CN108570513B - 用于构建陆地棉品种指纹图谱的ssr引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物及其应用，属于陆地棉品种的分子生物学鉴定领域。本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本对所设计引物的扩增效果进行筛选，结果其中有106对引物具有差异效果。本发明进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种的特异指纹图谱或构建国审陆地棉品种分子身份证。本发明还公开了所述的SSR引物在构建陆地棉品种分子身份证或者构建陆地棉品种指纹图谱中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及用于构建陆地棉棉花品种指纹图谱的SSR引物，还涉及所述SSR引物在建立陆地棉花棉品种分子身份证或指纹图谱中的应用，属于陆地棉品种的分子生物学鉴定领域。
背景技术
目前，每年申请参加黄河、长江及西北内陆三大流域国家审定的陆地棉新品种(系)多达上百个。很多新品种特别是同一地方选育出来的新品种(系)，大多利用少数优良常规品种作为亲本，品种的遗传基础相对狭窄；因此，利用形态特征、生理特性等来鉴定品种的纯度和真伪较为困难。基于此，近年来，棉种市场上F2代冒充F1代杂种，或者在F1代杂种中掺有大量亲本种子的事实不断出现，使棉农蒙受损失。如何鉴别棉种的真伪、品种纯度成为一个亟待解决的问题。
DNA分子标记的出现和快速发展，为棉花品种的准确鉴定提供了一种新的技术手段。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记具有数量丰富、共显性遗传、信息含量高、分析方法简单、结果重现性好等优点，使其成为构建品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于大豆、玉米、小麦、水稻、棉花等作物中。以此方法构建品种的分子指纹图谱、鉴别品种的真伪和纯度，对种子产业化和品种的知识产权保护有重大意义。但这种方法存在成本偏高、耗时、且一次检测位点较为有限等不足。因此，开发一种快速构建国家审定的陆地棉品种分子身份证或指纹图谱的方法，具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的SSR引物在构建陆地棉品种分子身份证或者指纹图谱中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行SSR引物的设计，并根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得268对引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物(表现形式主要以条带长度不一致)，在总引物中占据了40％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。
本发明进一步通过对中棉所6个杂交种样本进行SSR扩增反应，对上述106对引物在12个亲本品种中具有差异效果的特异SSR标记进行筛选。最终，本发明从上述106对具有疑似差异扩增效果的引物中，选择出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种的特异指纹图谱或国审陆地棉品种分子身份证。
本发明所述的15对核心SSR引物及一对Bt基因特异引物，包括：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对1(即引物M003)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的下游引物组成的引物对2(即引物M006)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的下游引物组成的引物对3(即引物M009)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的下游引物组成的引物对4(即引物M017)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的下游引物组成的引物对5(即引物M036)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.12所示的下游引物组成的引物对6(即引物M037)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的下游引物组成的引物对7(即引物M068)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的下游引物组成的引物对8(即引物M077)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.18所示的下游引物组成的引物对9(即引物M084)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.20所示的下游引物组成的引物对10(即引物Q024)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.22所示的下游引物组成的引物对11(即引物Q042)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.24所示的下游引物组成的引物对12(即引物Q055)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.26所示的下游引物组成的引物对13(即引物Q076)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.28所示的下游引物组成的引物对14(即引物Q129)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.30所示的下游引物组成的引物对15(即引物Q178)；以及，
