CN101824484B - 一种用于棉花品种真实性鉴定的dna指纹检测方法 - Google Patents
一种用于棉花品种真实性鉴定的dna指纹检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法，该方法中采用单粒棉种提取待检样品的基因组DNA，省时省力且简单快速的获得高质量DNA。使用26对SSR核心引物组合进行棉种真实性DNA指纹检测，这些核心引物具有多态性高、稳定性与重复性好的特点，且均匀分布于棉花基因组26条染色体。本发明方法操作简单，准确稳定，适用于棉花品种真实性快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是，涉及一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法。
背景技术
随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄，使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难，给种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难，造成诸如品种多、乱、杂的现象。近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的简单重复序列(SSR)标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高，以孟德尔方式遗传，呈共显性。SSR标记已成为品种鉴定首选技术之一，并已在玉米，水稻等作物上初步应用。
目前，我国棉种的真实性与品种纯度鉴定仍依靠田间小区种植鉴定方法，需投入大量的人力、物力，成本高、耗时长，时效性差。武耀廷，张天真，郭旺珍等进行了陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究；马轩，杜雄明，孙君灵等进行了18个彩色棉品系的SSR指纹分析；殷剑美，陈旭升，狄佳春等进行了杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建研究。广大科研工作者普遍认为，利用分子标记进行棉花品种鉴定是可行的。但利用现有的分子标记技术进行品种鉴定缺乏系统性研究，存在鉴别能力不够高、操作步骤较多、耗费时间较长、实验成本较高等问题，不能完全适应实践检测的需要。
发明内容
本发明目的是提供一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法，以克服现有技术存在的上述不足。
本发明通过对DNA快速提取法、分子检测标准试验体系(包括PCR扩增体系、电泳及银染检测)、核心引物筛选等环节进行全面系统的研究，从实践上解决限制DNA指纹技术商业化的关键技术问题，建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花品种DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发一种适用于棉花品种真实性检测的方法，采用该方法不仅检测结果稳定可靠，而且操作简单方便，成本低廉，有利于技术的标准化。
本发明提供一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法，其使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套核心引物对待测品种进行检测，所述核心引物的核苷酸序列如下所示：
| 引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
| NAU3254 | 上游：GCTTTGCTTTGGAATGAGAT；下游：TTGGTGCAGATAGCAAGAAA |
| NAU2277 | 上游：GAACTAGCCACATGATGCAC；下游：TTGTTGAGGCATTAGTTTGC |
| NAU1190 | 上游：CCATGTCCGTATCCATGTTA；下游：TAAGGCAAGATAGGGTCAGG |
| MUCS101 | 上游：AGCCTCTCTCTCCTTCAGGC；下游：GAGTCATATCGCTTGGGAGC |
| NAU934 | 上游：TGCTTTCGTATCCTTTTTCC；下游：ATTAGAGAAGCCAGGGAGGT |
| NAU874 | 上游：AAATGGCGTGCTTGAAATAC；下游：TGTGATGAAGAACCCTCTCA |
| NAU1362 | 上游：TCTGATTTGCTGATTGGAAA；下游：CTTATTCGGACTTGGTTGCT |
| BNL3257 | 上游：CAATCTGGGATCAAAAAAACC；下游：GGTGAAACATAGCGTGTTGC |
| BNL1317 | 上游：AAAAATCAGCCAAATTGGGA；下游：CGTCAACAATTGTCCCAAGA |
| BNL2960 | 上游：TAAGCTCTGGAGGCCAAAAA；下游：CCATTTCAATTTCAAGCATACG |
| BNL1231 | 上游：TAATAAAAGGGAAAGGAAAGAGTT；下游：TATGGCTCTAGAATATTCCCTCG |
| BNL3261 | 上游：AAACGGAAACGAAGAAGGGT；下游：CCCAAACCTGTCTCACCAAC |
| BNL1421 | 上游：TGAAGATTTGGAGGCAATTG；下游：GAAATCAAGCCTCAATTCGG |
| CIR246 | 上游：TTAGGGTTTAGTTGAATGG；下游：ATGAACACACGCACG |
| NAU2437 | 上游：CTTGGAAAAAGGAAGAGCAG；下游：TTAAAAGACCAAAGGCAAGG |
| JESPR292 | 上游：GCTTGCAATCTCCTACACC；下游：GAATATGTTTCATAGAATGGC |
| NAU1167 | 上游：CTGACTTGGACCGAGAACTT；下游：AAGAGCCCTGGACAATGATA |
| CIR216 | 上游：ATCTGAACCATCATCCTC；下游：TTCTGATTGGCACTTTC |
| NAU3110 | 上游：CCAAGGATATGAACCAAAGG；下游：CGTGAACACCATGTCAGTCT |
| BNL3646 | 上游：CCCAATACGAGGAGAGCACA；下游：TCGAAAATGGGGGAGAGAG |
| BNL3171 | 上游：GAAAAATTGAGGAAGGACATACG；下游：GGCCACAACCGAATTTACTG |
| BNL4030 | 上游：CCTCCCTCACTTAAGGTGCA；下游：ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC |
| BNL3140 | 上游：CACCATTGTGGCAACTGAGT；下游：GGAAAAGGGAAAGCCATTGT |
| NAU1125 | 上游：AAGAAGCCACTGAAGCAGAG；下游：GTAGAACAGCTCCATTGCTG |
| BNL827 | 上游：AAGCTCCACGTGCTCAAGTT；下游：CTCATGTTGTCGGTGGTGTT |
| CIR170 | 上游：TCGGTAAAGATGGGTG；下游：ATTGGTGCTGGTTGAG |
本发明中核心引物的筛选确定：以来源于我国三大棉区的32份棉花主栽品种为筛选材料，对现有引物进行大量的筛选，从棉花基因组每条染色体上挑选一对多态性高、稳定性与重复性好的引物，合计26对，作为品种真实性检测的一套核心引物。
根据本发明的DNA指纹检测方法，其包括提取待测品种的DNA、使用权利要求1所述26对核心引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。
其中，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
根据权利要求2或3所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/ml的1μlRNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μl反应液中包括：1.5mmol/LMgCl2，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，0.3μmol/L SSR引物，1U TaqDNA聚合酶，2μl DNA模板；反应程序为：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。
所述电泳步骤中，PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率80W电泳1h。
所述银染检测包括以下步骤：用10％乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液固定10min；用双蒸水快速漂洗1次；用0.2％AgNO3溶液染色5min；用双蒸水快速漂洗1次；用3％NaOH和0.5％甲醛组成的显影液显影；用10％无水乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液定影。
具体而言，利用上述核心引物进行棉花品种真实性检测，包括以下步骤：
1)单粒棉种DNA快速提取
随机选取供检样品棉种与对照样品棉种各5粒，采用电动种子粉碎器将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一次。加入等体积800μl酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25∶24∶1)，混匀至不分层，10000rpm离心10min。取上清，加入1μlRNase(10mg/ml)，37℃水浴30min。重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA，备用。该方法相比常规的以叶片为材料的CTAB提取法不仅能获得高质量的DNA，而且简单快速，省去了育苗时间和液氮研磨等环节，降低实验成本的同时大大提高了工作效率。
2)SSR-PCR扩增体系
20μl反应液中包括：1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，0.3μmol/L SSR引物(26对核心引物)，1U Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板。
反应程序：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s(退火温度可根据引物TM值进行适当调整)，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。该SSR-PCR扩增体系稳定可靠，确保了实验结果的可重复性。
3)电泳
PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率80W电泳1h。相比非变性胶和琼脂糖凝胶电泳，6％变性胶更适于高分辨率的棉种DNA指纹鉴定，不仅有效提高品种指纹鉴别能力，而且缩短了电泳时间。
4)银染检测
采用快速银染法，流程如下：
固定液(10％乙醇，0.5％冰醋酸)固定10min；→双蒸水快速漂洗1次；→0.2％AgNO3溶液染色5min；→双蒸水快速漂洗1次；→显影液(3％NaOH，0.5％甲醛)显影；→固定液(10％无水乙醇，0.5％冰醋酸)定影。该银染法操作简单，背景容易掌握，灵敏度高，且减少了冰醋酸的使用量，30分钟内即可获得背景清晰的染色效果。
5)结果分析：对供检样品与对照样品的26个位点的DNA指纹谱带进行比较：
引物位点差异≥2，判定两个品种为不同品种；
引物位点差异＝1，判定两个品种为近似品种；
引物位点差异＝0，判定两个品种为相同品种；
本发明棉花品种真实性DNA指纹检测方法具有以下有益效果：
本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于棉花品种真实性DNA指纹检测的方法，利用该方法对棉花品种真实性进行检测，一份样品从送样到出结果仅需2d，且检测结果稳定可靠，容易统计。该方法适用于我国主栽棉花品种真实性快速检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如非特别指明，实施例中所涉及的百分比浓度，固体药剂均为质量浓度，液体药剂均为体积浓度。
实施例1
鉴定市面上正在热销的杂交棉品种X是否为主推棉花杂交种中棉所48
检测流程如下：
1、DNA提取
随机挑取待测品种X与中棉所48干种子各5粒进行DNA制备
(1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2ml的离心管中。
(2)加入800ul DNA提取液(1％SDS，0.01mol/L EDTA 8.0，0.7mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。
(3)水浴结束后，加入等体积800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25∶24∶1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。
(4)吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入1uL RNase酶(10mg/ml)，混匀后37℃水浴30min。
(5)加入等体积800ul的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。
(6)将上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。
(7)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70％乙醇的离心管中，浸泡两次，第一次约2小时，第二次浸泡过夜。
(8)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200ul TE(pH 8.0)或ddH2O，充分溶解备用。
(9)紫外检测DNA浓度，用ddH2O将DNA原液稀释至使用浓度20ng/μl，4℃保存备用。
2、SSR-PCR扩增
采用26对核心引物进行PCR扩增(引物信息见表1)，PCR反应体系如下：
反应程序：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s(退火温度可根据引物TM值进行适当调整)，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。
3、电泳检测
(1)清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用纯水擦洗一遍，再用95％酒精擦洗一遍。在方板上涂上1ml Binding Silane(0.5％)，凹板上涂上1ml Repelsilane(2％)。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
(2)6％胶的制备：
注：40％PA胶：190g acrylamide+10g bisacrylamide用水稀释至500ml。
TEMED和10％APS在灌胶前加入。
(3)灌胶：灌胶过程中防止出现气泡，轻轻插入梳子，使其聚合2小时以上。
(4)变性：20μl PCR样品加上5μl 6×Loaling buffer，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5分钟，4℃冷却10分钟(或置于冰上冷却)。
(5)电泳：用移液器吹吸加样槽，清除气泡，擦入样品梳子，每一个加样孔点入3μl样品。80W(1600V/50mA)恒功率电泳至上部的Loading buffer带(二甲苯青)至胶板的另一前沿(约1小时)。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Binding silane的玻璃板上。
4、银染
固定：10％无水乙醇+0.5％冰醋酸固定液，轻轻晃动10分钟；
漂洗：双蒸水快速漂洗，不超过10秒；
染色：0.2％AgNO3溶液中染色5分钟；
漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10秒；
显影：3％NaOH+0.5％甲醛显影液，轻轻晃动至带纹出现；
定影；固定液中定影5分钟；
5、结果分析
通过以上检测，获得两个品种在26个位点上的DNA指纹图谱，进行比较后发现，两个品种在三个引物位点上指纹不同，根据判定标准，说明市场上热销杂交品种X不是主推杂交品种中棉所48。下述表1为棉花品种真实性检测核26对核心引物名单，其引物序列号按顺序依次为1-52。
表1 棉花品种真实性检测核心引物名单
| 编号 | 引物名称 | 所在染色体 | 引物序列(5′→3′) |
| M01 | NAU3254 | 1 | 上游：GCTTTGCTTTGGAATGAGAT；(1)下游：TTGGTGCAGATAGCAAGAAA(2) |
| M02 | NAU2277 | 2 | 上游：GAACTAGCCACATGATGCAC；(3)下游：TTGTTGAGGCATTAGTTTGC(4) |
| M03 | NAU1190 | 3 | 上游：CCATGTCCGTATCCATGTTA；(5)下游：TAAGGCAAGATAGGGTCAGG(6) |
| M04 | MUCS101 | 4 | 上游：AGCCTCTCTCTCCTTCAGGC；(7)下游：GAGTCATATCGCTTGGGAGC(8) |
| M05 | NAU934 | 5 | 上游：TGCTTTCGTATCCTTTTTCC；(9)下游：ATTAGAGAAGCCAGGGAGGT(10) |
| M06 | NAU874 | 6 | 上游：AAATGGCGTGCTTGAAATAC；(11)下游：TGTGATGAAGAACCCTCTCA(12) |
| M07 | NAU1362 | 7 | 上游：TCTGATTTGCTGATTGGAAA；(13)下游：CTTATTCGGACTTGGTTGCT(14) |
| M08 | BNL3257 | 8 | 上游：CAATCTGGGATCAAAAAAACC；(15)下游：GGTGAAACATAGCGTGTTGC(16) |
| M09 | BNL1317 | 9 | 上游：AAAAATCAGCCAAATTGGGA；(17)下游：CGTCAACAATTGTCCCAAGA(18) |
| M10 | BNL2960 | 10 | 上游：TAAGCTCTGGAGGCCAAAAA；(19)下游：CCATTTCAATTTCAAGCATACG(20) |
| M11 | BNL1231 | 11 | 上游：TAATAAAAGGGAAAGGAAAGAGTT；(21)下游：TATGGCTCTAGAATATTCCCTCG(22) |
| M12 | BNL3261 | 12 | 上游：AAACGGAAACGAAGAAGGGT；(23)下游：CCCAAACCTGTCTCACCAAC(24) |
| M13 | BNL1421 | 13 | 上游：TGAAGATTTGGAGGCAATTG；(25)下游：GAAATCAAGCCTCAATTCGG(26) |
| M14 | CIR246 | 14 | 上游：TTAGGGTTTAGTTGAATGG；(27)下游：ATGAACACACGCACG(28) |
| M15 | NAU2437 | 15 | 上游：CTTGGAAAAAGGAAGAGCAG；(29)下游：TTAAAAGACCAAAGGCAAGG(30) |
| M16 | JESPR292 | 16 | 上游：GCTTGCAATCTCCTACACC；(31)下游：GAATATGTTTCATAGAATGGC(32) |
| M17 | NAU1167 | 17 | 上游：CTGACTTGGACCGAGAACTT；(33)下游：AAGAGCCCTGGACAATGATA(34) |
| M18 | CIR216 | 18 | 上游：ATCTGAACCATCATCCTC；(35)下游：TTCTGATTGGCACTTTC(36) |
| M19 | NAU3110 | 19 | 上游：CCAAGGATATGAACCAAAGG；(37)下游：CGTGAACACCATGTCAGTCT(38) |
| M20 | BNL3646 | 20 | 上游：CCCAATACGAGGAGAGCACA；(39)下游：TCGAAAATGGGGGAGAGAG(40) |
| M21 | BNL3171 | 21 | 上游：GAAAAATTGAGGAAGGACATACG；(41)下游：GGCCACAACCGAATTTACTG(42) |
| M22 | BNL4030 | 22 | 上游：CCTCCCTCACTTAAGGTGCA；(43)下游：ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC(44) |
| M23 | BNL3140 | 23 | 上游：CACCATTGTGGCAACTGAGT；(45)下游：GGAAAAGGGAAAGCCATTGT(46) |
| M24 | NAU1125 | 24 | 上游：AAGAAGCCACTGAAGCAGAG；(47)下游：GTAGAACAGCTCCATTGCTG(48) |
| M25 | BNL827 | 25 | 上游：AAGCTCCACGTGCTCAAGTT；(49)下游：CTCATGTTGTCGGTGGTGTT(50) |
| M26 | CIR170 | 26 | 上游：TCGGTAAAGATGGGTG；(51)下游：ATTGGTGCTGGTTGAG(52) |
实施例2
鉴定某单位正在使用的亲本材料A是否为已申请保护的常规棉品种中棉所41，鉴定操作流程如下：
按照实施例1的步骤，随机挑取待测品种A与对照品种中棉所41干种子各5粒进行DNA制备，PCR扩增、电泳检测及银染。
结果分析：通过以上检测，获得两个品种在26个位点上的DNA指纹图谱，进行比较后发现，两个品种在26个引物位点上指纹完全相同，根据判定标准，说明亲本材料A是已申请保护的常规棉品种中棉所41。
序列表
<110>中国农业科学院棉花研究所
<120>一种用于棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法
<130>KHP10112482.9
