CN114574626A

CN114574626A - 一套基于SnaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记及应用

Info

Publication number: CN114574626A
Application number: CN202210439663.8A
Authority: CN
Inventors: 王栋; 杨涛; 丁汉凤; 宗绪晓; 李娜娜; 刘荣; 田茜
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-25
Filing date: 2022-04-25
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2042-04-25
Also published as: CN114574626B; WO2023207234A1

Abstract

本发明公开了一套基于SnaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记及应用。本发明采用分期播种的方式，对2358份来自世界各地的豌豆种质进行耐热筛选实验，通过产量相关性状鉴定，制定出合理的豌豆耐热分级标准，获得了包含耐热和热敏感种质的豌豆种质群体，并通过一套利用SNaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记(20个标记)，对其进行遗传多样性和群体遗传结构分析，为将来的豌豆耐热遗传机理及耐热育种研究提供了理论和现实依据。

Description

一套基于SnaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记及应用

技术领域

本发明涉及一套基于SnaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记及应用，属于植物遗传学技术领域。

背景技术

未来全球变暖趋势日加明显，截止到2018年，全球气温相较于工业化之前上升了1.5℃，并且预计到本世纪末，地表平均温度将上升1.5-2.0℃。热胁迫是导致植物产量损失的主要非生物胁迫之一。从1℃到5℃范围内，气温每升高1℃产量损失10％，甚至在高粱等耐热植物中也会发生。包括豌豆、鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)和小扁豆(Lens culinarisMedikus)等在内的冷季食用豆类，会因各种环境胁迫而遭受产量损失，特别是在开花和种子发育时热胁迫对其影响尤为严重。

中国是豌豆生产大国和消费大国，豌豆作为一种冷季作物，对田间高温特别敏感，高温可使其花、果实和种子败育以及种子大小减小。在高温条件下，耐热品种表现为单株产生更多的生殖节，单株损失较少的荚，单荚损失较少的种子，而热敏感品种表现相反。因此，单株种子产量是衡量豌豆是否耐热的重要指标。通过筛选得到耐热品种是未来豌豆遗传改良的重要基因来源。

了解各份豌豆种质之间的遗传多样性和群体遗传关系对于豌豆遗传改良研究和在育种中选择合适的亲本至关重要。前人利用多种标记对豌豆种质进行遗传多样性评估，其中简单重复序列标记(Simple Sequence Repeats，SSRs)因其具有丰富的多态性、高稳定性和低成本，应用面甚广。单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphysms，SNPs)是继酶切片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLPs)和简单重复序列标记(SSRs)之后的第三代分子标记。SNPs具有二等位基因性、数量丰富、分布广泛、突变率低、可以实现自动化高通量检测等优点。

SNPs分型可借助多种检测手段，如结合PCR技术的单链构象多态性标记(PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)，等位基因特异性PCR标记(Allele-specific PCR，AS-PCR)和酶切扩增多态性序列标记(Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequence，CAPS)，以及可实现中、高通量SNP分型的下一代测序(Nextgeneration sequencing，NGS)、竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR，KASP)和微测序技术(Minisequencing)等。SNaPshot技术是一种SNPs多重分析技术，可实现中通量的SNPs分型，具有灵敏度高，重复性好，无需额外设备等特点，已广泛应用于法医学鉴定和人类基因的SNP检测等研究领域，在植物遗传学研究领域如SNP分型及标记开发、分子标记辅助育种和遗传多样性分析等都有报道。到目前为止，SNP标记在豌豆遗传多样性评价和群体遗传结构研究方面应用不多，仅有零星报道，而利用SNaPshot技术对豌豆进行遗传学方面的研究鲜有报道。

目前，中国国家作物种质库中保存了来自40多个国家和地区收集的3837份豌豆种质，其表型性状鉴定数据很不完善，仅对部分性状进行了初步鉴定，如耐冷性鉴定，但从未对其进行大规模的耐热筛选鉴定。宗绪晓等利用SSR标记评价了2017份来自中国国家作物种质库的世界各地豌豆种质的遗传多样性和群体遗传结构，但从没有对经过热胁迫处理的豌豆种质进行过遗传多样性和群体结构分析。

