CN108570514B - 用于构建中棉所50指纹图谱的ssr引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明在上述268对引物中筛选获得106对具有差异效果的引物。本发明进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建中棉所50的特异指纹图谱。本发明还公开了所述SSR引物在构建中棉所50指纹图谱以及鉴定中棉所50中的应用。本发明所述SSR引物及所构建的指纹图谱对中棉所50的品种鉴定与推广等具有重要价值。

Description

用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用
技术领域
本发明涉及用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物，还涉及所述SSR引物在中棉所50鉴定以及构建中棉所50指纹图谱中的应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。
背景技术
中棉所50是由中国农科院棉花所早熟课题组育种专家所培育的，2007年通过国家审定，在早熟品种中推广面积较大。棉花国家区试自2012年始，重新开启棉花早熟组试验，中棉所50作为对照品种入选，至今已有5年。但在试验及推广过程中，经常发现有数量不等的杂株存在。这一方面干扰了国家早熟区域试验的正常进行，一方面也可能给广大棉农带来经济上的损失。以往鉴定中棉所50的纯度，主要以田间鉴定为主，费时费工。DNA分子标记的出现和快速发展，为中棉所50的准确鉴定提供了一种新的技术手段。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记具有数量丰富、共显性遗传、信息含量高、分析方法简单、结果重现性好等优点，使其成为构建品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于大豆、玉米、小麦、水稻、棉花等作物中。
在被子植物中，卵子和精子核融合形成二倍体的合子，最终发育成胚；受精事件诱发母体的二倍体珠心细胞分化成种皮。因此，棉籽种皮是全部继承母本遗传信息的组织，通过分离种皮并从中提取DNA、构建指纹图谱，能够获得母本的指纹；棉籽种仁基本成分则是由卵子和精子核融合形成的二倍体种胚。结合二倍体种胚和母本指纹，就可分析推算该棉花品种是常规种，还是杂交种。早期已有花生、玉米等种皮DNA提取方法的报道(赵久然,刘龙洲,王凤格等.利用杂交玉米F1代种子果皮组织鉴定母本真实性的SSR研究[J].玉米科学，2004，12(3):6-8；刘龙洲.自玉米F1种子获得父本、母本全套DNA指纹图谱的研究[D].新疆农业大学，2004；石运庆,苗华荣,陈高等.花生种皮及籽仁DNA提取方法的研究[J].花生学报，2008,37(4)：37-39.)。棉花的相关报道目前还较少见。为了快速鉴定中棉所50，特采用目前常用的SSR检测技术，对中棉所50同时进行种皮DNA及种胚DNA的双重鉴定，构建指纹图谱，以确保中棉所50的品种纯度。但这种方法存在成本偏高、耗时、且一次检测位点较为有限等不足。因此，开发一种利用专用引物组快速鉴定棉花品种中棉所50的方法，具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的SSR引物在中棉所50鉴定以及构建中棉所50指纹图谱中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行了陆地棉SSR引物的设计，并根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得268对引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物(表现形式主要以条带长度不一致)，在总引物中占据了40％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。
本发明进一步通过对中棉所12个亲本样本进行SSR扩增反应，对上述106对引物在12个亲本品种中具有差异效果的特异SSR标记进行筛选。最终，本发明从上述106对具有疑似差异扩增效果的引物中，选择出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种中棉所50的特异指纹图谱。