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
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<210>28
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
atgaacacac gcacg 15
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
cttggaaaaa ggaagagcag 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ttaaaagacc aaaggcaagg 20
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gcttgcaatc tcctacacc 19
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gaatatgttt catagaatgg c 21
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
ctgacttgga ccgagaactt 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
aagagccctg gacaatgata 20
<210>35
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
atctgaacca tcatcctc 18
<210>36
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
ttctgattgg cactttc 17
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ccaaggatat gaaccaaagg 20
<210>38
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cgtgaacacc atgtcagtct 20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cccaatacga ggagagcaca 20
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
tcgaaaatgg gggagagag 19
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gaaaaattga ggaaggacat acg 23
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
ggccacaacc gaatttactg 20
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<211>20
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<213>人工序列
<400>43
cctccctcac ttaaggtgca 20
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<400>44
atgttgtaag ggtgcaaggc 20
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<213>人工序列
<400>45
caccattgtg gcaactgagt 20
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<400>46
ggaaaaggga aagccattgt 20
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aagaagccac tgaagcagag 20
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gtagaacagc tccattgctg 20
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<400>49
aagctccacg tgctcaagtt 20
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tcggtaaaga tgggtg 16
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
attggtgctg gttgag 16
Claims (7)
1.一种用于棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法，其特征在于，使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套核心引物对待测品种进行检测，所述核心引物的核苷酸序列如下所示：
。
2.根据权利要求1所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，包括提取待测品种的DNA、使用权利要求1所述26对核心引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。
3.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
4.根据权利要求2或3所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/ml的1μlRNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入 200μlTE或ddH2O充分溶解DNA，备用。
5.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μl反应液中包括：1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，0.3μmol/L SSR引物，1U Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板；反应程序为：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。
6.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述电泳步骤中，PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率80W电泳1h。
7.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述银染检测包括以下步骤：用10％乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液固定10min；用双蒸水快速漂洗1次；用0.2％AgNO3溶液染色5min；用双蒸水快速漂洗1次；用3％NaOH和0.5％甲醛组成的显影液显影；用10％无水乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液定影。
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