CN101429541B - 一种ssr分子指纹鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种SSR分子指纹鉴定方法，通过筛选SSR引物对DNA进行扩增，建立指纹图谱，并进行SSR丰度统计，进一步区分各个品种。采用本发明SSR分子指纹鉴定方法可以大量区分不同类型的植物品种，具有快捷高效，灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点，适用于棉花品种遗传鉴定、新品种保护、区域试验和品种纯度鉴定等方面。

Description

一种SSR分子指纹鉴定方法
技术领域
本发明属于新品种分子检测技术领域，具体地涉及一种SSR分子指纹鉴定方法。
背景技术
SSR标记是建立在PCR基础上的一种新型遗传标记，能够反映植物在遗传物质DNA水平上的差异，具有较高的多态性信息量、共显性分离、标记位点专化性、试验重复性好等特点。已在生物起源、进化、遗传多样性研究和品种资源鉴定中得到广泛应用。在棉花上SSR标记已逐步用于种质保存的完整性的遗传评价，种质资源的遗传多样性、遗传相似性分析，用于种子纯度和杂交种亲本鉴定和检测。陈光(2005)对我国陆地棉基础种质及其衍生种质进行遗传多样性研究，发现自育品种SSR相似系数比国外品种高，各棉区衍生品种相似性与该区基础种质的相似性一致，黄河流域棉区多样性低于长江流域。刘勤红等(2005)筛选出了能够鉴别抗虫杂交棉鲁研棉15号杂交种纯度的SSR标记位点。孙东磊(2006)对彩色棉和棕色棉SSR多样性分析发现棕色棉的遗传多样性高于绿色棉。SSR技术是一种必要的棉花种质资源遗传多样性研究工具，它具有建立品种的指纹图谱和分子身份证的潜在优势，并且在分子水平上为育种者选择性状遗传稳定、品质抗性优良的种质提供理论依据，许多育种工作者已将该方法应用于棉花种质资源遗传多样性评价和杂交种纯度鉴定上。
DNA指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱，它是建立在DNA分子标记的基础之上的。DNA指纹图谱是鉴别品种、品系(含杂交亲本、自交系)的有力工具，具有快速、准确等优点。2003年，马轩等用SSR技术建立了18个彩色棉品系的DNA指纹图谱，建立了一种快速准确鉴定彩色棉品种的方法。2005年，新疆农业大学秦利等从筛选出的10对多态性好的引物中随机挑选了2对，对当前新疆主栽品种进行了指纹图谱构建和杂交种纯度鉴定，可将3个杂交种与它们的亲本加以区分，可以用于杂交种的分子鉴定和种子纯度检测。2006年，艾呈祥等从筛选出的10对扩增产物具有稳定多态性的引物中选出7对构建了2个甜瓜杂交种的指纹图谱，分析表明用SSR技术进行甜瓜杂交种纯度的鉴定是可行有效的。2007年，郭海林等从45对Xgwm系列SSR引物中筛选出2对产物清晰、稳定的引物，建立了11个结缕草优良品系的DNA指纹图谱，将三个优良品系与形态上相似的主栽品种区别开。但是，指纹图谱都是建立在有限的品种或种质的指纹图谱，构建的指纹图谱所用的PCR扩增的引物较少，目前，在植物中，开展的分子标记和分子指纹往往存在随着品种群体的增大，分子指纹码可能会出现重码等问题，也没有解决建立的指纹图谱是否具有该品种的特异性、构建的指纹图谱鉴别具有完全相同的指纹图谱两个品种的、具有相同的表现型和相同的生物学功能的两个不同指纹图谱的品种的问题。
目前SSR仅作为分子标记而被广泛应用于图谱构建、品种鉴定和遗传多样性分析，对其丰度的研究也仅限于在某一基因组数据或文库中进行SSR搜索和比较分析，还不能建立起对不同基因型品种的比较研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以精确鉴别品种间及种内差异的SSR分子指纹鉴定方法。
本发明的一种SSR分子指纹鉴定方法，通过筛选SSR引物对DNA进行扩增，建立指纹图谱，进行SSR丰度统计，其中SSR丰度统计方法为：对等位基因片段的简单重复序列丰度进行赋值，确定其丰度数；对所考察的SSR位点的丰度数求和，即得品种的SSR丰度值。SSR丰度值表示简单重复序列类型和数量在不同品种间的丰富程度，从基因组水平反映了不同种质DNA重复序列的差异。
本发明所述的SSR丰度统计的方法为：以0.2为等差从小到大对等位基因片段的简单重复序列丰度进行赋值，确定其丰度数；对所考察SSR位点的丰度数求和，即为某一种质的SSR丰度值。以0.2为等差的选择是基于考虑到各等位基因分子量大小的差别，需要对各等位基因进行分级赋值，由于相邻等位基因的重复拷贝数通常相差2-3，变幅较小。
本发明所述的SSR丰度统计的具体方法为：设定某一品种的第I个SSR位点的第1个等位基因丰度数为1，第2到第J个等位基因的丰度数分别为Aij＝1+0.2(J-1)，品种的丰度值D＝∑Aij，D为品种的所有SSR位点各等位基因的丰度数之和，Aij为第I个SSR位点第J个等位基因的丰度数，I为SSR位点数，J为等位基因数。利用丰度值以达到完全区分和鉴定供试品种的目的。
本发明所述的建立指纹图谱的方法是：根据SSR分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据，有带记为1，无带记为0，绘制SSR的01指纹图谱。
本发明所述的SSR引物要求为品种间多样性好、丰度高的引物，对于棉花而言，SSR引物要求为每对引物在96个品种间，最好能区别10多个品种，而且丰度高的SSR引物作为指纹鉴别的核心引物。
所述的SSR分子指纹鉴定方法可用于棉花品种间的鉴定，筛选因为的方法为：筛选不同类型的SSR引物，合成不同类型的棉花SSR引物6000多对，筛选出品种间多样性好的引物对、丰度高的130对引物，而且分布于A和D染色体组的26对染色体上的130对引物，平均每对染色体3-5对引物，作为构建棉花SSR分子指纹图谱的核心引物。
所述SSR分子指纹鉴定方法也适用于如小麦、玉米、水稻等品种间的鉴定。
本发明所述的棉花SSR引物是能覆盖整个棉花基因组的SSR引物对，均匀分布于棉花基因组所有染色体。针对分子指纹代码数字繁多，很难通过眼观马上就获得各品种的差异信息。为此，我们除了给予每个品种赋予分子指纹代码外，建立了一种计算各个品种的SSR分子丰度统计方法。其基本原理是：根据SSR位点不同和等位基因片段的重复拷贝数不同，并且随着PCR产物大小的增加而增加，建立不同基因型个体间的重复序列丰度统计方法。