由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.32所示的下游引物组成的引物对16(即Bt基因特异引物)。
本发明进一步公开了所述的SSR引物在构建陆地棉品种分子身份证中的应用。
本发明进一步公开了所述的SSR引物在构建陆地棉品种指纹图谱中的应用。
本发明所述陆地棉品种包括：中棉所72父本、中棉所72母本、中棉所75父本、中棉所75母本、中棉所63父本、中棉所63母本、中棉所48父本、中棉所48母本、中棉所52父本、中棉所52母本、中棉所59父本或中棉所59母本中的任意一种或多种。
本发明还公开了一种陆地棉品种指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取待检测棉花品种的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，以本发明所述16对SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建得到棉花品种的DNA指纹图谱。
优选的，步骤(3)按照引物对1(即M003)、引物对2(即M006)、引物对3(即M009)、引物对4(即M017)、引物对5(即M036)、引物对6(即M037)、引物对7(即M068)、引物对8(即M077)、引物对9(即M084)、引物对10(即Q024)、引物对11(即Q042)、引物对12(即Q055)、引物对13(即Q076)、引物对14(即Q129)、引物对15(即Q178)、引物对16(即Bt基因特异引物)的固定排列顺序，通过凝胶电泳结果，依次记录每个棉花品种经每对SSR引物扩增出现的条带类型，依据各个条带类型所赋予的数字，形成带型数字编号，即为该棉花品种的DNA指纹图谱。
本发明条带类型数据分析表示如下：1表示母本P1带型；2表示父本P2带型；3表示共显性带型，4表示新发现的其他类型的带型，以后发现的新带型依次记录为“5、6、……”。
本发明利用16对SSR核心引物所能够扩增出的各种条带类型及其相应的数字代号，具体见说明书附图图109-110；在构建指纹图谱过程中，如果在SSR引物扩增的条带类型上发现杂合位点，不应该给其赋予数值，而以“/”表示。
本发明棉花品种指纹图谱的构建方法，参考刘逢举等2012年的指纹图谱构建方法(刘逢举，王冰，杨付新.中棉所系列棉花杂交种12个亲本的SSR指纹图谱构建与应用[C].中国棉花学会2012年年会论文汇编.安阳：中国棉花杂志社，2012：58-61)。
本发明还公开了一种陆地棉品种分子身份证的构建方法，包括以下步骤：(1)提取待检测棉花品种的基因组DNA；(2)以提取的DNA为模板，以本发明所述16对SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建棉花品种的DNA指纹图谱信息编码；(4)将棉花品种的DNA指纹图谱信息编码(含可能具有的特异基因信息，即特殊商品信息)，再结合棉花品种的基本商品信息一同编码，构建国家审定棉花品种的分子身份证。
其中，步骤(3)构建棉花品种的DNA指纹图谱信息编码的方法同本发明所述陆地棉品种指纹图谱的构建方法。进一步的，步骤(4)所述分子身份证依次包括：棉花品种的基本商品信息、DNA指纹图谱信息编码(含可能具有的特殊商品信息)。更进一步的，所述基本商品信息包括：棉属分类、栽培棉与野生棉分类、栽培棉种的分类、棉花品种熟性、棉花品种类别、品种参试的区域、国审品种与否和首次审定的年份；所述特殊商品信息为转Bt基因品种与否。进一步的，所述分子身份证的前11位分别表示“棉属分类、栽培棉与野生棉分类、栽培棉种的分类、棉花品种熟性、棉花品种类别、品种参试的区域、国审品种与否、首次审定的年份”，最后1位表示“转Bt基因品种与否”。
本发明所述基本商品信息的数字代码包括：棉属分类中，1表示棉属；栽培棉与野生棉分类中，1表示栽培棉、2表示野生棉；栽培棉种的分类中，1表示陆地棉、2表示海岛棉；棉花品种熟性中，1表示早熟品种、2表示中早熟品种、3表示中熟品种；棉花品种类别中，1表示常规棉、2表示杂交棉；品种参试的区域中，1表示黄河流域、2表示长江流域、3表示西北内陆；国审品种与否中，1表示国审品种、0表示非国审品种；首次审定的年份，直接以首次审定的年份数字表示即可；所述特殊商品信息中，1表示转Bt基因品种、0表示非转Bt基因品种。具体的，棉花品种基本商品信息及特殊商品信息的数字代码及其含义，见说明书表9。
本发明所述的陆地棉品种指纹图谱的构建方法或陆地棉品种分子身份证的构建方法中，步骤(2)所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为10μL，其中，含Mg2+的10×PCRBuffer 1.0uL、2mM的dNTPs 0.3μL、5u/uL的Taq酶0.2μL、上游引物和下游引物各0.5μL、DNA模板1.0uL，ddH2O 6.5μl；
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min→[94℃30s→每对SSR引物的退火温度，45s→72℃60s]x30个循环→72℃，5min→4℃Forever；
其中，所述SSR引物的退火温度为：引物对1(即M003)的退火温度为55℃；引物对2(即M006)的退火温度为55℃；引物对3(即M009)的退火温度为57℃；引物对4(即M017)的退火温度为55℃；引物对5(即M036)的退火温度为55℃；引物对6(即M037)的退火温度为55℃；引物对7(即M068)的退火温度为55℃；引物对8(即M077)的退火温度为57℃；引物对9(即M084)的退火温度为55℃；引物对10(即Q024)的退火温度为55℃；引物对11(即Q042)的退火温度为57℃；引物对12(即Q055)的退火温度为59℃；引物对13(即Q076)的退火温度为57℃；引物对14(即Q129)的退火温度为57℃；引物对15(即Q178)的退火温度为55℃；引物对16(即Bt基因特异引物)的退火温度为57℃。