发明内容

针对上述问题，本发明采用分期播种的方式，对贮存在中国农业科学院作物科学研究所国家作物基因库的2358份来自世界各地的豌豆种质进行耐热筛选实验，通过产量相关性状鉴定，制定出合理的豌豆耐热分级标准，获得了包含耐热和热敏感种质的豌豆种质群体，并通过一套利用SNaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记(20个标记)，对其进行遗传多样性和群体遗传结构分析，为将来的豌豆耐热遗传机理及耐热育种研究提供了理论和现实依据。

本发明的技术方案是：一种对豌豆种质进行耐热筛选的方法，其特征是，

将待筛选的豌豆种质分三个播期播种：(1)正常播种(NS)；(2)晚播一期(LS1)播种(比正常播期晚15天)；(3)晚播二期(LS2)播种(比正常播期晚30天)；

利用以下公示计算每份种质的晚播一期和晚播二期的平均单株产量损失率(LR1)和(LR2)：

LR1(％)＝[1-(P_LS1/P_NS)]×100％

LR2(％)＝[1-(P_LS2/P_NS)]×100％

根据以下的豌豆种质耐热分级标准进行分级：

1级：0<LR1≤20％and 0<LR2≤20％；

2级：(0<LR1≤20％and 20％<LR2≤40％)or(20％<LR1≤40％and 0<LR2≤20％)；

3级：20％<LR1≤40％and 20％<LR2≤40％；

4级：(20％<LR1≤40％and 40％<LR2≤60％)or(40％<LR1≤60％and 20％<LR2≤40％)；

5级：40％<LR1≤60％and 40％<LR2≤60％；

6级：(40％<LR1≤60％and 60％<LR2≤80％)or(60％<LR1≤80％and 40％<LR2≤60％)；

7级：60％<LR1≤80％and 60％<LR2≤80％；

8级：(60％<LR1≤80％and 80％<LR2≤100％)or(80％<LR1≤100％and 60％<LR2≤80％)；

9级：80％<LR1≤100％and 80％<LR2≤100％。

本发明还公开了一套基于SNaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记，其特征是，包括如表3所示的20个SNP标记。

本发明还提供了如表4所示的20个SNP标记的外围扩增引物序列和单碱基延伸引物序列。

本发明还提供了上述的豌豆耐热相关SNP标记在耐热和热敏感豌豆种质的遗传多样性和和群体遗传结构分析中的应用。

本发明还提供了上述的豌豆耐热相关SNP标记在豌豆耐热遗传机理和耐热育种研究中的应用。

本发明还提供了采用了上述的豌豆耐热相关SNP标记进行遗传多样性和和群体遗传结构分析的方法，其特征是，

1)SNaPshot PCR反应

首先通过上述步骤进行耐热筛选，建立包含耐热和热敏感豌豆种质的遗传群体；

然后以待测豌豆种质群体的DNA作为PCR模板，进行外围扩增，每个位点进行单一扩增，PCR产物纯化后再采用单碱基延伸引物进行SNaPshot PCR，SNaPshot PCR反应产物通过ABI 3730XL DNA分析仪进行毛细管电泳检测；

2)遗传多样性分析

利用Gene mapper 4.1进行SNP位点数据分析，每个样品按照SNP位点对应峰值进行基因分型，所得分析结果为Excel格式文件和PDF格式峰图，利用PowerMarker 3.25计算两组SNP标记的遗传多样性参数，包括基因型数(NG)、主要等位基因频率(MAF)、等位基因数(NA)、基因多样性(GD)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)等；

3)群体遗传结构分析

首先，利用Structure 2.3.4计算豌豆种质的遗传组成，并确定其最佳的遗传亚群分组数；其次，利用主坐标分析(PCoA)对Structure分析结果加以验证；最后，利用UPGMA聚类分析构建系统发育树，直观地展示分析结果。在本发明中，将筛选后的豌豆种质分成了两个遗传亚群A和B。

本发明的技术效果是：本发明首次制定了豌豆种质耐热分级标准，并将SNaPshot方法引入到豌豆种质的鉴定评价中，开发了一套基于SNaPshot技术的豌豆耐热相关SNP标记(20个标记)，可以对耐热和热敏感豌豆种质进行遗传多样性和和群体遗传结构分析，从而为将来的豌豆耐热遗传机理和耐热育种研究提供了理论和现实依据。