本发明的一种SSR分子指纹鉴定方法的有益效果：第一，筛选和鉴定足够多的SSR引物对，而且它们的多样性好，均匀分布于棉花基因组所有染色体，避免随着品种群体的增大，分子指纹出现重码，保证了每个品种或品种特有的分子特征，可以作为区别其它指纹的每个品种的身份证。第二，除了绘制各个品种的SSR分子指纹图谱外，结合各自的品种的所考察的SSR位点的SSR丰度值，则可以达到完全区分和鉴定供试品种的目的。采用本发明SSR分子指纹鉴定方法可以大量区分不同类型的品种，具有快捷高效、灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点，该方法适用于棉花品种遗传鉴定、新品种保护、区域试验和品种纯度鉴定等方面。
附图说明
图1是SSR丰度统计方法示意图。
其中：Allele1(170bp)、Allele2(164bp)、Allele3(158bp)分别为某一SSR位点的等位基因片段；a、b、c分别为三个不同品种；I：等位基因片段的核心序列及串联重复拷贝数；II：该SSR位点在三个品种中的PCR扩增带型；III：每个等位基因片段的SSR丰度数及不同品种在此SSR位点上具有的简单重复序列丰度值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
选用96个四大棉种的具有代表性的不同品种作为试验的棉花品种，如表1所示。
表1  试验的棉花品种及其编号
    No.     品种名称   特性   No.     品种名称     特性
    1     临泽草棉   草棉   49     石系亚黑子     亚洲棉
    2     褐子草棉   草棉   50     肖山白子     亚洲棉
    3     金塔草棉   草棉   51     肖山黑子     亚洲棉
    4     石系亚1号   亚洲棉   52     印度N.V507     亚洲棉
    5     遂宁中棉光子   亚洲棉   53     印度N.V508     亚洲棉
    6     遂宁中棉毛子   亚洲棉   54     云南黄绒土棉     亚洲棉
    7     7124   海岛棉   55     紫茎中棉     亚洲棉
    8     7125   海岛棉   56     新海18号     海岛棉
    9     E24-3389   海岛棉   57     吉扎45     海岛棉
    10     军海1号   海岛棉   58     引字6022     海岛棉
    11     新库K106   海岛棉   59     大铃棉1号     中大铃
    12     德保巴头大棉   退化   60     大铃棉69号     中大铃
    13     南丹巴地大花   退化   61     大铃启东     中大铃
    14     库车96486   感黄萎   62     大桃棉(豫)     大铃
    15     石河子875   感黄萎   63     反帝大桃     中大铃
    16     Arcot-1   抗黄萎   64     湖北枣阳     中大铃
    17     常抗棉   抗黄萎   65     梅福大铃     中大铃
    18     中36   早熟   66     襄汾大铃     大铃
    19     中棉所27   早熟   67     赵岗大桃棉     中大铃
    20     阿肯色971   中熟   68     冀棉11     感黄萎
    21     中12  901系   中熟   69     豫棉2067     抗黄萎
    22     LAPAR45   晚熟   70     春矮早     早熟
    23     赞比亚棉   晚熟   71     中37     早熟
    24     Acala①   优质大铃   72     ST474     中熟
    25     FJA   优质大铃   73     中棉所35     中熟
    26     PD3249   优质   74     HG-BR-8     晚熟
    27     爱字棉927   优质大铃   75     MCU-5     晚熟
    28     大铃棉(喀)   大铃   76     PAR-51     晚熟
    29     松滋大铃   大铃   77     Sudan2     晚熟
    30     越南大桃   中大铃   78     巴西合作社棉     晚熟
    31     TM-1   标准系   79     非洲E40     晚熟
    32     3-79     标准系     80     乍得棉     晚熟
    33     东兰那亨大花     退化     81     中AR40772     优质大铃
    34     富川湿坝大花     退化     82     Acala1517-2     一般品质
    35     桂平康连大花     退化     83     Acala1517-70     一般品质
    36     河北清苑樊庄乡洋棉     退化     84     Acala1517-77     优质大铃
37 交力大花 退化 85     DPLcamd215-7-801 一般品质
    38     临沂中山庄小棉花     退化     86     Hopical     优质大铃
    39     罗甸铁籽棉     退化     87     IRMA96+97     优质
    40     纳上区大花     退化     88     Line F     优质
    41     南丹怀里大花     退化     89     sicala34     优质
    42     平果果化大棉     退化     90     UA887(优)     大铃优质
    43     平果那沙大棉     退化     91     upland     优质大铃
    44     三江八江大花     退化     92     贝尔斯诺     一般品质
    45     三江大花     退化     93     川77-1     一般品质
    46     凸桥大花     退化     94     岱字棉55     优质大铃
    47     青茎中棉墨子     亚洲棉     95     苏联8908     一般品质