本发明还公开了所述的构建方法构建得到的陆地棉品种指纹图谱。优选的，所述的陆地棉品种指纹图谱包括：
中棉所72父本的指纹图谱为1121111112111111；
中棉所72母本的指纹图谱为1122222/12112121；
中棉所75父本的指纹图谱为2111111212211111；
中棉所75母本的指纹图谱为1122222211112121；
中棉所63父本的指纹图谱为112211211/212111；
中棉所63母本的指纹图谱为2111111111211111；
中棉所48父本的指纹图谱为1111111111112111；
中棉所48母本的指纹图谱为1211112221122111；
中棉所52父本的指纹图谱为2211112222121221；
中棉所52母本的指纹图谱为2121112111221111；
中棉所59父本的指纹图谱为/2111121/1111221；
中棉所59母本的指纹图谱为1122112112212111。
本发明利用16对核心SSR引物构建的12个棉花亲本品种的指纹图谱具体见说明书表8。
本发明还公开了所述的陆地棉品种分子身份证的构建方法构建得到的陆地棉品种分子身份证。
本发明将棉花品种的16位DNA指纹图谱编码信息(含可能具有的特异基因信息，即特殊商品信息)，再结合品种的11位基本商品信息，一同编码，构建27位的国家审定棉花品种的分子身份证。其中，B1(中棉所75父本)的分子身份证为“111211120022111111212211111”，F1(中棉所52父本)的分子身份证为“111211019982211112222121221”。
例如，以某一国审棉花品种的27位分子身份证“111111120071221212111212111”为例，前11位表示“棉属、栽培棉、陆地棉、早熟、常规棉、黄河流域、国审品种、2007年首次审定”，中间15位为该品种的DNA指纹信息，最后一位“1”表示“是转Bt基因品种”。
品种分子身份证二维码及条形码的生成：在数据转化器网址：http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode39.php中，输入27位分子身份证，可以即时生成二维码及条形码。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本对所设计引物的扩增效果进行筛选，结果其中有106对引物具有差异效果。本发明进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种的特异指纹图谱或构建国审陆地棉品种分子身份证。本发明所述的SSR引物应用于构建国家审定的陆地棉品种分子身份证或者构建陆地棉品种指纹图谱，能够快速的构建陆地棉品种分子身份证或指纹图谱，克服了以往形态、生理鉴定的技术缺陷。
附图说明
图1为SSR引物M001的PAGE凝胶电泳图；
图2为SSR引物M002的PAGE凝胶电泳图；
图3为SSR引物M003的PAGE凝胶电泳图；
图4为SSR引物M006的PAGE凝胶电泳图；
图5为SSR引物M007的PAGE凝胶电泳图；
图6为SSR引物M009的PAGE凝胶电泳图；其中在300-500bp处，A1、A2、B2、C1、F2、G2这6个样本扩增出两条稍靠下的条带，在其余6个样本中扩增出两条稍靠上的条带；
图7为SSR引物M013的PAGE凝胶电泳图；其中在300-400bp处，B1、D2、F1这3个样本均扩增出双条带；其余样本则无此条带，而是在500-600bp处扩增出一条亮带；
图8为SSR引物M014的PAGE凝胶电泳图；
图9为SSR引物M015的PAGE凝胶电泳图；其中在800-900bp处，C1、C2、F2、G1、G2这5个样本扩增出两条稍靠下的条带，在其余7个样本中扩增出两条稍靠上的条带；
图10为SSR引物M017的PAGE凝胶电泳图；
图11为SSR引物M018的PAGE凝胶电泳图；
图12为SSR引物M019的PAGE凝胶电泳图；
图13为SSR引物M021的PAGE凝胶电泳图；
图14为SSR引物M024的PAGE凝胶电泳图；
图15为SSR引物M025的PAGE凝胶电泳图；
图16为SSR引物M026的PAGE凝胶电泳图；
图17为SSR引物M027的PAGE凝胶电泳图；
图18为SSR引物M029的PAGE凝胶电泳图；
图19为SSR引物M030的PAGE凝胶电泳图；
图20为SSR引物M031的PAGE凝胶电泳图；
图21为SSR引物M033的PAGE凝胶电泳图；
图22为SSR引物M036的PAGE凝胶电泳图；
图23为SSR引物M037的PAGE凝胶电泳图；
图24为SSR引物M043的PAGE凝胶电泳图；
图25为SSR引物M046的PAGE凝胶电泳图；
图26为SSR引物M047的PAGE凝胶电泳图；
图27为SSR引物M052的PAGE凝胶电泳图；其中在450bp处，C1、F1、G2这3个样本扩增出一条亮带；其余样本则无此条带，而是在500bp处扩增出一条亮带；
图28为SSR引物M053的PAGE凝胶电泳图；
图29为SSR引物M059的PAGE凝胶电泳图；
图30为SSR引物M063的PAGE凝胶电泳图；
图31为SSR引物M066的PAGE凝胶电泳图；
图32为SSR引物M067的PAGE凝胶电泳图；
图33为SSR引物M068的PAGE凝胶电泳图；其中在1000bp处，A1、B1、C2、D1这4个样本扩增出一条亮带；其余样本则无此条带，而是在900bp处扩增出一条亮带；
图34为SSR引物M072的PAGE凝胶电泳图；
图35为SSR引物M075的PAGE凝胶电泳图；
图36为SSR引物M077的PAGE凝胶电泳图；
图37为SSR引物M078的PAGE凝胶电泳图；
图38为SSR引物M084的PAGE凝胶电泳图；其中在500-600bp处，样本D2、F1扩增出两条稍靠下的条带，在其余9个样本中扩增出两条稍靠上的条带；而样本G1在此处则扩增带型较乱；
图39为SSR引物Q001的PAGE凝胶电泳图；
图40为SSR引物Q004的PAGE凝胶电泳图；
图41为SSR引物Q007的PAGE凝胶电泳图；
图42为SSR引物Q008的PAGE凝胶电泳图；
图43为SSR引物Q014的PAGE凝胶电泳图；
图44为SSR引物Q019的PAGE凝胶电泳图；
图45为SSR引物Q024的PAGE凝胶电泳图；其中在500bp处，样本A1、A2、B1、F1、G2扩增出一条亮带；其余6个样本则无此条带，而是在600bp附近扩增出一条亮带；而样本C1在此处则扩增带型较乱；
图46为SSR引物Q027的PAGE凝胶电泳图；
图47为SSR引物Q031的PAGE凝胶电泳图；
图48为SSR引物Q032的PAGE凝胶电泳图；
图49为SSR引物Q035的PAGE凝胶电泳图；
图50为SSR引物Q040的PAGE凝胶电泳图；
图51为SSR引物Q041的PAGE凝胶电泳图；
图52为SSR引物Q042的PAGE凝胶电泳图；
图53为SSR引物Q043的PAGE凝胶电泳图；
图54为SSR引物Q044的PAGE凝胶电泳图；
图55为SSR引物Q048的PAGE凝胶电泳图；
图56为SSR引物Q050的PAGE凝胶电泳图；
图57为SSR引物Q055的PAGE凝胶电泳图；
图58为SSR引物Q059的PAGE凝胶电泳图；
图59为SSR引物Q064的PAGE凝胶电泳图；
图60为SSR引物Q071的PAGE凝胶电泳图；
图61为SSR引物Q072的PAGE凝胶电泳图；
图62为SSR引物Q075的PAGE凝胶电泳图；
图63为SSR引物Q076的PAGE凝胶电泳图；
图64为SSR引物Q079的PAGE凝胶电泳图；
图65为SSR引物Q082的PAGE凝胶电泳图；
图66为SSR引物Q084的PAGE凝胶电泳图；
图67为SSR引物Q089的PAGE凝胶电泳图；
图68为SSR引物Q091的PAGE凝胶电泳图；
图69为SSR引物Q095的PAGE凝胶电泳图；
图70为SSR引物Q098的PAGE凝胶电泳图；
图71为SSR引物Q101的PAGE凝胶电泳图；
图72为SSR引物Q103的PAGE凝胶电泳图；
图73为SSR引物Q104的PAGE凝胶电泳图；
图74为SSR引物Q106的PAGE凝胶电泳图；
图75为SSR引物Q110的PAGE凝胶电泳图；
图76为SSR引物Q115的PAGE凝胶电泳图；
图77为SSR引物Q116的PAGE凝胶电泳图；
图78为SSR引物Q117的PAGE凝胶电泳图；
图79为SSR引物Q125的PAGE凝胶电泳图；
图80为SSR引物Q126的PAGE凝胶电泳图；
图81为SSR引物Q129的PAGE凝胶电泳图；
图82为SSR引物Q130的PAGE凝胶电泳图；
图83为SSR引物Q132的PAGE凝胶电泳图；
图84为SSR引物Q134的PAGE凝胶电泳图；
图85为SSR引物Q135的PAGE凝胶电泳图；
图86为SSR引物Q137的PAGE凝胶电泳图；
图87为SSR引物Q138的PAGE凝胶电泳图；
图88为SSR引物Q140的PAGE凝胶电泳图；
图89为SSR引物Q141的PAGE凝胶电泳图；
图90为SSR引物Q146的PAGE凝胶电泳图；
图91为SSR引物Q147的PAGE凝胶电泳图；
图92为SSR引物Q149的PAGE凝胶电泳图；
图93为SSR引物Q156的PAGE凝胶电泳图；
图94为SSR引物Q157的PAGE凝胶电泳图；
图95为SSR引物Q160的PAGE凝胶电泳图；
图96为SSR引物Q161的PAGE凝胶电泳图；
图97为SSR引物Q164的PAGE凝胶电泳图；
图98为SSR引物Q166的PAGE凝胶电泳图；
图99为SSR引物Q167的PAGE凝胶电泳图；
图100为SSR引物Q172的PAGE凝胶电泳图；
图101为SSR引物Q174的PAGE凝胶电泳图；
图102为SSR引物Q176的PAGE凝胶电泳图；
图103为SSR引物Q178的PAGE凝胶电泳图；
图104为SSR引物Q179的PAGE凝胶电泳图；
图105为SSR引物Q182的PAGE凝胶电泳图；
图106为SSR引物Q184的PAGE凝胶电泳图；
图107为中棉所75父、母亲本(B1、B2)在引物M013上的扩增条带情况；其中，1-22为中棉所75父本(即B1)的22株单株，23-44为中棉所75母本(即B2)的22株单株(其中第一株DNA质量较差，没有跑出条带)；
图108为SSR引物M068检测中棉所75父、母亲本(B1、B2)的纯度；其中，1-22为中棉所75父本(即B1)的22株单株，23-44为中棉所75母本(即B2)的22株单株(其中第一株DNA质量较差，没有跑出条带)；
图109为利用SSR核心引物M003至引物Q042，所能够扩增出的各种条带类型结果及其相应的数字代号(图片每一引物最左方M为北京全式金生物技术有限公司所提供的100bpPlus DNA Ladder所显示的条带，共含有12条条带，由下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp)；
图110为利用SSR核心引物Q055至引物Q178以及Bt基因特异引物，所能够扩增出的各种条带类型结果及其相应的数字代号(图片每一引物最左方M为北京全式金生物技术有限公司所提供的100bp Plus DNA Ladder所显示的条带，共含有12条条带，由下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1用于构建国审陆地棉品种指纹图谱的SSR引物设计及筛选
1、材料与方法
1.1实验材料
实验材料及其来源见表1，材料采集均采用了当年新萌发种子的幼嫩叶片。
表1实验材料及来源
1.2实验方法
1.2.1基因组DNA的提取
