定桉树无性系的str引物、pcr试剂盒及方法
CN106480224A (zh) 快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用
CN107385052A (zh) 用于鉴定桉树无性系的str引物及其应用
CN108384879A (zh) 一种用于西瓜杂交品种纯度鉴定的ssr引物及方法
CN104894276B (zh) 一种快速鉴定茶树种质乌龙茶适制性的分子标记方法
CN104293774A (zh) 杨树CesAs基因内与木材品质性状显著关联的功能SSR标记、其应用及试剂盒
CN105821154A (zh) 一种用于丝瓜杂交种子纯度鉴定的ssr引物及其方法
CN109706262A (zh) 薄壳山核桃品种Davis的特征序列、标记引物及鉴定方法
Li et al. Establishment of molecular identity cards for Cucumis melo cultivars using ssr markers
CN104611329B (zh) 樱花品种“松月”和“郁金”的分子特异性标记引物
Chen et al. Genetic diversity of species of Chrysanthemum and related genera and groundcover cultivars assessed by amplified fragment length polymorphic markers
CN110093436B (zh) 用于鉴定桉树无性系的snp位点多色荧光检测引物、试剂盒、检测方法及其应用
CN105483281A (zh) 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法
CN104593367B (zh) 樱花品种红丰、市原虎尾和平野妹背的特异性标记引物
CN107130034A (zh) 一种利用ssr标记鉴定平欧杂种榛品种的方法
CN104560977B (zh) 樱花品种“平野妹背”的分子特异性标记引物及检测方法
CN103789304B (zh) 基于梨基因组开发的irap标记及其应用
CN108410967A (zh) 一种快速鉴定川山茶传统名品的方法
CN116200521B (zh) 一种鉴别红松无性系的ssr标记引物组及指纹图谱的构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20201030

Termination date: 20210830

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee