CN106399480A - 团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星遗传指纹 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星遗传指纹，即EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426和EST3643。本发明还提供该微卫星遗传指纹的应用。其优点表现在：本发明首次筛选到团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代不同群体的9个特异微卫星标记，为草鱼优良群体的选育提供了基础资料。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，具体地说，是团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星遗传指纹。
背景技术
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国淡水养殖的四大家鱼之一，是目前大宗淡水鱼类中年产量最大的养殖品种【沈玉帮,张俊彬,李家乐.草鱼种质资源研究进展.中国农学通报,2011,27(7):369-373；曹婷婷,白俊杰,于凌云.草鱼遗传结构和遗传多样性的研究概况.中国农学通报,2012,28(5):76-80】。由于草鱼怀卵量大，再加上亲本留种和配组操作不规范，容易近交造成遗传多样性降低、抗病(逆)性差、性状退化等严重问题【渔业简讯.水产科技情报,2010,37(2):102-104；张德春,杨代淑,等.长江鲢遗传多样性的随机扩增多态DNA分析.水产学报,1999,23(增刊1):7-14；李思发,王强,陈永乐.长江、珠江、黑龙江三水系的鲢、鳙、草鱼原种种群的生化遗传结构与变异.水产学报,1986,10(4):351-372】。因其繁殖周期长，一般需要4年以上才能达到性成熟，应用传统的选育方法选育出草鱼优良品种进展缓慢，目前草鱼尚无国家审定的良种。采用染色体倍性操作结合微卫星标记遗传多样性评估，在生产性能优良的长江水系草鱼进行良种选育也可能是一种可行的途径。
分子标记作为鱼类群体多样性研究的有效手段，在草鱼研究中得到广泛应用【LiuZ J,Cordes J F.DNA marker technologies and their applications in aquaculturegenetics[J].Aquaculture,2004,238(1-4):1-37】。目前，一些国内外学者应用RAPD【薛国雄,刘棘,刘洁.三江水系草鱼种群RAPD分析.中国水产科学,1998,5(1):1-5】、RFLP【张四明,汪登强,邓怀,等.长江中游水系鲢和草鱼群体mtDNA遗传变异的研究.水生生物学报,2002,26(2):142-147】、TRAP【Zhang ZW,Cao Z M,Zhou J S,etal.Genetic structureanalyses ofdifferent populations ofgrass carp(Ctenopharyngodon idella)usingthe TRAP technique[J].ChineseJournalofAgriculturalBiotechnology,2007,4(1):27-32】、ISSR【Chen Q,Wang C H,Li S F,et al.Analysis of genetic variation in grasscarp(Ctenopharyngodon idellus)from native and colonized regions using ISSRmarkers[J].Biochemical Systematics andEcology,2009,37(5):549-555】及SSR【Liu F,Xia J H,Yue G H,et al.High genetic diversity and substantial populationdifferentiation in grass carp(Ctenopharyngodon idella)revealed bymicrosatellite analysis[J].Aquaculture,2009,297(1-4):51-56；王解香,于凌云,白俊杰,等.草鱼EST-SSR标记及5个不同地域群体的遗传结构分析.动物学杂志,2011,46(5):24-32；周盼,张研,孙效文,等.基于6个微卫星标记的三江水系草鱼遗传多样性分析.中国水产科学,2011,18(5):1011-1020；Hiroshi H,Petrino M G,Kakunagaa T.A novelrepeated element with Z-DNA-forming potential is widely found inevolutionarily diverse eukaryotic genomes[J].Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences,1982,79(21):6465-6469】等手段对草鱼群体的遗传多样性进行了研究。微卫星(SSR)标记在基因组定位方面具有分布密度高、分布均匀等特点，它一出现就被作为良好的作图标记广泛应用【马洪雨,岳永生,于艳,等.鲤微卫星引物对麦穗鱼的适用性初步研究.水生生物学报,2007,31(2):278-281；吴旭东,连总强,侯玉霞,等.大口鲇微卫星标记在三个鲇形目鱼类种群间适用性研究.水生生物学报,2011,35(4):638-645；DubutV,Martin J F,Costedoat C,et al.Isolation and characterization ofpolymorphicmicrosatellite loci in the freshwater fishes Telestes souffia and Telestesmuticellus(Teleostei:Cyprinidae)[J].MolecularEcologyResources,2009,9(3):1001-1005】。另外，SSR标记由于重复性好、共显性、符合孟德尔分离等特点，迅速应用到群体多样性分析、构建遗传连锁图谱、亲子鉴定等方面【Zietkiewicz E,RafalskiA,LabudaD.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymeasechain reaction amplification[J].Genomics,1994,20(2):176-183.】。此外，SSR标记在物种基因组中广泛存在并具有较高的多态性，可用于检测雌核发育后代是否含有父本的遗传物质，并用于评价雌核发育后代的纯合性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：微卫星标记在鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代中的应用。
所述的微卫星标记为17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137或HLJC151。
所述的微卫星标记为EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426或EST3643。
所述的团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代为以灭活的团头鲂精子激活草鱼卵子，经冷休克处理建立的草鱼雌核发育后代。
所述的团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代为以紫外线灭活的团头鲂精子激活草鱼F2代亲本卵子，冷休克抑制第二极体排出的方法建立的草鱼雌核发育后代。
一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星DNA指纹，所述的DNA指纹由EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426和EST3643组成。
一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星DNA指纹，所述的DNA指纹由17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137或HLJC151组成。
一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的方法，所述的方法测定草鱼的17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137、HLJC151位点，EST1573、EST0222、HLJC20或EST0426扩增出独有的条带为草鲂杂交后代。
本发明优点在于：
本发明以紫外线灭活的团头鲂精子激活草鱼卵子，冷休克抑制第二极体排出的方法诱导出长江水系优良F2代草鱼减数雌核发育子代。在后代中不仅存在雌核发育后代，还存在草鲂杂交后代，雌核发育后代的体型与草鱼一致，而草鲂杂交后代的体型介于草鱼与团头鲂之间。Partec CyFlow倍性分析仪测定结果显示：普通草鱼与雌核发育草鱼的相对DNA含量分别为23.01、22.72，二者的DNA含量接近；而高体型子代的相对DNA含量为25.38，介于草鱼与团头鲂(DNA含量28.21)之间，属于草鲂杂交后代。选取17个微卫星标记对草鱼群体、雌核发育草鱼群体和草鲂杂交后代的遗传多样性进行了检测，共检测出59个等位基因，其中43.18个有效等位基因。草鱼对照群体、草鲂杂交后代和雌核发育草鱼群体的平均等位基因依次为3.57、2.86、2.79，平均有效等位基因依次为2.93、2.37、1.96，平均期望杂合度在依次为0.6502、0.5573、0.3775，多态信息含量(PIC)平均值依次为0.5738、0.4649、0.3791。与草鱼对照群体相比，雌核发育草鱼群体的遗传多样性显著下降，表明通过减数雌核发育方法可获得纯合性较高的草鱼个体。构建了草鱼后代不同群体的DNA指纹模式图，筛选到不同群体的9个特异微卫星标记，为草鱼优良群体的选育提供了基础资料。
附图说明
附图1：草鱼雌核发育后代的形态(A：草鱼对照；B：团头鲂对照；C：雌核发育草鱼；D：草鲂杂交后代)。
附图2：草鱼雌核发育后代的相对DNA含量。a：雌核发育草鱼；b：草鲂杂交后代；c：草鱼对照；d：团头鲂对照。
附图3：草鱼雌核发育不同群体微卫星DNA指纹模式图。A：雌核发育草鱼，B：草鲂杂交后代，C：草鱼对照群体。
附图4：HLJC20引物在草鱼群体的PAGE图谱。M：Marker I，1-8：雌核发育草鱼，9-16：草鲂杂交后代，17-24：草鱼对照，25-32：团头鲂对照。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
1材料与方法
1.1实验材料
本实验以上海海洋大学青浦鱼类育种试验站保存的长江水系优良草鱼F2代为繁殖用鱼。对照组为草鱼F2代亲本自交后代，实验组为紫外线灭活团头鲂(Megalobramaamblycephala)精子激活草鱼F2代亲本卵子，冷休克抑制第二极体排出的方法建立草鱼雌核发育群体。每群体各取样30尾，每尾剪取少许鱼鳍放入95％酒精中保存于-20℃备用。
1.2草鱼F2代减数雌核发育个体的诱导
团头鲂精子的灭活：缓慢挤压成熟的雄性团头鲂的腹部，将挤出的白色精液均匀分布于玻璃培养皿中，与Hank’s缓冲液按1:4的比例稀释。稀释好的精液厚度控制在0.1-0.2mm，然后将玻璃培养皿平放于冰袋上，置于两支15w紫外灯装置中照射10-20min，距离约为15cm；为使精子照射均匀，每隔1.5min轻摇培养皿一次，显微镜下观察其活力，最后将处理好的精液保存于4℃冰箱。
卵子染色体的加倍：挤取雌性草鱼的卵子，与经UV照射的团头鲂精子充分混合，加水激活2min后，将受精卵浸于控温水浴循环槽中，4-6℃冷休克处理12min，处理完的受精卵置于室温下继续培养，每4hr换水，并挑弃死卵直至出苗，然后放于24m2水泥池养殖。
1.3雌核发育后代的倍性检测
取6月龄的草鱼对照群体、雌核发育草鱼群体、草鲂杂交后代群体和团头鲂各5尾，从尾静脉采血，然后取1μL血样加入到1mL DAPI染液中，避光染色30-60s，用500目过滤管过滤到上样管内，然后用Partec CyFlow倍性分析仪(产地，德国)进行DNA含量检测。
1.4微卫星引物
本研究采用的17对草鱼微卫星引物中，其中8对草鱼的EST-SSR标记(EST0363、EST0307、EST3746、EST793、EST3643、EST1573、EST0426、EST222)是本实验室筛选的草鱼SSR引物【郑国栋,陈杰,邹曙明,等.长江草鱼不同群体EST-SSR多态性标记的筛选及其遗传结构分析.水生生物学报,2015,39(5):1003-1012】，另外9对引物(HLJC20、HLJC26、5476、17329、HLJC145、HLJC222、MFW1、HLJC137、HLJC151)分别参考文献【王解香,于凌云,白俊杰,等.草鱼EST-SSR标记及5个不同地域群体的遗传结构分析.动物学杂志,2011,46(5):24-32；周盼,张研,孙效文,等.基于6个微卫星标记的三江水系草鱼遗传多样性分析.中国水产科学,2011,18(5):1011-1020；Wang J X,Yu LY,Bai J J,et al.Development of EST-SSRmarkers and analysis of genetic diversity in five populations of grass carp(Ctenopharyngodon idellus)[J].ChineseJournal ofZoology,2011,46(5):24-32；李文升,刘翠,孙效文,等.草鱼三、四核苷酸重复微卫星标记的分离与特征分析.中国水产科学,2011,18(4):742-750】，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物相关信息见表1。
表1微卫星引物特征
注：F为正向引物；R为反向引物
1.5基因组DNA制备
参照北京天根生物科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书介绍的方法提取样品基因组DNA。基因组DNA提取完成后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度，-20℃保存备用。
1.6PCR反应体系与扩增程序