取2小片鲜叶放入2ml的离心管中，加入700uL新鲜配制的DNA提取缓冲液(表2)，用MM-301型研磨仪磨碎，保存于-20℃的冰箱中备用。DNA提取是采用改良的CTAB法(Pa-terson,1993)。具体操作如下：(1)将样品解冻，10000rpm离心5min(4℃)，弃上清；(2)于沉淀中加入650uL的65℃预热的裂解缓冲液(表3)，震散样品，混匀，放65℃中水浴，每隔10分钟取出上下摇匀，40min后取出样品；(3)加入650uL氯仿:异戊醇(24:1)混合液，翻转50次左右，12000rpm离心10min(4℃)；(4)抽提上清转入1.5ml的离心管中，加2/3体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转50次，混匀，静置5min，等待DNA沉淀；(5)取1.5ml的空离心管，加入75％的乙醇约400uL；(6)取灭菌的200uL规格的枪头，挑取沉淀的DNA小团至空离心管中，清洗5分钟。如果DNA沉淀仍不干净，可以再如此清洗一次。(7)倒掉75％的乙醇，加100％的无水乙醇，沉淀DNA。(8)倒掉100％的无水乙醇，风干DNA样品；(9)加300-500uL的TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),pH 8.0)溶解DNA(4℃,30min以上)，并保存。
表2-3列出DNA的提取液和裂解缓冲液的浓度和配方。缓冲液清亮，很快变黄，室温可保存1-2周，用前加1/100体积的β-Me(巯基乙醇)，CTAB溶解要数小时。
表2DNA提取缓冲液
表3裂解缓冲液
| 工作液(终浓度) | ml | ml | 存储液 |
| 1.4M NaCl | 40.908(g) | 8.1816g(g) | NaCl(固体) |
| 0.1M Tris.HCl | 50 | 10 | 1.0M Tris.HCl(pH8.0) |
| 20mM Na.EDTA | 20 | 4 | 0.5M Na.EDTA(pH8.0) |
| 2％PVP | 10(g) | 2 | 10％PVP |
| 2％CTAB | 10(g) | 2 | 10％CTAB |
| 1％(V/V)β-Me | 5 | 1 | Liquid |
| dd Water | 425 | 85 | - |
| Total | 500 | 100 | - |
1.2.2 SSR-PCR扩增
1.2.2.1引物设计
本发明SSR引物的设计采用构建基因组文库，筛选物种的SSR位点，根据位点两侧的序列来设计引物，由之前GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行了SSR引物的设计，通过Primer 5.0软件完成引物的设计。根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得并合成了268对引物，引物具体情况见表4。由于本发明设计引物的来源大都为EST序列数据，故所用SSR标记大都属于EST-SSR标记。
表4合成的268对SSR引物具体情况表
1.2.2.2引物筛选
对于所合成的268对引物，本发明在实验最初阶段使用12个样本DNA(A1至G2)进行了预实验，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，筛选出106对为具有差异效果的引物。进一步通过对中棉所6个杂交种样本，对这106对引进行筛选。最终选择出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，再加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种的特异指纹图谱。
对于每对引物的退火温度，以其前后引物Tm值的均值作为中间梯度，上下各浮动1℃，以期获得较为合适的退火温度，并验证其具有良好的多态性。
1.2.2.3 SSR-PCR反应体系的优化
一个合适的SSR-PCR反应体系对于良好的实验结果的获得是必不可少的。根据本发明人实验室已有的实验基础，所采取的PCR反应体系在10μl反应体系中进行，具体反应体系见表5。
表5 PCR反应体系(10uL)
| 反应物 | 反应体积 |
| 10×PCR Buffer | 1.0uL |
| dNTPs 2mM | 0.3uL |
| P-F | 0.5uL(1.0uL) |
| P-R | 0.5uL(1.0uL) |
| Taq酶(5u/uL) | 0.2uL |
| 模板DNA | 1.0uL |
| ddH<sub>2</sub>O | 6.5uL |
所述PCR扩增的程序包括：95℃5min→[94℃30s→(每对引物的大致退火温度，另外上下浮动1℃，做3个梯度)，45s→72℃，60s]x30个循环→72℃，5min→4℃Forever。以此3个梯度，摸索适宜的退火温度。反应完成后，于PAGE凝胶电泳中进行检测。
1.2.3 PAGE凝胶电泳
1.2.3.1 PCR扩增
用筛选好的16对差异性稳定、多态性好的引物，按照优化的10uL反应体系，进行PCR扩增反应。
1.2.3.2检测及带型数据分析
PCR反应完成后，先进行PAGE凝胶电泳检测。采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度8～10％，凝胶大小180×120×2mm，电泳缓冲液为1×TBE，恒压200V，电泳45分钟左右。电泳结束后，凝胶放至固定液中固定6-8分钟，然后银染、显色。固定、银染、显色参考张军等(张军，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测[J].棉花学报，2000，12(5)：267-269.)介绍的方法(略做修改)。
条带确认无误后，记录电泳条带类型。条带类型数据分析表示如下：1表示母本P1带型；2表示父本P2带型；3表示共显性带型，4表示新发现的其他类型的带型，以后发现的新带型依次记录为“5、6、……”。
1.2.4品种指纹图谱及分子身份证的构建
