CN106701950A

CN106701950A - 豌豆耐寒相关ssr引物组合及其应用

Info

Publication number: CN106701950A
Application number: CN201611266919.0A
Authority: CN
Inventors: 宗绪晓; 刘荣; 杨涛; 方俐; 张红岩; 张晓艳; 郝俊杰
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-31
Filing date: 2016-12-31
Publication date: 2017-05-24
Anticipated expiration: 2036-12-31
Also published as: CN106701950B

Abstract

本发明提供了豌豆耐寒相关SSR引物组合及其应用，属于作物分子辅助育种技术领域。本发明提供35对与豌豆耐寒相关的SSR引物组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑70所示，利用PCR扩增技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对耐寒或不耐寒豌豆进行鉴定，可在短时间内完成豌豆耐寒特性鉴定工作，具有高效、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境和季节影响等优点。本发明的方法从DNA水平揭示耐寒或不耐寒豌豆品种的遗传变异与亲缘关系，为豌豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，可应用于农业领域中豌豆种质资源或品种的耐寒鉴定及分子辅助育种，具有良好的应用前景。

Description

豌豆耐寒相关SSR引物组合及其应用

技术领域

本发明涉及作物分子辅助育种技术领域，特别是涉及豌豆耐寒相关SSR引物组合，以及基于该SSR引物组合构建的耐寒或不耐寒豌豆指纹图谱以及鉴别耐寒豌豆的方法。

背景技术

豌豆(Pisum sativum L.)是我国主要的食用豆类之一，栽培历史悠久，营养丰富，粮、菜、饲兼用，同时由于其具有生物固氮作用，是种植业结构中重要的间套轮作作物，可提高土壤肥力，增加作物产量。豌豆适应性强，地理分布广，在全世界超过90个国家广泛种植，作为世界第四大食用豆类作物，其栽培面积和产量仅次于大豆、菜豆和鹰嘴豆。统计数据表明，中国无论是干豌豆还是青豌豆，在栽培面积和总产量方面均跻身全球前列，奠定了中国豌豆生产大国的重要地位。豌豆富含优质蛋白质和多种营养元素，可提高人体免疫力，在改善我国居民膳食结构中同样发挥着重要作用。

根据播种季节，豌豆可分为春播区和秋播区，其中秋播豌豆在我国豌豆生产中占据主导地位。但是对于秋播豌豆来说，生产上面临的一个显著问题是，冬季的严寒可能会导致幼苗死亡，进而需要重新播种甚至遭受产量损失。因此，筛选耐寒豌豆种质资源和品种对于我国豌豆的稳定生产具有重要意义。目前对豌豆品种进行耐寒鉴定的主要方法是进行田间越冬能力的表型鉴定。该方法虽然比较简便、直观，但费时费工，易受生长季节和环境影响，且存在主观偏差，不能精确、快捷地为豌豆品种的耐寒鉴定提供科学依据。

随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性的分子标记技术逐渐成为生物基因分型、遗传多样性分析、品种鉴定以及分子辅助育种的重要工具。在作物遗传分析中常用的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等。其中，SSR标记因其在基因组中散在分布，具有多态性丰富，操作便利，共显性且高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物种质资源研究和分子辅助育种实践中。虽然目前针对豌豆开发的SSR标记有很多，但这些标记具有随机性，无法对豌豆耐寒品种进行有效鉴定。

发明内容

本发明的目的在于：针对当前鉴定豌豆品种耐寒特性只能在大田里进行，表型鉴定周期长、工作量大且繁琐、易受生长季节和环境影响以及存在主观偏差等一系列问题，提供与豌豆耐寒相关SSR引物组并利用这些引物对豌豆品种进行耐寒鉴定。

为实现上述目的，本发明经过3年3地的大田耐寒表型鉴定，筛选出13份耐寒资源和17份不耐寒资源，并通过豌豆全基因组关联分析，筛选得到与豌豆耐寒显著相关的35对SSR引物。以这30份代表性豌豆种质资源基因组DNA为模板，利用上述35对耐寒相关SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别耐寒豌豆。所述的30份代表性参试豌豆材料见表1。

表1 30份代表性豌豆种质资源

经过严格筛选，选择与豌豆耐寒性状显著相关、PCR扩增稳定，同时满足常规非变性凝胶电泳检测技术平台，最终筛选出在豌豆耐寒和不耐寒资源间差异显著、资源内部遗传一致性高、重复性好、扩增带型清晰度高的SSR引物作为与豌豆耐寒相关的SSR引物组合。

基于上述筛选方法，本发明提供用于鉴别耐寒豌豆的分子标记组合，其为SSR分子标记，分别为16512、16570、17713、18339、18928、22276、22352、23358、24236、24560、24588、24602、24652、25059、25387、27301、27361、27491、27583、28108、28374、28654、28687、28790、29331、29955、30379、CAASESP527、CAASESP625、CAASESP723、CAASESP921、CAASESP956、CAASESP968、CAASESP1109、CAASESP1276；

上述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ IDNO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQID NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ ID NO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60、SEQ ID NO.61-62、SEQ ID NO.63-64、SEQ ID NO.65-66、SEQ ID NO.67-68、SEQ ID NO.69-70所示的引物。

本发明提供了豌豆耐寒相关SSR引物组合，含有以下35对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-70所示。

本发明提供了含有上述分子标记组合或含有上述SSR引物组合的试剂盒。

本发明提供了上述分子标记组合或SSR引物组合或含有该SSR引物组合的试剂盒在鉴定耐寒豌豆种质资源中的应用。

本发明提供了上述分子标记组合或SSR引物组合或含有该SSR引物组合的试剂盒在豌豆辅助育种中的应用。

本发明提供了上述分子标记组合或SSR引物组合或含有该SSR引物组合的试剂盒在豌豆种质资源改良中的应用。

本发明提供一种耐寒或不耐寒豌豆种质资源SSR指纹图谱的构建方法，以本发明的提供的SSR引物组合对耐寒或不耐寒豌豆材料的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，

纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为代表该位点等位变异大小的数字编码；

杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；

无效等位变异的大小记录为0/0；

通过对不同位点的数据整合，形成耐寒或不耐寒豌豆种质资源的SSR指纹图谱。

上述构建方法中，PCR扩增方法为：反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

上述构建方法构建得到的耐寒或不耐寒豌豆种质资源指纹图谱属于本发明的保护范围。

本发明构建得到的耐寒或不耐寒豌豆指纹图谱，如表5-表16所示。

本发明进而提供一种鉴定耐寒豌豆品种的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检豌豆样品的DNA，以本发明提供的SSR引物组合中的35对引物对分别对待检豌豆样品的DNA进行PCR扩增；

(2)扩增产物通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染显色，根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置；

无效等位变异的大小记录为0/0；

(3)结果对照表5-表16耐寒、不耐寒豌豆指纹图谱，利用PowerMarker V3.25软件的UPGMA聚类分析比对待测样本和对照样本的DNA指纹图谱库，若待测样本与所述对照样本中的耐寒资源聚为一类，则待测样本为或候选为耐寒品种；若待测样本与所述对照样本中的不耐寒资源聚为一类，则待测样本不为或候选不为耐寒品种。

本发明提供了上述方法在豌豆种质资源耐寒鉴定及品种改良中的应用。

本发明提供了上述方法在豌豆辅助育种中的应用。

本发明是基于豌豆全基因组关联分析开发的耐寒相关SSR引物组，利用了SSR引物组合对耐寒和不耐寒豌豆品种DNA进行扩增，可以进行有效的PCR扩增并得到清晰的扩增产物，得到各自对应的一组特有的DNA指纹图谱，本发明方法采用引物组合鉴别的方法对豌豆耐寒品种进行分析和筛选，使每一个品种都找到了它特有的DNA指纹。本发明的检测方法在短时间内即可完成耐寒豌豆鉴定，具有高效、准确、低成本、操作简便等优势，为豌豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，可应用于农业领域中豌豆种质资源或品种的耐寒鉴定及分子辅助育种，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为依据35对耐寒相关SSR引物绘制的30份豌豆资源耐寒鉴定聚类图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1豌豆耐寒性状相关SSR引物的筛选

本实施例选择30份代表性豌豆种质资源，经过3年3地的大田耐寒表型鉴定，包括13份耐寒资源和17份不耐寒资源(见表1)。

根据豌豆全基因组关联分析结果，选择与豌豆耐寒性状显著相关，在豌豆耐寒和不耐寒资源间差异显著、资源内部遗传一致性高、重复性好，同时满足PCR扩增稳定、扩增产物电泳检测条带清晰的35对SSR引物作为豌豆种质资源耐寒鉴定的引物组(见表2)。

表2 35对耐寒相关SSR引物

上述表2的引物分别对应序列表中的SEQ ID NO.1-70。

实施例2耐寒豌豆特征指纹图谱的构建与耐寒豌豆鉴定方法的建立

1、豌豆总DNA提取

采用改良的CTAB法提取供试资源DNA：取2g左右的新鲜幼嫩叶片，在液氮中充分研磨成粉末状装入2.0ml离心管中，冷冻保存备用；将预热到65℃的2×CTAB提取液，按占溶液容量1％的比例加入β-巯基乙醇，充分混匀；每份样品中加入800μL预热后的CTAB提取液，涡旋振荡1-2min，65℃水浴1h(每15min上下颠倒混匀一次)；水浴加热结束后，在离心管中加入800μL氯仿/异戊醇(24：1)溶液，混合15-20min，之后用高速离心机在10000rpm条件下离心15min；吸取600μL左右上清液至新的离心管(适量吸取，不能接触中间的蛋白质层)，后加入95％等体积乙醇，摇匀后于-20℃冰箱放置2h或者4℃冰箱过夜，保证充分沉淀；然后用离心机在12 000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，保留沉淀；用500μL 90％乙醇漂洗白色沉淀，10 000rpm离心5min，小心倒掉上清；室温风干，加入100μL ddH₂O，将沉淀充分溶解。利用Nanodrop2000/2000C仪器检测样品的DNA浓度，将样品DNA的浓度统一稀释到50ng/μL，4℃保存备用。

2、以实施例1所述30份豌豆参试材料(见表1)，利用实施例1筛选得到的用于扩增35对与豌豆耐寒相关的SSR分子标记的引物分别对实施例1所述的30份豌豆种质资源基因组DNA进行PCR扩增，反应程序为：

PCR扩增采用20μL的反应体积，扩增体系为：2×Taq PCR MasterMix 9μL，正向和反向引物(2μM/μL)各2μL，模板DNA(20-30ng/μL)3μL，双蒸水(ddH₂O)6μL。

反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

3、PCR扩增产物凝胶电泳及银染显色：扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，200V稳压电泳2-2.5h，至加样缓冲液移到凝胶底部时电泳结束。银染显色，照相记录。

(1)玻璃板清洗用清水和洗涤剂将平、凹玻璃板充分清洗干净，然后用蒸馏水冲洗，置于玻璃板架晾干；为防止灌胶时有气泡产生，灌胶前用酒精擦洗玻璃板，晾干备用；将组装好的玻璃板水平放齐，用夹子固定。

(2)灌胶在45ml 8％PAGE胶中加入TEMED 45μL和10％过硫酸铵450μL TEMED(注：TEMED和过硫酸铵的使用量应依据环境温度做出相应调整)，迅速混匀后灌胶。待胶液充满玻璃板夹层时，在上部轻轻插入梳子，使其聚合25min左右(注：具体聚合时间应随不同环境温度做出相应调整)。在灌胶过程中，应防止气泡的产生。

(3)电泳首先在20μL PCR扩增产物中加入4μL 6×Loading buffer，混匀30s待用。用移液器吹吸加样槽，清除杂质和气泡。每加样孔点入1.5μL产物，在电压300V，电流280mA，功率260W条件下，电泳1-1.5小时(电泳时间长短可根据目标片段大小和实际功率适度调节)。待上部的指示带(二甲苯青)到达胶板底部，电泳结束，小心剥离聚丙烯酰胺凝胶，待染色。