反应体系10μL，包含5μL含染料的2×Taq PCR MasterMix(Taq DNA Polymerase：0.1U/μL；MgCl2：4mM；dNTPs each：0.4mM)，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，0.5μLDNA(30-50ng)，3.5μL ddH2O。PCR反应在EppendorfMastercycler ep gradients型PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54-65℃(可据表1进行调整)退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。
1.7PCR产物凝胶电泳检测
PCR产物在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，胶片大小为195mm(长)×120mm(宽)×1mm(厚)。产物上样量均为1μL，DNAMarkerⅠ。电泳条件：电泳缓冲液为1×TBE，电压200V，电泳1-1.5h(具体时间根据PCR产物分子量大小而定)。电泳完成后，进行硝酸银染色，染色方法参照张倩倩等【张倩倩,蒋霞云,邹曙明,等.不同鳊鲂鱼类群体微卫星DNA指纹图谱的构建和遗传结构分析.水产学报,2014,38(1):15-22.】的方法进行。最后将胶片平铺于观片灯箱上，用数码相机照相并存入电脑。
1.8数据统计与分析
(1)用Quantity One凝胶图像分析软件分析微卫星条带大小，根据每个个体产生的条带位置确定基因型。
(2)用Popgene(Version 1.32)软件进行分析，计算每个微卫星座位分别在3个群体中的等位基因数(number of alleles,Na)，观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)，期望杂合度(expected heterozygosity,He)。
(3)多态信息含量(polymorphic information content,PIC)【Botstein D,WhiteR L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man usingrestriction fragment length polymorphisms[J].The American Journal ofHumanGenetics,1980,32(3):314-331】，，式中，Pi、Pj分别为第i个和第j个等位基因的频率，n为等位基因数目。
2结果
2.1草鱼雌核发育后代不同群体的倍性检测
以紫外线灭活的团头鲂精子激活草鱼卵子，冷休克抑制第二极体排出的方法建立长江水系优良草鱼F3雌核发育后代。在后代中存在形态差异明显的2种类型后代：一种与草鱼体形相似，应为减数雌核发育后代(图1a-c)；另一种为高背体型，体形明显偏高，可能属草鲂杂交后代(图1d-f)。Partec CyFlow倍性分析仪测定草鱼减数雌核发育后代不同群体的相对DNA含量，统计结果见表2。结果显示，普通草鱼与减数雌核发育草鱼的相对DNA含量分别为23.01、22.72(图2)，二者的DNA含量接近；而高体型子代相对DNA含量为25.38，介于草鱼与团头鲂(DNA含量28.21)之间(图2)，应属于草鲂杂交后代。
表2草鱼雌核发育后代的相对DNA含量统计
2.2草鱼雌核发育后代不同群体的微卫星多态性
选取17个SSR位点进行草鱼不同群体多样性分析，由表3可知，等位基因总数为59，有效等位基因总数为43.18，多态信息含量介于0.000-0.7368，只有MFW1位点在草鱼群体中表现为纯合，其它位点均为多态位点。根据PIC>0.5为高度多态位点，因此采用PIC位于0.35-0.75之间的14个SSR位点(17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137、HLJC151)对雌核发育后代不同群体进行遗传多样性分析。
2.3草鱼雌核发育后代不同群体的SSR遗传多样性分析
采用14个多态性SSR位点在3个群体中检出的等位基因数、有效等位基因数、观测纯合度、期望纯合度、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量见表4(表4-1、表4-2)。由表4可知，每个位点检测到的等位基因数2-4个不等。在3个草鱼群体中，雌核发育草鱼，草鲂杂交后代和草鱼对照群体的平均等位基因数依次为2.79、2.86、3.57；平均有效等位基因数依次为1.96、2.37、2.93；平均期望纯合度依次为0.6225、0.4427、0.3498；平均期望杂合度依次为0.3775、0.5573、0.6502；平均多态信息含量依次为0.3791、0.4649、0.5738。从这些遗传参数中可得出，这3个群体的遗传多样性从高到低依次为草鱼对照群体>草鲂杂交后代>雌核发育草鱼。