品种指纹图谱的构建方法参考刘逢举等2012年的指纹图谱构建方法(刘逢举，王冰，杨付新.中棉所系列棉花杂交种12个亲本的SSR指纹图谱构建与应用[C].中国棉花学会2012年年会论文汇编.安阳：中国棉花杂志社，2012：58-61.)，从筛选好的引物中选择出差异较为稳定、多态性好的16对引物，将其按照固定顺序，通过利用PAGE凝胶电泳的结果，记录每对引物对各棉花品种的扩增条带类型数据，对棉花品种样品的DNA形成连续的数字编号，将其作为每个品种的数字化DNA指纹图谱。
品种分子身份证信息包括品种的基本商品信息、DNA指纹图谱编码信息及可能具有的特异基因信息。在品种的基本商品信息中，包含有“棉属分类、栽培棉与野生棉分类、栽培棉种的分类、棉花品种熟性、棉花品种类别，品种参试的区域、国审品种与否、首次审定的年份”等。在品种具有的特异基因信息中，以一位数字表示为转Bt基因品种与否。
将棉花品种的16位DNA指纹图谱编码信息(含可能具有的特异基因信息)，再结合品种的11位基本商品信息，一同编码，构建27位的国家审定棉花品种的分子身份证。
品种分子身份证二维码及条形码的生成：在数据转化器网址：http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode39.php中，输入27位分子身份证，可以即时生成二维码及条形码。
2、实验结果
2.1 SSR-PCR反应体系的优化
通过12个亲本样本(A1至G2)，对所设计的268对引物的退火温度设计了3个梯度，进行了初步探索。对其效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物，在总引物中占据了40％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。
SSR-PCR反应程序：95℃，5min→[94℃，30s→(各个引物合适的退火温度)，45s→72℃，60s]x30→72℃，5min→4℃，∞。每对引物(268对)合适的退火温度及扩增情况，则如表6所示。
表6(268对)SSR引物合适的退火温度及条带清晰度、多态性情况总述
2.2棉花品种间SSR扩增差异
通过对12个样本(A1至G2)进行SSR扩增反应，对棉花品种的特异SSR标记进行了筛选。在初步筛选结果中，268对引物中共有106对引物在六个样本中具有较清晰的疑似不一致的扩增效果，表现形式主要以条带长度不一致(图1-图106)。
2.3棉花品种指纹图谱的构建及分子身份证的构建
根据PAGE凝胶电泳的结果，从对于棉花品种具有疑似差异扩增效果的106对引物中选取了15对引物，再加上1对Bt基因特异引物(见表7)，进行了PAGE凝胶电泳；根据凝胶电泳结果详细得出了每对引物在各个品种中扩增条带的长度，按照引物的固定顺序，记录每对引物扩增出的带型数据，即可形成每个品种的DNA指纹图谱。
在亲本筛选中发现，有些亲本在个别SSR位点上带型仍很杂乱。如图107所示，中棉所75的母本(B2)在引物M013的扩增条带上呈现3种类型，且各单株之间带型较为混乱，说明该母本在该位点仍未达到纯合状态。而在15对核心引物中，该母本的扩增条带上带型很一致(其中引物M068所扩增的条带见图108)，说明母本在这些位点已达纯合状态。鉴于此，在构建数字化指纹图谱过程中，今后如果在核心引物上也发现上述杂合位点，建议不应该给其赋予数值，而应以“/”表示更为合适。指纹图谱构建所用的16对核心引物，以及12个亲本品种的指纹图谱如表7、8所示。
利用SSR核心引物M003、M006、M009、M017、M036、M037、M068、M077、M084、Q024至引物Q042，所能够扩增出的各种条带类型结果及其相应的数字代号见图109；利用SSR核心引物Q055、Q076、Q129、引物Q178以及Bt基因特异引物，所能够扩增出的各种条带类型结果及其相应的数字代号见图110。
表7 16对核心SSR引物的相关特征(引物代号及引物序列)
[1]柳李旺，朱协飞，郭旺珍，等.分子标记辅助选择聚合棉花Rfl育性恢复基因和抗虫Bt基因[J].分子植物育种，2003，1(1):48－52。
表8利用16对核心SSR引物构建的12个棉花亲本品种的指纹图谱
棉花品种的基本商品信息中，字母编号及具体含义如表9所示。将棉花品种的16位DNA指纹图谱编码信息(含可能具有的特异基因信息)，再结合品种的11位基本商品信息，一同编码，构建27位的国家审定棉花品种的分子身份证。B1(中棉所75父本)的分子身份证为“111211120022111111212211111”，F1(中棉所52父本)的分子身份证为“111211019982211112222121221”。
以某一国审棉花品种的27位分子身份证“111111120071221212111212111”为例，前11位表示“棉属、栽培棉、陆地棉、早熟、常规棉、黄河流域、国审品种、2007年首次审定”，中间15位为该品种的DNA指纹信息，最后一位“1”表示“是转Bt基因品种”。
表9棉花品种基本商品信息及特殊信息的数字代码及其含义
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物及其应用
<130> HN-2001-180101A
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 1
cccacccttt tcttcttttt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 2
gctgccaaat ttcatctctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 3
gctttgcttt ggaatgagat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 4
ttggtgcaga tagcaagaaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 5
gtcaaagcgt agccataggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 6