本发明所述的15对核心SSR引物及一对Bt基因特异引物，包括：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对1(即引物M003)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的下游引物组成的引物对2(即引物M006)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的下游引物组成的引物对3(即引物M009)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的下游引物组成的引物对4(即引物M017)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的下游引物组成的引物对5(即引物M036)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.12所示的下游引物组成的引物对6(即引物M037)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的下游引物组成的引物对7(即引物M068)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的下游引物组成的引物对8(即引物M077)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.18所示的下游引物组成的引物对9(即引物M084)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.20所示的下游引物组成的引物对10(即引物Q024)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.22所示的下游引物组成的引物对11(即引物Q042)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.24所示的下游引物组成的引物对12(即引物Q055)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.26所示的下游引物组成的引物对13(即引物Q076)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.28所示的下游引物组成的引物对14(即引物Q129)；
由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.30所示的下游引物组成的引物对15(即引物Q178)；以及，
由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.32所示的下游引物组成的引物对16(即Bt基因特异引物)。
本发明进一步公开了所述的SSR引物在构建中棉所50指纹图谱中的应用。
本发明进一步公开了所述的SSR引物在鉴定中棉所50中的应用。
本发明还公开了一种中棉所50指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取待检测样本中棉所50的种皮、种胚基因组DNA；(2)分别以提取的种皮、种胚基因组DNA为模板，以本发明所述16对SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建得到中棉所50的DNA指纹图谱。
优选的，所述中棉所50指纹图谱的构建方法中，步骤(3)按照引物对1(即M003)、引物对2(即M006)、引物对3(即M009)、引物对4(即M017)、引物对5(即M036)、引物对6(即M037)、引物对7(即M068)、引物对8(即M077)、引物对9(即M084)、引物对10(即Q024)、引物对11(即Q042)、引物对12(即Q055)、引物对13(即Q076)、引物对14(即Q129)、引物对15(即Q178)、引物对16(即Bt基因特异引物)的固定排列顺序，通过凝胶电泳结果，依次记录棉花品种中棉所50的种皮、种胚经每对SSR引物扩增出现的条带类型，依据各个条带类型所赋予的数字，形成一系列带型数字编号；比较种皮、种胚的扩增结果，确定中棉所50的各个扩增条带类型数字编号，即为棉花品种中棉所50的DNA指纹图谱。其中，条带类型数据分析表示如下：1表示母本P1带型；2表示父本P2带型；3表示共显性带型，4表示新发现的其他类型的带型，以后发现的新带型依次记录为“5、6、……”。具体的，利用本发明16对SSR核心引物所能够扩增出的各种条带类型及其相应的数字代号，见说明书附图图107-108。
本发明棉花品种指纹图谱的构建方法，参考刘逢举等2012年的指纹图谱构建方法(刘逢举，王冰，杨付新.中棉所系列棉花杂交种12个亲本的SSR指纹图谱构建与应用[C].中国棉花学会2012年年会论文汇编.安阳：中国棉花杂志社，2012：58-61)。
本发明还公开了一种中棉所50的鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取待测棉花品种的基因组DNA(其中，所述基因组DNA优选为种皮或种胚基因组DNA)；(2)以提取的DNA为模板，分别以本发明所述16对SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果PCR扩增产物满足以下标准1)至标准16)中的任意14条以上标准，则判定待测棉花品种为中棉所50或候选的中棉所50。