    48     石系亚白子     亚洲棉     96     苏联棉85系     优质
本实施例所用的96个棉花品种来自国家棉花种质库，也可以市购得到。
DNA提取：
棉花富含棉酚、多糖、单宁等物质，在细胞破碎时，棉酚等多酚类物质自动氧化，然后跟蛋白质、核酸等发生不可逆反应，结果形成棕色胶状复合物，影响高质量DNA的获取。因此，我们采用CTAB法提取棉花gDNA，参照参照Zhang和James(2000)方法，并略有改进。
(1)称取3克新鲜棉花叶片于研钵中，加入液氮并迅速研磨成粉末，转移至离心管中并加入15ml提取缓冲液，摇匀，4℃下2700rpm离心15min；
(2)倒出上清液，在管中加入15ml的65℃的CTAB裂解缓冲液，混匀后置于65℃水浴40～60min，每隔10min混匀一次，使样品充分散开；
(3)水浴后，取出离心管，向管中加入15ml的体积比为氯仿∶异戊醇＝24∶1的氯仿和异戊醇的混合液，反复颠倒混合至不分层为止，并不断释放出反应产生的气体，16℃下4000rpm离心15min；
(4)吸取上清至新的离心管中，按步骤(3)重复抽提一次；
(5)吸取上清至新的离心管中，加入0.6倍体积的冰冻异丙醇，缓慢摇匀至沉淀析出，-20℃下放置30min以上；
(6)25℃下10000rpm离心5min，将沉淀转入离心管，加入70％乙醇洗至脱色，换无水乙醇洗一遍，尽可能倒干净乙醇，风干45min，在DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用2ml的TE(pH8.0)溶解，于65℃温育，至DNA完全溶解；
(7)按照10ug Rnase A/100 ulDNA比例加入无DNA的RNA酶，37℃水浴1h，加入等体积的体积比为氯仿∶异戊醇＝24∶1的氯仿和异戊醇的混合液，混合40次，25℃下10000rpm离心15min；
(8)吸取上清液，加入2倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3M pH5.2的醋酸钠，缓慢摇匀至沉淀析出，-20℃下放置30min以上；取出DNA沉淀，用70％的乙醇洗至无色，用无水乙醇洗一遍，尽可能倒干净乙醇，风干45min，在DNA沉淀仍有些潮湿的时候，用1mlTE溶解，即得模板DNA。
筛选SSR引物：SSR引物下载于Cotton microsatellite database(http://www.cottonmarker.org/)，包括由Brookhaven National Lab开发的BNL引物，南京农业大学开发的NAU引物，CIRAD开发的CIR引物，TAMU College station开发的JESPR引物和由USDA-ARS开发的MGHES引物。根据上述的引物合成6030对引物，筛选出在陆地棉品种间多样性好的引物对，每对引物在96个品种间，能区别10多个品种，并在此基础上筛选出丰度高，而且，分布于A和D染色体组的26对染色体上的130对引物，平均每个染色体5对引物，用于构建棉花指纹图谱的核心引物，130对引物对应的SSR如表2所示。表2中的所有SSR的序列本身来自于公开的网络资源。130对引物序列也可在Cotton microsatellite database(http://www.cottonmarker.org/)查到。
PCR扩增的条件：利用核心引物，进行PCR扩增，PCR反应在PTC-100TM下运行，PCR反应体系及扩增程序见表3、4。每对SSR引物具有特定的退火温度，PCR扩增程序可根据引物实际Tm值设定。
表2  用于棉花SSR分子指纹鉴定的SSR
SSR名称 所在染色体  SSR名称 所在染色体 SSR名称 所在染色体
NAU2798 C01  JES208 C09，23 NAU3685 C18
NAU4891 C01  BNL1672 C09，C23 BNL3254 C18
BNL2921 C01 BNL2960 C10 BNL2652 C18，C13，C10，C20
BNL2440 C01，C15 BNL3563 C10 BNL0193 C18，LG05，C12
CIR009 C01，C15  NAU0440 C10 DPL0071 C19
DPL0046 C02  NAU0620 C10 DPL0417 C19
NAU2343 C02  TMB0323 C10 NAU2629 C19
CIR184 C02  DPL0253 C11 NAU3092 C19
NAU0680 C02  NAU3748 C11/C21 NAU3139 C19
CIR381 C02，C14  NAU0462 C11/LGA03 NAU1169 C20
CIR332 C03  NAU2504 C11/LGA03 BNL0169 C20
NAU2277 C03  TMB1692 C11/LGA03 CIR166 C20
NAU0622 C03  DPL0594 c12 NAU0740 C20
NAU1190 C03  BNL0598 C12 BNL3482 C20，C26，C12
NAU1248 C03  NAU0736 C12 DPL0475 C21
DPL0494 C04  TMB0325 C12 DPL0777 C21
NAU3205 C04  CIR272 C12，C26 NAU3156 C21
CIR249 C04  DPL0635 C13 NAU3493 C21
BNL0632 C04  NAU3468 C13 NAU3895 C21
NAU1158 C04  NAU0640 C13/LGA01 DPL0489 C22
NAU934 C05  TMB0400 C13/LGA01 NAU2634 C22
BNL1053 C05  BNL2449 C13/LGA01，LG40，C10 BNL0448 C22
NAU0445 C05  NAU2929 C14 BNL4030 C22，C05
NAU2443 C05 NAU5467 C14 BNL1045 C22，C26，C03，C12
JESPR65 C05，07  NAU0358 C14 DPL0378 C23
NAU0732 C06  NAU998 C14 NAU4079 C23
NAU905 C06，25  BNL1059 C14，LG16，LGD05，C03 JES114 C23
BNL3955 C06，C17，C22  DPL0264 C15 BNL0597 C23
NAU2363 C06，C25  NAU3347 C15 TMB0380 C23
CIR167 C06，C26  NAU3901 C15 DPL0202 C24
DPL0448 C07  BNL0786 C15 DPL0461 C24
NAU1048 C07  BNL3090 C15，C01 NAU2926 C24
NAU1362 C07  NAU3053 C16 AU3904 C24
NAU1222 C07  NAU3678 C16 NAU5335 C24
NAU4030 C07/C16  NAU4956 C16 DPL0323 C25
DPL0220 C08  JES102 C16 JES227 C25
BNL1017 C08/LGA02  BNL1551 C16，LG02，C05 TMB0312 C25
BNL3556 C08/LGA02  DPL0405 C17 BNL0827 C25
NAU0569 C08/LGA02  NAU2898 C17 TMB0429 C25
NAU0641 C08/LGA02  NAU1028 C17 DPL0665 C26
BNL2655 C09  BNL0834 C17 CIR391 C26
NAU0414 C09  NAU0889 C17 NAU0663 C26
TMB1701 C09  NAU3589 C18 NAU2302 C26
BNL0840 C26(LG25)
表3  PCR反应体系
    PCR反应试剂     终浓度     用量
    ddH2O     -     6.40μL
    10×PCRbuffer(含20mM Mg2+)     1×     1.00μL
    dNTP(10mM)     0.5mM     0.50μL
    Taq DNA聚合酶(5U/μL)     0.05U/μL     0.10μL
    F.P(5μM)     0.5μM     1.00μL
    R.P(5μM)     0.5μM     1.00μL
    模板DNA(30ng/μL)     3.0ng/μL     1.00μL
表4  SSR PCR扩增程序
    步骤     作用   温度     时间   备注
    Step1     预变性   95℃     3min
    Step2     变性   95℃     50s
    Step3     退火   55℃     45s
    Step4     延伸   72℃     50s
    Step5     循环 从步骤(2)开始循环29次
    Step6     延伸   72℃   7min
    Step7     保存   4℃   至取出
扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离PCR扩增产物，硝酸银银染后，根据各SSR分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据，有带记为1，无带记为0，绘制棉花01指纹图谱。
根据96个棉花品种的01指纹图谱，以0.2为等差从小到大对等位基因片段的简单重复序列丰度进行赋值，方法如图1所示，对所考察SSR位点的丰度数求和即为某一棉花品种的SSR丰度值。本实施例以96个品种第3个SSR位点为例列举计算SSR丰度值，首先，确定96个品种在3个位点的01指纹图谱，见表5。然后，根据PCR扩增片段从小到大的排列，对各等位基因进行等差赋值，从而得到96个品种在3个位点上各等位基因的丰度数，结果见表6和表7。最后，对各个位点的等位基因丰度数求和，则可得到96个棉花品种的SSR丰度值，结果见表8。如果考察的SSR位点数足够多，则可以完全把96个棉花品种的区分开。
表5  96个品种在3个位点的01指纹图谱
品种代码  BNL193-1  BNL193-2  BNL193-3  BNL193-4  BNL193-5  BNL193-6  BNL193-7  BNL193-8  BNL193-9  BNL193-10  BNL193-11  BNL193-12  BNL2449-1  BNL2449-2  BNL2449-3  BNL2449-4  BNL2449-5  BNL2449-6  BNL2449-7  BNL2449-8  NAU998-1  NAU998-2  NAU998-3  NAU998-4  NAU998-5  NAU998-6  NAU998-7  NAU998-8
 1  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  1  1  0  0
 2  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  1  1  0  0
 3  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  1  1  0  0
 4  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  1  1  0  0
 5  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  1  1  0  0
 6  0  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  1  1  0  0
 7  0  0  1  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  0  1  1  1
 8  0  0  1  0  1  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1  0  1  0  1  0  1  0  0  1  0  1  1  1
Figure S2007101771410D00111
Figure S2007101771410D00121
表6  96份品种在1个位点上各等位基因的丰度数
品种代码  BNL193-1  BNL193-2  BNL193-3  BNL193-4  BNL193-5  BNL193-6  BNL193-7  BNL193-8  BNL193-9  BNL193-10  BNL193-11  BNL193-12  A1j
 1  0  0  1.4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1.4
 2  0  0  1.4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1.4
 3  0  0  1 4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1.4
 4  0  0  1.4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1.4
 5  0  0  1.4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1.4
 6  0  0  1.4  0  0  0  0  0  0  0  0  0  1.4
 7  0  0  1.4  0  1.8  0  0  0  0  0  0  0  3.2
 8  0  0  1.4  0  1.8  0  0  0  0  0  0  0  3.2
 9  0  0  1.4  0  1.8  0  0  0  0  0  0  0  3.2
 10  0  0  1.4  0  1.8  0  0  0  0  0  0  0  3.2
 11  0  0  1.4  0  1.8  0  0  0  0  0  0  0  3.2
 12  1  0  1.4  1.6  0  0  0  0  0  0  3  3.2  10.2
 13  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 14  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 15  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 16  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 17  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 18  0  0  1.4  0  0  2  2.2  0  0  0  0  0  5.6
 19  0  0  1.4  0  0  2  2.2  0  0  0  0  0  5.6
 20  1  0  1.4  1.6  0  0  2.2  2.4  2.6  2.8  3  3.2  20.2
 21  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 22  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 23  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 24  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 25  1  0  1.4  1.6  0  0  2.2  2.4  2.6  2.8  3  3.2  20.2
 26  1  0  1.4  1.6  0  0  2.2  2.4  2.6  2.8  3  3.2  20.2
 27  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 28  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 29  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 30  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 31  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 32  0  0  1.4  0  1.8  0  0  0  0  0  0  0  3.2
 33  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 34  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 35  1  0  1.4  1.6  0  0  0  0  0  0  3  3.2  10.2
 36  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 37  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 38  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 39  1  0  1.4  1.6  0  0  2.2  2.4  2.6  2.8  3  3.2  20.2
 40  0  0  1.4  1.6  0  0  2.2  0  0  2.8  0  0  8
 41  0  0  1.4  0  0  2  2.2  0  0  0  0  0  5.6
 42  0  0  1.4  0  0  2  2.2  0  0  0  0  0  5.6
 43  1  0  1.4  1.6  0  0  0  0  0  0  3  3.2  10.2
Figure S2007101771410D00141
Figure S2007101771410D00151
表7 96份品种2个位点上等位基因的丰度数
Figure S2007101771410D00152
Figure S2007101771410D00161
  83   0   0   0   1.6   0   2   0   2.4   6   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  84   0   0   0   1.6   0   2   0   2.4   6   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  85   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  86   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  87   0   0   0   1.6   0   2   0   2.4   6   1   1.2   1.4   0   0   0   0   0   3.6
  88   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   1.4   0   0   0   0   0   3.6
  89   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  90   0   0   0   1.6   0   2   0   2.4   6   1   0   1.4   0   0   0   0   0   2.4
  91   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  92   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   1.4   0   0   0   0   0   3.6
  93   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  94   0   1.2   0   1.6   0   2   0   0   4.8   1   0   1.4   0   0   0   0   0   2.4
  95   0   0   0   1.6   0   2   0   2.4   6   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
  96   0   0   0   1.6   0   2   0   2.4   6   1   1.2   0   0   0   0   0   0   2.2
表8  96个品种在3个位点上的丰度值
  品种代码   第1位点   第2位点   第3位点   丰度值
  A1j   A2j   A3j   D
  1   1.4   5.4   6.4   13.2
  2   1.4   5.4   6.4   13.2
  3   1.4   5.4   6.4   13.2
  4   1.4   5.4   6.4   13.2
  5   1.4   5.4   6.4   13.2
  6   1.4   5.4   6.4   13.2
  7   3.2   5.4   9.2   17.8
  8   3.2   5.4   9.2   17.8
  9   3.2   5.4   9.2   17.8
  10   3.2   5.4   9.2   17.8
  11   3.2   5.4   9.2   17.8
  12   10.2   4.8   2.4   17.4
  13   8   4.8   2.2   15
  14   8   6   2.2   16.2
  15   8   5.8   2.4   16.2
  16   8   7.2   2.4   17.6
  17   8   7.2   2.2   17.4
  18   5.6   7.2   2.2   15
  19   5.6   7.2   2.2   15
  20   20.2   4.8   3.6   28.6
  21   8   6   2.4   16.4
  22   8   6   3.6   17.6
  23   8   8.2   2.4   18.6
  24   8   4.8   2.2   15
  25   20.2   4.8   3.6   28.6
  26   20.2   4.8   3.6   28.6
27 8 4.8 3.6 16.4
28 8 6 2.2 16.2
29 8 4.8 2.2 15
30 8 4.8 2.2 15
31 8 4.8 2.2 15
32 3.2 5.4 9.2 17.8
33 8 4.8 1.2 14
34 8 6 2.4 16.4
35 10.2 4.8 2.4 17.4
36 8 7.2 3.6 18.8
37 8 4.8 2.2 15
38 8 6 3.6 17.6
39 20.2 6 3.6 29.8
40 8 4.8 3.6 16.4
41 5.6 4.8 2.4 12.8
42 5.6 4.8 3.6 14
43 10.2 4.8 2.2 17.2
44 8 6 2.4 16.4
45 8 4.8 2.4 15.2
46 8 4.8 1.2 14
47 1.4 5.4 6.4 13.2
48 1.4 5.4 6.4 13.2
49 1.4 5.4 6.4 13.2
50 1.4 5.4 6.4 13.2
51 1.4 5.4 6.4 13.2
52 1.4 5.4 6.4 13.2
53 1.4 5.4 6.4 13.2
54 1.4 5.4 6.4 13.2
55 1.4 5.4 6.4 13.2
56 3.2 5.4 9.2 17.8
57 3.2 5.4 9.2 17.8
58 3.2 5.4 9.2 17.8
59 8 6 3.6 17.6
60 8 4.8 2.2 15
61 9.2 4.8 2.2 16.2
62 8 4.8 2.2 15
63 8 6 3.6 17.6
64 5.6 4.8 2.2 12.6
65 20.2 4.8 3.6 28.6
66 9.2 6 2.2 17.4
67 8 0 2.2 10.2
68 8 0 2.2 10.2
69 8 6 2.4 16.4
70 8 5.8 2.2 16
71 5.6 4.8 2.4 12.8
72 8 4.8 2.4 15.2
73 9.2 6 2.4 17.6
74 8 4.8 2.2 15
75 8 6 2.2 16.2
76 5.6 4.8 2.4 12.8
77 8 5.8 1.2 15
78 8 4.8 3.6 16.4
79 8 6 3.6 17.6
80 5.6 4.8 1.2 11.6
81 8 6 2.2 16.2
82 8 6 1.2 15.2
83 8 6 2.2 16.2
84 8 6 2.2 16.2
85 8 4.8 2.2 15
86 8 4.8 2.2 15
87 8 6 3.6 17.6
88 8 4.8 3.6 16.4
89 0 4.8 2.2 7
90 10.2 6 2.4 18.6
91 8 4.8 2.2 15
92 8 4.8 3.6 16.4
93 8 4.8 2.2 15
94 20.2 4.8 2.4 27.4
95 8 6 2.2 16.2
96 8 6 2.2 16.2

Claims (1)

1.一种SSR分子指纹鉴定方法，通过筛选SSR引物对DNA进行扩增，建立指纹图谱，进行SSR丰度统计，其中SSR丰度统计方法为：设定某一品种的第I个SSR位点的第1个等位基因丰度数为1，第2到第J个等位基因的丰度数分别为Aij＝1+0.2(J-1)，品种的丰度值D＝∑Aij，D为品种的所有SSR位点各等位基因的丰度数之和，Aij为第I个SSR位点第J个等位基因的丰度数，I为SSR位点数，J为等位基因数；所述的品种为棉花品种；
所述的建立指纹图谱的方法是：根据SSR分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元数据，有带记为1，无带记为0，绘制SSR的01指纹图谱；
所述筛选SSR引物的方法为：选用不同类型的引物，合成棉花SSR引物，筛选130个SSR引物对，分布于A和D染色体组的26对染色体上，平均每对染色体3～5对引物，作为构建棉花指纹图谱的核心引物，所述的130对引物对应的SSR如下表所示：
Figure FSB00000578025700011
Figure FSB00000578025700021
Figure FSB00000578025700031
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Date Code Title Description
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Assignee: Anhui Royee Seed Co., Ltd.

Assignor: Institute of Cotton Chinese Academy of Agricultural Science

Contract record no.: 2012340000018

Denomination of invention: SSR numerator fingerprint identification method

Granted publication date: 20111207

License type: Exclusive License

Open date: 20090513

Record date: 20120315

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
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Granted publication date: 20111207

Termination date: 20191109