agagaggggg aaaagagaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 7
aaagagggta tcgggaaaat 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 8
ggtgccataa aaattacagt gg 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 9
cgacggaaag ggttatctta 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 10
acgcccttca ttcaaacac 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 11
aatagcaaag ccttcagtgc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 12
gaagtgcaaa aaccgtacct 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 13
ttcttggctt ctttcttgct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 14
cacccttcac cttcaaaact 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 15
ccaaggatat gaaccaaagg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 16
cgtgaacacc atgtcagtct 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 17
gcaatcagct catcttgctt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 18
tgacgaaaat ttgttggatg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 19
caagcttgag cttctcatca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 20
aaaacagtga tgggttcgtt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 21
ccctccataa ccaaaagttg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 22
accaacaatg gtgacctctt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 23
tgtaactgag cagccgtacg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 24
gccaaagcag agtgagatcc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 25
cgtttgtttt cgtgtaacag g 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 26
tggtggattc acatccaaag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 27
ggggcgatat atacgatgtt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 28
atggtctgtc tttccagctc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 29
cattccccac tttgctctta c 21
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 30
catgtttctt tgcccatc 18
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 31
gggcccgctg aatccaactg gagaggc 27
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 32
ccatacaact gcttgagtaa cccagaagtt g 31
Claims (7)
1.用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物，其特征在于，包括：
由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对1；
由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的下游引物组成的引物对2；
由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的下游引物组成的引物对3；
由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的下游引物组成的引物对4；
由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的下游引物组成的引物对5；
由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.12所示的下游引物组成的引物对6；