其中，标准1)：采用所述引物对1(即引物对M003)时，满足如下带型：大于400bp具有1条弱带、在300bp和100bp之间具有3条亮带；标准2)：采用所述引物对2(即引物对M006)时，满足如下带型：在600bp和500bp之间具有2条亮带、在500bp和400bp之间具有1条较弱带、在400bp和300bp之间具有2条亮带；标准3)：采用所述引物对3(即引物对M009)时，满足如下带型：在500bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有2条亮带；标准4)：采用所述引物对4(即引物对M017)时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条亮带、在200bp以下具有1条粗带；标准5)：采用所述引物对5(即引物对M036)时，满足如下带型：在300bp以上无带、在300bp和200bp之间具有1条粗带；标准6)：采用所述引物对6(即引物对M037)时，满足如下带型：在400bp以上可能具有2条弱带、在300bp和200bp之间仅具有1条亮带；标准7)：采用所述引物对7(即引物对M068)时，满足如下带型：在1000bp和900bp之间具有1条带，在400bp和200bp之间具有4条带；标准8)：采用所述引物对8(即引物对M077)时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有2条带、在300bp和200bp之间具有1条带；标准9)：采用所述引物对9(即引物对M084)时，满足如下带型：在800bp和700bp之间具有1条带、在700bp和600bp之间具有1条带；标准10)：采用所述引物对10(即引物对Q024)时，满足如下带型：在600bp和500bp之间仅具有1条细带、在300bp和200bp之间仅具有1条粗带；标准11)：采用所述引物对11(即引物对Q042)时，满足如下带型：在300bp以上无明显条带、在300bp和100bp之间具有3条带；标准12)：采用所述引物对12(即引物对Q055)时，满足如下带型：在600bp和400bp之间具有3条带、300bp和200bp之间具有2条带；标准13)：采用所述引物对13(即引物对Q076)时，满足如下带型：在800bp和500bp之间具有2条亮带、在300bp和200bp之间具有3条带；标准14)：采用所述引物对14(即引物对Q129)时，满足如下带型：大于600bp具有2条带、在450bp和600bp之间具有3条带；标准15)：采用所述引物对15(即引物对Q178)时，满足如下带型：在600bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有3条带；标准16)：采用所述引物对16(即Bt基因特异性引物对)时，满足如下带型：在900bp和1000bp之间具有1条亮带。
本发明所述中棉所50的鉴定方法，可应用于中棉所50的准确鉴定，保证中棉所50种子的质量。
本发明所述中棉所50指纹图谱的构建方法或中棉所50的鉴定方法中，步骤(2)所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为10μL，其中，2×Buffer(含Mg2+)5.0uL、2mmol/L的dNTPs 2.0μL、KOD FX特异的Taq酶0.2μL、上游引物和下游引物各0.3μL、DNA模板1.0μL、ddH2O 1.2μl。所述PCR扩增的程序包括：94℃2min→[98℃10s→(每对SSR引物的合适退火温度)，30s→68℃30s]x30个循环→4℃Forever。
其中，所述SSR引物的退火温度为：引物对1(即M003)的退火温度为55℃；引物对2(即M006)的退火温度为55℃；引物对3(即M009)的退火温度为57℃；引物对4(即M017)的退火温度为55℃；引物对5(即M036)的退火温度为55℃；引物对6(即M037)的退火温度为55℃；引物对7(即M068)的退火温度为55℃；引物对8(即M077)的退火温度为57℃；引物对9(即M084)的退火温度为55℃；引物对10(即Q024)的退火温度为55℃；引物对11(即Q042)的退火温度为57℃；引物对12(即Q055)的退火温度为59℃；引物对13(即Q076)的退火温度为57℃；引物对14(即Q129)的退火温度为57℃；引物对15(即Q178)的退火温度为55℃；引物对16(即Bt基因特异引物)的退火温度为57℃。