附图说明

图1为豌豆种质耐热性筛选期间的温度变化；

图2为豌豆种质耐热性筛选期间，不同播期生育期日温度变化和高温胁迫天数的比较；其中，A图：日均最高气温、日均最低气温和平均气温的温度变化，B图：豌豆生育期高温胁迫天数。“*”为在0.05水平上显著性；“**”为在0.01水平上显著性；

图3为豌豆种质正常播期的田间出苗率和不同播期田间存活率的分布；A图：豌豆种质正常播期的田间出苗率分布；B图：豌豆种质不同播期田间存活率的分布；

图4为耐热筛选后不同播期豌豆种质的平均单株产量分布和各分级种质数量：A图：不同播期每份豌豆种质的平均单株产量分布；B图：耐热筛选后豌豆种质各分级种质数量；

图5为豌豆种质耐热相关SNaPshot标记Structure分析中的ΔK；

图6为耐热筛选后的432份豌豆种质的耐热相关SNaPshot标记的群体遗传结构；A：20个耐热相关SNaPshot标记的Structure分析；B图：20个耐热相关SNaPshot标记的PCoA；C图：基于Nei的遗传距离和20个耐热相关SNaPshot标记的UPGMA系统发育树；

图7为耐热筛选后的432份豌豆种质的群体遗传组成；基于20个耐热相关SNaPshot标记的(A图)热敏感豌豆种质(n＝175)和(B图)耐热豌豆种质(n＝257)的遗传组成。

具体实施方式

实施例1

1材料与方法

1.1植物材料

选取来自中国农业科学院作物科学研究所国家作物基因库(中国北京)的2358份豌豆种质为试验材料，其中1973(83.67％)份来自中国的29个省市自治区，337(14.29％)份来自中国以外的25个国家和组织，剩余48(2.04％)份来源地不明，归为“未知”类。所有豌豆种质按播期类型分为两类，1324(56.15％)份为春播类型，1034(43.85％)份为冬播类型(表1)。

表1 2358份豌豆种质的来源和播期类型

1.2耐热筛选试验设计

本研究于2017年在中国山东省东营市农高区试验农场(北纬37.258614°，东经118.632774°，海拔14米)进行。2358份种质分三个播期播种：(1)3月1日进行正常播种(NS)；(2)3月16日进行晚播一期(LS1)播种；(3)3月31日进行晚播二期(LS2)播种，后两期晚播目的在于生殖生长阶段施加热胁迫。每个播期每份豌豆种质播种10粒，行距0.5m，株距0.1m。播种前进行灌溉，造墒以满足出苗。在出苗期和开花期喷施1.8％EC(5000×)阿维菌素防治豌豆潜叶蝇，用手工清除杂草。每个播期的2358份豌豆种质均采用完全随机排列人工播种。记录NS中每份豌豆种质的田间出苗数以及NS、LS1和LS2中每份豌豆种质成熟期的存活株数。

2.3耐热筛选期间的气象数据

试验所在地点东营，位于华北平原东北部，温带大陆性季风气候，四季分明，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥。试验期间的所有气象数据均从山东气象局网站(http://sd.cma.gov.cn/)下载。2017年属正常年份，中国山东省东营2017年3月至6月日均气温高于22℃的天数为45天，这是区分耐热和热敏感种质的理想条件。

耐热筛选期间记录了2017年3月1日至6月30日的气温变化数据(图1)。根据Awasthi等对热单位的定义：热单位是指在某一特定阶段开始或完成之前所有前几天的平均温度总和。这个指标可以直观的反应出受到高温胁迫的程度。耐热筛选各个播期的营养生长时期和生殖生长时期的每日最高气温、最低气温和平均气温变化范围及热单位积累见表2，可以发现延迟播种后的气温和热单位积累明显高于正常播种。

表2不同播期耐热性筛选气象指标的比较

2.4耐热筛选分级标准

选取正常播期每份种质中的5个成熟植株(成株数少于5株的不做统计)，称取每个植株的单株产量，并计算其平均单株产量(P_NS)。选取晚播一期和晚播二期中相对应的种质材料(0～5株)，并计算晚播一期和晚播二期的平均单株产量(P_LS1和P_LS2)。利用以下公示计算每份种质的晚播一期和晚播二期的平均单株产量损失率(LR1)和(LR2)：

LR1(％)＝[1-(P_LS1/P_NS)]×100％

LR2(％)＝[1-(P_LS2/P_NS)]×100％

豌豆种质耐热分级标准如下：

1级：0<LR1≤20％and 0<LR2≤20％

2级：(0<LR1≤20％and 20％<LR2≤40％)or(20％<LR1≤40％and 0<LR2≤20％)

3级：20％<LR1≤40％and 20％<LR2≤40％

4级：(20％<LR1≤40％and 40％<LR2≤60％)or(40％<LR1≤60％and 20％<LR2≤40％)

5级：40％<LR1≤60％and 40％<LR2≤60％

6级：(40％<LR1≤60％and 60％<LR2≤80％)or(60％<LR1≤80％and 40％<LR2≤60％)

7级：60％<LR1≤80％and 60％<LR2≤80％

8级：(60％<LR1≤80％and 80％<LR2≤100％)or(80％<LR1≤100％and 60％<LR2≤80％)

9级：80％<LR1≤100％and 80％<LR2≤100％

注：若LR1与LR2之间的差值高于40％，不将其列入耐热分级。

如上所述，按照平均单株产量损失率的数值大小，可将部分豌豆种质的耐热性划分为9等级，其中1至3级划分为耐热(heat-tolerant，HT)，7至9级划分为热敏感(heat-sensitive，HS)。

2.5 SNaPshot分析

基因组DNA来自耐热筛选后的432份豌豆种质(耐热及热敏感种质总计432份)，每份材料在4周时采集3株的幼嫩叶片，使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(北京擎科生物科技有限公司)混合提取。

外围引物设计遵循以下原则：引物长度在15-30bp，其有效长度一般不大于38bp。GC含量应在40％-60％，最适Tm值在58-60℃。引物自身不能含有自身互补序列。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，尤其应避免3’端的互补重叠。

单碱基延伸引物设计原则：引物长度在15-30bp，GC含量在40％-60％，最适Tm值在58-60℃。在引物的5'末端加上不同长度的PolyC或PolyT，使各条引物以长度区分。加尾后的引物最短设计为36bp，相邻两个SNP位点引物的长度一般相差4-6个核苷酸。

利用Tayeh等开发GenoPea 13.2K SNP芯片，从中选出20个与热激蛋白或热激转录因子相关的SNP位点。针对每个SNP位点序列，利用Premier 5设计一对外围扩增引物和一条单碱基延伸引物。SNP位点及SNaPshot引物信息详见表3、表4。

表3 SNP位点信息

表4 SNaPshot引物信息

提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板，以1.1×T3 Super PCR Mix(北京擎科生物科技有限公司)进行外围扩增，每个位点进行单一扩增，每对引物均按以下扩增体系和程序进行扩增。扩增体系共35μl：其中1.1×T3 Super PCR Mix，30μl；10μM Primer F，2μl；10μM Primer R，2μl；Template(gDNA)，1μl。扩增程序：98℃3min；98℃10s，57℃10s，72℃15s，35cycles；72℃2min；4℃保存。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝)，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图，通过胶图确定目的条带大小。PCR产物利用MagS磁珠凝胶回收试剂盒(北京擎科生物科技有限公司)进行纯化。

纯化好的单一PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10μM，进行SNaPshot PCR，PCR体系共5μl：ABI SnapShot multiplex Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，2μl；Primers，1μl；纯化后PCR Template，1μl；ddH₂O，1μl。扩增程序：96℃2min；96℃10s，50℃5s，60℃30s，30cycles；60℃30s；4℃保存。SNaPshot PCR反应产物通过ABI 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems,Foster City,USA)进行毛细管电泳检测。

2.6数据分析

利用Excel计算NS中每份豌豆种质的田间出苗率，公式为：田间出苗率(％)＝田间出苗数/10×100％。利用Excel计算不同播期每份豌豆种质的田间存活率，公式为：田间存活率(％)＝成熟期存活株数/10×100％。

利用Gene mapper 4.1进行SNP位点数据分析，每个样品按照SNP位点对应峰值进行基因分型，所得分析结果为Excel格式文件和PDF格式峰图。利用PowerMarker 3.25计算两组SNP标记的遗传多样性参数，包括基因型数(NG)、主要等位基因频率(MAF)、等位基因数(NA)、基因多样性(GD)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)等。

利用不同的群体遗传结构分析方法，对三个耐热筛选后豌豆群体进行了耐热SNP标记的遗传结构分析。首先，利用Structure 2.3.4进行贝叶斯聚类分析。参数设定如下：Length of Burnin Period＝10000，Number of MCMC Reps after Burnin＝100000，群体数量K(Number of population)＝1-10，循环数(Number of Iterations)＝10。根据Evanno等提出的算法，根据Delta K(ΔK)值确定最佳群体结构和群体数量(在线分析网址为http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/)。其次，利用GenAlEx 6.5进行主坐标分析(PCoA)，以检查耐热筛选后豌豆的群体遗传分析是否合理。最后，利用PowerMarker3.25对三个耐热筛选后豌豆群体进行基于UPGMA(unweighted pair-group method)法的系统发育树构建，并用Figtree 1.4.3(https://github.com/rambaut/figtree/releases/tag/v1.4.3)加以展示。此外，均值差异显著性检验和Kolmogorov-Smirnov检验通过SPSS20.0完成。

3.结果

3.1耐热筛选期间的高温胁迫

耐热筛选期间，不同播期豌豆生育期内的日均最高气温、日均最低气温和平均气温均呈现递增趋势(图2A)，且晚播一期(LS1)和晚播二期(LS2)的以上指标显著或极显著的高于正常播期(NS)。豌豆在营养生长时日均温度以12–16℃为宜，开花期时以16–20℃为宜，结荚期时以16–22℃为宜，高于26℃时代谢活动趋于停止。耐热筛选期间豌豆生育期内的日均气温高于16℃、20℃、22℃和26℃的天数如图2B所示，三个播期(NS、LS1和LS2)的生育期天数呈递减趋势，而高于以上节点温度的天数呈递增趋势。以上结果表明，LS1和LS2的高温胁迫效果显著，符合豌豆种质耐热筛选要求。

3.2正常播期豌豆种质的田间出苗率

2358份豌豆种质正常播期的田间出苗率分布如图3A所示，平均值为73.6％，变化范围为0～100％。其中，1873份(79.4％)田间出苗率不低于60％，461份(19.6％)为100％；只有485份(20.6％)田间出苗率低于60％，17份(0.7％)为零。结果表明，中国国家作物种质库中豌豆种质的种子活力较高，可以满足本研究的要求。

3.3不同播期豌豆种质的田间存活率

不同播期豌豆种质的田间存活率分布如图2B所示。NS的平均值为61.8％，其中1533份(65.0％)的田间存活率不低于60％，以存活率80％的种质数量最多，达到401份(17.0％)。LS1的平均值为47.4％，低于NS，其中1011份(42.9％)的田间存活率不低于60％，明显低于NS，且存活率为0的种质数量达到322份(13.7％)。LS2的平均值为28.5％，远低于NS，其中仅有472份(20.0％)的田间存活率不低于60％，远远低于NS，且活率为0的种质数量高达733份(31.1％)。结果表明，经过高温胁迫处理后，LS1和LS2的田间存活率低于NS，且LS2尤为明显。

3.4不同播期豌豆种质的单株产量

耐热筛选后不同播期每份豌豆种质的平均单株产量分布如图4A所示，可以看出NS中，平均单株产量在0-10g之间的种质数量为661份，占实验材料总量的28.0％；高于60g的种质数量为189份(8.0％)；其余各个层级的种质数量分布较为均匀。LS1中，0-10g之间的种质数量为959份(40.7％)，较NS有所上升；其余各个层级的种质数量较NS均有所下降，表明高温胁迫对豌豆种质产量造成了一定的影响。LS2中，0-10g之间的种质数量高达1692份(71.8％)，远超过NS相应层级和其余各个层级的种质数量，表明高温胁迫对豌豆种质产量产生了极其严重的影响。

3.5耐热筛选后各分级种质数量

按照豌豆种质耐热筛选分级标准，确定耐热筛选后各分级种质数量，如图4B所示。各个分级的种质数量经过Kolmogorov-Smirnov检验后，渐进显著性概率值P为0.850>0.05，因此服从正态分布，表明耐热筛选实验设计合理可行。划分为1级、2级和3级的种质份数分别为82份、68份和107份，三者统称为耐热(HT)种质，共计257份；划分为7级、8级和9级的种质份数分别为86份、53份和36份，三者统称为热敏感(HS)种质，共计175份，因此耐热及热敏感种质总计432份。

3.6豌豆种质的耐热性与播期类型

2358份豌豆种质按照播期类型可划分春播和冬播为两大类，其中春播类型1324份(56.1％)，冬播类型1034份(43.9％)(表1)。耐热筛选后春播类型共计246份，冬播类型共计186份。257份耐热种质中春播类型100份(38.9％)，冬播类型157份(61.1％)；175份热敏感种质中春播类型146份(83.4％)，冬播类型29份(16.6％)。耐热种质中春播类型少于冬播类型，而热敏感种质中春播类型远多于冬播类型。

3.7耐热筛选后群体的遗传多样性分析

利用耐热相关SNaPshot标记对耐热筛选后群体进行遗传多样性评价。NG和NA总数分别为52和39(表5)。MAF、GD、He和PIC的均值分别是0.749，0.313，0.156和0.246(表5)，范围是分别是0.530–1，0–0.498，0–0.488和0–0.374(表6)。根据PIC值大小，共有13个中PIC和7个低PIC的SNaPshot标记(表5)。耐热相关SNaPshot标记的分析结果表明，筛选后的豌豆种质群体具有较高的遗传多样性。

表5耐热性筛选后豌豆种质群体SNP标记遗传多样性参数总结

备注：NG：基因型数；NA：等位基因数；MAF：主要等位基因频率；GD：基因多样性；He：期望杂合度；PIC：多态信息含量，高(PIC≥0.5)，中(0.25≤PIC<0.5)，低(PIC<0.25)。

表6豌豆耐热相关SNaPshot标记的遗传多样性指数

3.8耐热筛选后群体的遗传结构分析

为了研究筛选后豌豆种质的群体遗传结构，利用Structure 2.3.4计算432份豌豆种质的遗传组成，并确定其最佳的遗传亚群分组数(K)。EvannoΔK值同样也都是在遗传亚群K＝2时最高(图5)。图6A中，橙色(黑白图中为浅灰)代表亚群A，共计185份，其中耐热种质72份(38.9％)，热敏感种质113份(61.1％)；亚群A中春播类型126份(68.1％)，冬播类型59份(31.9％)。浅蓝色(黑白图中为深灰)代表亚群B，共计247份，其中耐热种质185份(74.9％)，热敏感种质62份(25.1％)；亚群B中春播类型120份(48.6％)，冬播类型127份(51.4％)(表7)。

表7基于耐热相关SNaPshot标记Structure分析的豌豆种质遗传亚群分组

利用主坐标分析(PCoA)对Structure分析结果加以验证。基于耐热相关标记的PCoA同样将筛选后豌豆种质分成了两个遗传亚群A和B，与Structure分析一致。如图6B所示，蓝色椭圆(左侧椭圆)中的亚群A与红色椭圆(右侧椭圆)中的亚群B以大致分开，但有个别种质在椭圆外，其中橙色菱形代表亚群A春播类型，橙色三角形代表亚群A冬播类型；浅蓝色菱形代表亚群B春播类型，浅蓝色三角形代表亚群B冬播类型，其群体组成与Structure分析一致。耐热相关标记的PCoA前三成分贡献率为47.47％。以上结果表明，PCoA较好地验证了Structure分析对于豌豆种质的遗传亚群分组。

利用UPGMA聚类分析构建系统发育树，可以更加直观地加以展示分析结果。基于耐热相关标记的UPGMA树状图同样将参试豌豆种质划分为两组树状分支。如图6C所示，橙色树状分支为亚群A，浅蓝色树状分支为亚群B。与PCoA分析类似，两个亚群内也有个别种质在对方的亚群内部。

耐热筛选后的432份豌豆种质按照不同的方式，既可分为春播类型(n＝246)和冬播类型(n＝186)；又可分为耐热种质(n＝257)和热敏感种质(n＝175)。通过耐热相关SNaPshot标记的群体遗传结构分析后获得了2个亚群，可以对耐热与否进行遗传组成解析。如图7所示，175份热敏感种质中属于亚群A的113份(64.6％)，接近2倍于亚群B的62份(35.4％)；257份耐热种质中属于亚群A的仅有72份(28.0％)，不到亚群B的185份(72.0％)的二分之一，表明热敏感种质大多数属于亚群A，而耐热种质大多数属于亚群B。