(4)银染漂洗：使用蒸馏水快速漂洗聚丙烯酰胺凝胶1次，时间不超过10s。银染：按以下银染液配比对凝胶进行染色，然后平行震荡染色10min。

表3

清洗：染色10min后，将染色液倒入废液桶，继续用蒸馏水漂洗2次，每次不超过15s。显色：按以下显色液配比，加入适当的显色液于塑料盒中，轻轻混匀后置于平行震荡仪，使凝胶与显色液充分作用，直至条带清晰。

表4

洗涤：将显影液倒掉并用蒸馏水清洗2-3次，每次不超过15s。

保存：清洗干净后，将凝胶平铺在玻璃板上，用保鲜膜将其密封，读出条带结果并统计记录，然后照相留存。

结果记录：以DNA MarkerI为DNA分子量标准，根据等位变异大小进行数字编码，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为代表该位点等位变异的大小的数字编码；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异；无效等位变异的大小记录为0/0。构建的30份豌豆材料的指纹图谱见表5-表16。

表5

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18339

18928

22276

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表6

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表7

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18928

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表10

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表12

表13

16512

16570

17713

18339

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表16

上表中左侧第一列的编号1-30，分别指代30份豌豆种质资源，其中1-13为耐寒豌豆种质资源，14-30为不耐寒豌豆种质资源。利用35对耐寒相关SSR引物组对30份豌豆代表性种质资源进行PCR扩增、电泳检测，统计每份资源的扩增情况和基因型信息，构建豌豆代表性耐寒和不耐寒资源的指纹图谱库，利用PowerMarker V3.25软件的UPGMA聚类分析比对待测样本和对照样本的DNA指纹图谱库，若待测样本与所述对照样本中的耐寒资源聚为一类，则待测样本为或候选为耐寒品种；若待测样本与所述对照样本中的不耐寒资源聚为一类，则待测样本不为或候选不为耐寒品种。图1中聚类分析结果显示，13份耐寒资源和17份不耐寒资源分别处于不同分支上，能够完全分开，说明这些基于全基因组关联分析开发的耐寒相关引物组可应用于农业领域中豌豆种质资源或品种的耐寒鉴定及分子辅助育种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 豌豆耐寒相关SSR引物组合及其应用

<130> KHP161119273.4Q

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taagcccgac gcttctattc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgcctcagt ttccgtttgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caaacaccaa ccaccacagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaggggagac gaagtggagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaaagggga aagcaggaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgactgtga ggctggtttg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tggttgaact ggaacgagtg 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgaaattgca atgtaagcat ga 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgaatgtgga aaggaggaat g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agggtcacca ctttggagag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgcggcatt ttgctttatc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttggtctgca aatcgaaaca 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccaacatctt cctcatcacc t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgagagtcgc agtcggataa 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccaatctcaa gatccatcac c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcggaagctt atcggagaaa 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

caaaccttct ttatttccat ttca 24

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acttctggtc cacgcaaaac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gataaaggca gcgacagagg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aatgaagtgc aagcccaaat 20

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

aaatagatga gaaagagaga gattacg 27

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgcacttcca ttcacatgat 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgagtgggcg tgtgatttag 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttgcactgtc gcatttgagt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gagaaagcgg ctgcttagaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gctgtcaccg agaatgatga 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atggattgcg gatagctcaa 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cagcagttgt tcgcaggtaa 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ggctcatgca tctaccacct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atcccgacgt tcacattttc 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tgtcggaaat taagaggtgg a 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tggaaaagta agcggtgaac a 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ctgaaacggt ttgcattgtg 20

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tccaaccact tcttaacaac ct 22

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

tcctaaccaa ccaataacac gat 23

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttgaggattt cggtgacctc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgcacagagg atggttctca 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tggattgagc ctcttgtcct 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cgacaatgtt gccagctatc 20

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ttttaggatt ttatcgacgt ttttc 25

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tccacggtct tgctatgtgt 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ctggttgcac atcagggtag 20