用Popgene(Version 1.32)软件计算草鱼3个群体间的Nei’s相似性和遗传距离，结果如表5所示。雌核发育草鱼，草鲂杂交后代和草鱼对照群体的遗传相似性分别为0.7579，0.7501；雌核发育草鱼和草鲂杂交后代的遗传相似性为0.8006。
表3草鱼17个微卫星座位上遗传多样性参数
表4-1草鱼雌核发育后代不同群体的遗传多样性参数
注A：雌核发育草鱼，B：草鲂杂交后代，C：草鱼对照群体
表4-2草鱼雌核发育后代不同群体的遗传多样性参数
注A：雌核发育草鱼，B：草鲂杂交后代，C：草鱼对照群体
表5草鱼雌核发育后代不同群体的Nei’s遗传相似性(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)
注：A群体：雌核发育草鱼，B群体：草鲂杂交后代，C群体：草鱼对照群体
2.4草鱼雌核发育后代不同群体的微卫星鉴别
根据3个草鱼群体在14个SSR位点上的扩增结果构建草鱼雌核发育不同群体的DNA指纹模式图(图3)。9个特异的SSR标记(EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426和EST3643)可用于草鱼雌核发育后代不同群体的区分。其中EST1573、EST0222、HLJC20和EST0426可在草鲂杂交后代中扩增出独有的条带(图4)。相比雌核发育草鱼，EST0222、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363和EST3643可在草鱼对照群体中扩增出独有的条带(图3)。
3讨论
3.1草鱼雌核发育后代不同群体的遗传多样性分析
从各个遗传参数来讲，等位基因的数目(Na)、遗传纯合度(He)和多态性信息含量(PIC)等可从多个角度反映群体的遗传多样性和遗传潜力【杨弘,李大宇,曹祥,等.微卫星标记分析罗非鱼群体的遗传潜力.遗传,2011,33(7):768-775.】。本研究获得草鱼对照群体、草鲂杂交后代、减数雌核发育后代的等位基因数依次为50、40、39；遗传纯合度依次为0.3498、0.4427、0.6225，经过人工诱导雌核发育方法，草鱼群体的等位基因数明显减少，遗传纯合度得到显著提高。并且，通常认为PIC＞0.5为高度多态，0.25＜PIC＜0.5为中度多态，PIC＜0.25为低度多态【Botstein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction ofa genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].AmericanJournal ofHuman Genetics,1980,32(3):314-331】。本研究草鱼对照群体的PIC＝0.5738为高度多态，而雌核发育草鱼群体的PIC＝0.3791，为中度多态，这与我们采用多条草鱼F2代母本有关。全迎春【全迎春,韩林强,白俊杰,等.雌核发育草鱼的遗传结构分析和微卫星鉴别方法的建立.水产学报,2014,38(11):1-7】以微卫星方法鉴别得出普通草鱼和雌核发育草鱼多态信息含量分别是0.5528、0.3571，这与我们的结果基本相一致。
从遗传距离角度来讲，雌核发育草鱼群体与高体型子代群体、草鱼对照群体的遗传距离分别为0.2224、0.2772，这表明雌核发育草鱼群体与高体型子代群体的亲缘关系较近，而与草鱼对照群体的亲缘关系稍远，出现此结果的原因可能是选用微卫星标记的多态性对遗传多样性的影响，李欧等人【李鸥,赵莹莹,孙效文,等.草鱼种群SSR分析中样本量及标记数量对遗传多度的影响.动物学研究,2009,30(2):121-130】研究表明样本量、微卫星标记的数量和多态性水平对群体遗传多样性均有较大的影响，其次是不同的草鱼微卫星标记在团头鲂(与草鱼不同亚科)中适用性低对遗传多样性的影响，目前已有不少研究证实微卫星标记在亲缘关系较近的物种间适用性较高，Chen等【Chen WM,Cheng Q.Developmentof thirty-five novel polymorphic microsatellite markers in Pseudosciaenapolyactis(Perciformes:Sciaenidae)and cross-species amplification in closelyrelated species,Pseudosciaena crocea[J].Biochemical Systematics and Ecology,2013,47:111-115】在小黄鱼中开发的35对微卫星引物适用于近缘种大黄鱼，具有很好的通用性。但草鱼和团头鲂的亲缘关系较远，针对微卫星标记在两者间的适用性的研究较少。本研究14个草鱼SSR标记，只有4个标记(EST1573、EST0222、HLJC20、EST0426)在团头鲂中扩增出异于草鱼的等位基因。