4.讨论

本研究首次将SNaPshot方法引入到豌豆种质的鉴定评价中，对经过耐热筛选后的432份豌豆种质利用与热激蛋白或热激转录因子相关的SNaPshot标记进行遗传多样性评价及群体遗传结构分析。SNaPshot标记分析后发现，标记数量显著影响NG和NA总量，对MAF、GD和PIC的均值有一定影响，但对He均值几乎没有影响。标记数量增多，NG和NA总量升高，MAF均值却降低，GD和PIC均值升高，高度和中度PIC标记的比例增多；反之亦然。从标记内部看，群体量对NG和NA总量影响较小，表明标记选择科学，在染色体上的分布均匀。群体量减少，MAF均值升高，He变化不大，GD和PIC均值降低，高度和中度PIC标记的比例随之降低；反之亦然。

Structure分析将筛选后群体划分为两个遗传亚群A和B。亚群A共计185份种质，其中耐热春播类型18份(9.7％)，耐热冬播类型54份(29.2％)，热敏感春播类型108份(58.4％)，热敏感冬播类型5份(2.7％)，亚群A以热敏感种质为主，其中春播类型占大多数；亚群B中共计247份种质，其中耐热春播类型82份(33.2％)，耐热冬播类型103份(41.7％)，热敏感春播类型38份(15.4％)，热敏感冬播类型24份(9.7％)，亚群B以耐热种质为主，其中冬播类型略高。

主坐标分析(PCoA)和UPGMA聚类分析可以更加直观地验证Structure分析结果，只是两个亚群内部有个别不同亚群的基因型。几种分析都验证了本研究实验结果，即亚群A和B中，耐热性与播期类型存在一定的相关性，耐热种质往往是冬播类型，而热敏感种质以春播类型为主，推其原因是由于豌豆春播区多在高纬度地区，如中国北方辽宁、内蒙古、河北北部、陕西、甘肃、青海等省份，国外主要是欧洲北美等地种植时，整个生育期内极少出现30℃以上的高温天气。当地的豌豆种质适应冷凉气候，耐热基因受到的选择压力较小而不发生聚集，即不具有耐热基因或者携带耐热基因较少，因此对于高温胁迫十分敏感。而实际生产中冬播类型通常在前一年的10月中下旬播种，次年的4月至5月份收获，生殖生长时期会遇到30℃以上的高温天气，耐热基因在冬播类型中受到的选择压力而得以保留，因此豌豆种质的耐热性与播期类型存在相关性。本研究的田间耐热筛选实验结果就验证了此论断。综上所述，SNaPshot技术完全可用于今后的豌豆遗传育种研究，加速豌豆优良基因挖掘。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院

<120> 一套基于SnaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记及应用

<130> 0

<160> 40

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物1-F

<400> 1

gaacaatcac ctcaaatcct cca 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物1-R

<400> 2

accgatgaat ccaactcaac aag 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物2-F

<400> 3

taaccgccaa gatcaaggga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物2-R

<400> 4

gctgagagag ggactggaaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物3-F

<400> 5

tcctcaccga aatcaaacgc 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物3-R

<400> 6

aaagacacca actcatcgca ct 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物4-F

<400> 7

aacaagcatt gattctacca ccc 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物4-R

<400> 8

acaaacaaca aaagcaagcc g 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物5-F

<400> 9

gcctatgcct atggagtgtt tg 22

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物5-R

<400> 10

ttacatttag agggtgacaa agcaa 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物6-F

<400> 11

caacgagaaa gtggtggtgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物6-R

<400> 12

agcctcctct ttcgcttcat 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物7-F

<400> 13

tccttcttta atctcccacg g 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物7-R

<400> 14

attgaaacca actcacttcc ctt 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物8-F

<400> 15

aagccagttc tcagcttctc c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物8-R

<400> 16

tcgaggagcg ctacaaagaa 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物9-F

<400> 17

tccaaccaaa ccactagcag atc 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物9-R

<400> 18

aggcctcaag gtcgagaaca g 21

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物10-F

<400> 19

tgatcagggc tttagaaagg ttg 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物10-R

<400> 20

cactcttctt gctgcctctg ac 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物11-F

<400> 21

tcaagctctt ttcttcgccc 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物11-R

<400> 22

ctgtctctct cgcatcccat c 21

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物12-F

<400> 23

tggaaacttg gtgtgacagt aaatc 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物12-R

<400> 24

tcaactatca gagattcttg tccaa 25

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物13-F

<400> 25

agccatttgt tttgttttct tgag 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物13-R