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

agcgacgtga atatcacaat g 21

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

gttatcgcgg cgtgtaaatc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cacggaaggc cctacttaca 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gtggcgagta gagcgtaagg 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gctgtggggg tttaatcaga 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

ccgcaatcct tcaagaactc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gggtggaccg aatatttcaa 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

cgtcacctct accgaagctc 20

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tcaagtgcat tgggagagac t 21

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

aaaaaccgac ccataatcaa ttt 23

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tgttggcagg aaactcttca 20

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

agccacaaat ttcgttgtgt t 21

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ttgaagcagt ggcagagttg 20

<210> 56

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

tctcaatgaa acataagaat gacctt 26

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gctccaatgg cttcctaaca 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

aacaaggggc aatcacaatc 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gggggtgtct tacgttgatg 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

ccccaaaacc agctgaacta 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

aaggggtgat caagcatcaa 20

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ttgagggaac atgaagaaat ca 22

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

cgagcgtgag actgtgatgt 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tccaccggtt caacttcaat 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

accgcttgaa ctccaaacaa 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

gaaggtaaca acgccgagaa 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

tccggcaaga tattggaaaa 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gcttggatcg caggaaaata 20

<210> 69

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tgaaacaata gtgctttgtt gaaact 26

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ttttctcgtc tgcgtgtgac 20

Claims

1.一种用于鉴别耐寒豌豆的分子标记组合，其特征在于，其为SSR分子标记，分别为16512、16570、17713、18339、18928、22276、22352、23358、24236、24560、24588、24602、24652、25059、25387、27301、27361、27491、27583、28108、28374、28654、28687、28790、29331、29955、30379、CAASESP527、CAASESP625、CAASESP723、CAASESP921、CAASESP956、CAASESP968、CAASESP1109、CAASESP1276；

上述分子标记分别通过以下引物对扩增得到：SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4、SEQ IDNO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.13-14、SEQ IDNO.15-16、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.23-24、SEQID NO.25-26、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-44、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.47-48、SEQ ID NO.49-50、SEQ ID NO.51-52、SEQ IDNO.53-54、SEQ ID NO.55-56、SEQ ID NO.57-58、SEQ ID NO.59-60、SEQ ID NO.61-62、SEQID NO.63-64、SEQ ID NO.65-66、SEQ ID NO.67-68、SEQ ID NO.69-70所示的引物。

2.一种与豌豆耐寒相关的SSR引物组合，其特征在于，含有以下35对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-70所示。

3.含有权利要求1所述分子标记组合或权利要求2所述SSR引物组合的试剂盒。

4.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的SSR引物组合或权利要求3所述的试剂盒在鉴定耐寒豌豆种质资源中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记组合或权利要求2所述的SSR引物组合或权利要求3所述的试剂盒在豌豆辅助育种中的应用。

6.一种耐寒或不耐寒豌豆种质资源SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，以权利要求2所述的SSR引物组合对耐寒或不耐寒豌豆材料的DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，

无效等位变异的大小记录为0/0；

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增方法为：反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

8.权利要求6或7所述的构建方法构建得到的耐寒或不耐寒豌豆种质资源指纹图谱。

9.如权利要求8所述的耐寒或不耐寒豌豆种质资源指纹图谱，其为30种豌豆种质资源的指纹图谱，分别如下：

和

上述左侧第一列的编号分别为1-30，分别指代30份豌豆种质资源，其中1-13为耐寒豌豆种质资源，14-30为不耐寒豌豆种质资源。

10.一种鉴定耐寒豌豆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检豌豆样品的DNA，以权利要求2所述的引物组合中的35对引物对分别对待检豌豆样品的DNA进行PCR扩增；

纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为为代表该位点等位变异大小的数字编码；

无效等位变异的大小记录为0/0；

(3)结果对照权利要求8或9的豌豆品种指纹图谱，利用聚类分析比对待测样本和对照样本的DNA指纹图谱库，若待测样本与所述对照样本中的耐寒资源聚为一类，则待测样本为或候选为耐寒品种；若待测样本与所述对照样本中的不耐寒资源聚为一类，则待测样本不为或候选不为耐寒品种。