由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的下游引物组成的引物对7；
由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的下游引物组成的引物对8；
由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.18所示的下游引物组成的引物对9；
由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.20所示的下游引物组成的引物对10；
由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.22所示的下游引物组成的引物对11；
由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.24所示的下游引物组成的引物对12；
由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.26所示的下游引物组成的引物对13；
由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.28所示的下游引物组成的引物对14；
由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.30所示的下游引物组成的引物对15；以及，
由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.32所示的下游引物组成的引物对16；
所述陆地棉品种选自中棉所72父本、中棉所72母本、中棉所75父本、中棉所75母本、中棉所63父本、中棉所63母本、中棉所48父本、中棉所48母本、中棉所52父本、中棉所52母本、中棉所59父本或中棉所59母本中的任意一种或多种。
2.权利要求1所述的SSR引物在构建陆地棉品种分子身份证中的应用；所述陆地棉品种选自中棉所72父本、中棉所72母本、中棉所75父本、中棉所75母本、中棉所63父本、中棉所63母本、中棉所48父本、中棉所48母本、中棉所52父本、中棉所52母本、中棉所59父本或中棉所59母本中的任意一种或多种。
3.权利要求1所述的SSR引物在构建陆地棉品种指纹图谱中的应用；所述陆地棉品种选自中棉所72父本、中棉所72母本、中棉所75父本、中棉所75母本、中棉所63父本、中棉所63母本、中棉所48父本、中棉所48母本、中棉所52父本、中棉所52母本、中棉所59父本或中棉所59母本中的任意一种或多种。
4.一种陆地棉品种指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待检测棉花品种的基因组DNA；（2）以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建得到棉花品种的DNA指纹图谱；
步骤（3）按照引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16的固定排列顺序，通过凝胶电泳结果，依次记录每个棉花品种经每对SSR引物扩增出现的条带类型，依据各个条带类型所赋予的数字，形成带型数字编号，即为该棉花品种的DNA指纹图谱；
所述陆地棉品种选自中棉所72父本、中棉所72母本、中棉所75父本、中棉所75母本、中棉所63父本、中棉所63母本、中棉所48父本、中棉所48母本、中棉所52父本、中棉所52母本、中棉所59父本或中棉所59母本中的任意一种或多种。
5.一种陆地棉品种分子身份证的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待检测棉花品种的基因组DNA；（2）以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建棉花品种的DNA指纹图谱信息编码；（4）将棉花品种的DNA指纹图谱信息编码，再结合棉花品种的基本商品信息一同编码，构建国家审定棉花品种的分子身份证；
所述分子身份证依次包括：棉花品种的基本商品信息、DNA指纹图谱信息编码；所述陆地棉品种选自中棉所72父本、中棉所72母本、中棉所75父本、中棉所75母本、中棉所63父本、中棉所63母本、中棉所48父本、中棉所48母本、中棉所52父本、中棉所52母本、中棉所59父本或中棉所59母本中的任意一种或多种。
6.按照权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为10µL，其中，含Mg2+的10×PCR Buffer 1.0uL、2mM的dNTPs 0.3μL、5u/uL的Taq 酶0.2μL、上游引物和下游引物各0.5μL、DNA模板1.0uL，ddH2O 6.5µl；
所述PCR扩增的程序包括：95℃ 5 min→[94℃ 30 s→每对SSR引物的退火温度，45 s→72℃ 60 s]x30个循环→72℃， 5 min→4℃ Forever；
其中，所述SSR引物的退火温度为：引物对1的退火温度为55℃；引物对2的退火温度为55℃；引物对3的退火温度为57℃；引物对4的退火温度为55℃；引物对5的退火温度为55℃；引物对6的退火温度为55℃；引物对7的退火温度为55℃；引物对8的退火温度为57℃；引物对9的退火温度为55℃；引物对10的退火温度为55℃；引物对11的退火温度为57℃；引物对12的退火温度为59℃；引物对13的退火温度为57℃；引物对14的退火温度为57℃；引物对15的退火温度为55℃；引物对16的退火温度为57℃。
7.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述基本商品信息包括：棉属分类、栽培棉与野生棉分类、栽培棉种的分类、棉花品种熟性、棉花品种类别、品种参试的区域、国审品种与否和首次审定的年份。
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