<400> 26

tcattgcaaa attcccatct actt 24

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物14-F

<400> 27

tgtgtagcag tttggcaggg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物14-R

<400> 28

aggtttgtca tctttgccag c 21

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物15-F

<400> 29

gcttctaacc caaccaatac agtc 24

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物15-R

<400> 30

acttcacgca tctttctgag gac 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物16-F

<400> 31

atagggggtg ttattgtggt gat 23

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物16-F

<400> 32

gattgcgaag agccgtgaa 19

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物17-F

<400> 33

aactcgagaa attgttgtgc cta 23

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物17-R

<400> 34

tgagattgtg ctactatgga gcaa 24

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物18-F

<400> 35

tcaccgtctt caccattaca cc 22

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物18-R

<400> 36

acagttgaac aaaacctgat cca 23

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物19-F

<400> 37

ggcatcacaa ccagaagaaa tagt 24

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物19-R

<400> 38

gcctgtagga atcaccactg c 21

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物20-F

<400> 39

ggtattcaac tgcctgacaa agc 23

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物20-R

<400> 40

ctacgacatg gtggatgact cttc 24

Claims

1.一种对豌豆种质进行耐热筛选的方法，其特征是，

将待筛选的豌豆种质分三个播期播种：(1)正常播种NS；(2)晚播一期播种LS1；(3)晚播二期播种LS2；

利用以下公示计算每份种质的晚播一期和晚播二期的平均单株产量损失率LR1和LR2：

LR1(％)＝[1-(P_LS1/P_NS)]×100％

LR2(％)＝[1-(P_LS2/P_NS)]×100％

根据以下的豌豆种质耐热分级标准进行分级：

1级：0<LR1≤20％and 0<LR2≤20％；

3级：20％<LR1≤40％and 20％<LR2≤40％；

5级：40％<LR1≤60％and 40％<LR2≤60％；

7级：60％<LR1≤80％and 60％<LR2≤80％；

9级：80％<LR1≤100％and 80％<LR2≤100％。

2.如权利要求1所述的一种对豌豆种质进行耐热筛选的方法，其特征是，所述晚播一期播种比正常播种晚播15天；晚播二期播种比正常播种晚播30天。

3.一套基于SNaPshot技术开发的豌豆耐热相关SNP标记，其特征是，包括下表所示的20个SNP标记：

。

4.如权利要求3所述的豌豆耐热相关SNP标记，其特征是，20个SNP标记的外围扩增引物序列和单碱基延伸引物序列如下表所示：

表4 SNaPshot引物信息

5.权利要求3或4所述的豌豆耐热相关SNP标记在耐热和热敏感豌豆种质的遗传多样性和和群体遗传结构分析中的应用。

6.权利要求3或4所述的豌豆耐热相关SNP标记在豌豆耐热遗传机理和耐热育种研究中的应用。

7.一种采用权利要求4所述的豌豆耐热相关SNP标记进行耐热和热敏感豌豆种质遗传多样性分析的方法，其特征是，

1)SNaPshot PCR反应

首先通过权利要求1或2所述的步骤进行耐热筛选，建立包含耐热和热敏感豌豆种质的遗传群体；

然后以待测豌豆种质群体的DNA作为PCR模板，进行外围扩增，每个位点进行单一扩增，PCR产物纯化后再采用单碱基延伸引物进行SNaPshot PCR，SNaPshot PCR反应产物通过ABI3730XL DNA分析仪进行毛细管电泳检测；

2)遗传多样性分析

利用Gene mapper 4.1进行SNP位点数据分析，每个样品按照SNP位点对应峰值进行基因分型，所得分析结果为Excel格式文件和PDF格式峰图，利用PowerMarker 3.25计算两组SNP标记的遗传多样性参数。

8.如权利要求7所述的进行耐热和热敏感豌豆种质遗传多样性分析的方法，其特征是，所述步骤2)遗传多样性参数包括基因型数、主要等位基因频率、等位基因数、基因多样性、期望杂合度和多态信息含量。

9.一种进行耐热和热敏感豌豆种质遗传多样性分析的方法，其特征是，在权利要求7或8的步骤2)的基础上，首先，利用Structure 2.3.4计算豌豆种质的遗传组成，并确定其最佳的遗传亚群分组数；其次，利用主坐标分析PCoA对Structure分析结果加以验证；最后，利用UPGMA聚类分析构建系统发育树，直观地展示分析结果。