3.2对高体型子代群体的分析
对于高体型子代群体，其在雌核发育草鱼群体所占的数量比例非常的少，其外部形态特征除了背高，还具有体型偏窄，侧线鳞增多等特征，以上特征明显趋近父本团头鲂，推测可能在紫外线灭活团头鲂精子时少部分精子并未完全失活，从而产生了草鲂杂交后代。邹桂伟【邹桂伟,潘光碧,汪登强,等.人工雌核发育鲢的遗传多样性及异源遗传物质整入的RAPD分析.水生生物学报,2004,28(2):180-185】在人工雌核发育鲢的遗传多样性及异源遗传物质整入的RAPD分析中，证明了父本的遗传物质可整合到了雌核发育子代个体中。
由表2可知，雌核发育草鱼群体和草鱼对照群体的相对DNA含量比值为1：0.987。赵如榕【赵如榕,肖亚梅,刘筠,等.雌核发育草鱼及亲本倍性研究.生命科学研究,2008,12(2):100-103】在雌核发育草鱼及亲本倍性研究中的结果是雌核发育草鱼和普通草鱼的相对DNA含量的比值为1：0.997。高体型子代的相对DNA含量的平均值为25.38，而草鱼对照群体和父本团头鲂的相对DNA含量分别为23.01、28.21，其DNA含量处于草鱼和团头鲂之间，因此进一步证明高体型子代群体是草鱼和团头鲂杂交的后代。
本研究中高体型子代群体在EST1573、EST0222、HLJC20和EST0426位点上均扩增出特有的条带，其大小分别为260.3bp、155.7bp、193.5bp、280.6bp，草鱼对照群体均没有相应的条带，而父本团头鲂均出现相应的条带。张新辉【张新辉,夏新民,王卫民,等.团头鲂雌核发育后代的微卫星标记分析.华中农业大学学报,2012,31(2):737-743】在团头鲂雌核发育后代的研究中，表明微卫星分子标记是一种对雌核发育遗传物质的来源检测的有效手段。进一步推测高体型子代群体应是草鱼和团头鲂杂交的后代。
3.3草鱼群体DNA指纹图谱
本研究利用14个SSR标记，构建了3个草鱼群体的DNA指纹数据库，并根据其等位基因片段大小制成了微卫星DNA指纹模式图谱，为了确保实验结果的准确性，选取每个特异性片段都与其他片段相差10bp以上，因此找出用于区分各个种群的9对特异性微卫星标记，此方法可以简单、快速、有效的进行雌核发育后代不同体型草鱼群体鉴定。同时可推广到相似的高度近交群体间的分析鉴定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.微卫星标记在鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微卫星标记为17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137或HLJC151。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的微卫星标记为EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426或EST3643。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代为以灭活的团头鲂精子激活草鱼卵子，经冷休克处理建立的草鱼雌核发育后代。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代为以紫外线灭活的团头鲂精子激活草鱼F2代亲本卵子，冷休克抑制第二极体排出的方法建立的草鱼雌核发育后代。
6.一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星DNA指纹，其特征在于，所述的微卫星DNA指纹由EST0222、HLJC20、HLJC137、HLJC151、HLJC222、EST0307、EST0363、EST0426和EST3643组成。
7.一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的微卫星DNA指纹，其特征在于，所述的微卫星DNA指纹由17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137、HLJC151组成。
8.一种鉴别团头鲂精子诱导草鱼减数分裂雌核发育后代的方法，其特征在于，所述的方法测定草鱼的17329、EST0222、EST0426、EST1573、EST3643、EST793、EST3746、EST0307、EST0363、HLJC20、HLJC222、HLJC26、HLJC137、HLJC151位点，EST1573、EST0222、HLJC20或EST0426扩增出独有的条带为草鲂杂交后代。
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| GR01 | Patent grant | ||
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