本发明还公开了所述的构建方法构建得到的中棉所50的指纹图谱。所述中棉所50的指纹图谱为2111112112212211。其中，数字为各引物所扩增条带的类型(具体见说明书附图图109)，条带类型数据分析表示如下：数字1表示亲本P1类带型；数字2表示亲本P2类带型。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明利用EST序列数据进行了陆地棉SSR标记的开发。本发明从所设计的268对SSR引物中筛选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，构建了早熟棉品种中棉所50的特异指纹图谱，将为具备重要推广价值的棉花品种中棉所50的推广和规划奠定良好的基础。本发明所述的SSR引物以及所构建的中棉所50指纹图谱，对中棉所50的品种鉴定与推广等具有重要的价值。
附图说明
图1为SSR引物M001的PAGE凝胶电泳图；
图2为SSR引物M002的PAGE凝胶电泳图；
图3为SSR引物M003的PAGE凝胶电泳图；
图4为SSR引物M006的PAGE凝胶电泳图；
图5为SSR引物M007的PAGE凝胶电泳图；
图6为SSR引物M009的PAGE凝胶电泳图；其中在300-500bp处，A1、A2、B2、C1、F2、G2这6个样本扩增出两条稍靠下的条带，在其余6个样本中扩增出两条稍靠上的条带；
图7为SSR引物M013的PAGE凝胶电泳图；其中在300-400bp处，B1、D2、F1这3个样本均扩增出双条带；其余样本则无此条带，而是在500-600bp处扩增出一条亮带；
图8为SSR引物M014的PAGE凝胶电泳图；
图9为SSR引物M015的PAGE凝胶电泳图；其中在800-900bp处，C1、C2、F2、G1、G2这5个样本扩增出两条稍靠下的条带，在其余7个样本中扩增出两条稍靠上的条带；
图10为SSR引物M017的PAGE凝胶电泳图；
图11为SSR引物M018的PAGE凝胶电泳图；
图12为SSR引物M019的PAGE凝胶电泳图；
图13为SSR引物M021的PAGE凝胶电泳图；
图14为SSR引物M024的PAGE凝胶电泳图；
图15为SSR引物M025的PAGE凝胶电泳图；
图16为SSR引物M026的PAGE凝胶电泳图；
图17为SSR引物M027的PAGE凝胶电泳图；
图18为SSR引物M029的PAGE凝胶电泳图；
图19为SSR引物M030的PAGE凝胶电泳图；
图20为SSR引物M031的PAGE凝胶电泳图；
图21为SSR引物M033的PAGE凝胶电泳图；
图22为SSR引物M036的PAGE凝胶电泳图；
图23为SSR引物M037的PAGE凝胶电泳图；
图24为SSR引物M043的PAGE凝胶电泳图；
图25为SSR引物M046的PAGE凝胶电泳图；
图26为SSR引物M047的PAGE凝胶电泳图；
图27为SSR引物M052的PAGE凝胶电泳图；其中在450bp处，C1、F1、G2这3个样本扩增出一条亮带；其余样本则无此条带，而是在500bp处扩增出一条亮带；
图28为SSR引物M053的PAGE凝胶电泳图；
图29为SSR引物M059的PAGE凝胶电泳图；
图30为SSR引物M063的PAGE凝胶电泳图；
图31为SSR引物M066的PAGE凝胶电泳图；
图32为SSR引物M067的PAGE凝胶电泳图；
图33为SSR引物M068的PAGE凝胶电泳图；其中在1000bp处，A1、B1、C2、D1这4个样本扩增出一条亮带；其余样本则无此条带，而是在900bp处扩增出一条亮带；
图34为SSR引物M072的PAGE凝胶电泳图；
图35为SSR引物M075的PAGE凝胶电泳图；
图36为SSR引物M077的PAGE凝胶电泳图；
图37为SSR引物M078的PAGE凝胶电泳图；
图38为SSR引物M084的PAGE凝胶电泳图；其中在500-600bp处，样本D2、F1扩增出两条稍靠下的条带，在其余9个样本中扩增出两条稍靠上的条带；而样本G1在此处则扩增带型较乱；
图39为SSR引物Q001的PAGE凝胶电泳图；
图40为SSR引物Q004的PAGE凝胶电泳图；
图41为SSR引物Q007的PAGE凝胶电泳图；
图42为SSR引物Q008的PAGE凝胶电泳图；
图43为SSR引物Q014的PAGE凝胶电泳图；
图44为SSR引物Q019的PAGE凝胶电泳图；
图45为SSR引物Q024的PAGE凝胶电泳图；其中在500bp处，样本A1、A2、B1、F1、G2扩增出一条亮带；其余6个样本则无此条带，而是在600bp附近扩增出一条亮带；而样本C1在此处则扩增带型较乱；
图46为SSR引物Q027的PAGE凝胶电泳图；
图47为SSR引物Q031的PAGE凝胶电泳图；
图48为SSR引物Q032的PAGE凝胶电泳图；
图49为SSR引物Q035的PAGE凝胶电泳图；
图50为SSR引物Q040的PAGE凝胶电泳图；
图51为SSR引物Q041的PAGE凝胶电泳图；
图52为SSR引物Q042的PAGE凝胶电泳图；
图53为SSR引物Q043的PAGE凝胶电泳图；
图54为SSR引物Q044的PAGE凝胶电泳图；
图55为SSR引物Q048的PAGE凝胶电泳图；
图56为SSR引物Q050的PAGE凝胶电泳图；
图57为SSR引物Q055的PAGE凝胶电泳图；
图58为SSR引物Q059的PAGE凝胶电泳图；
图59为SSR引物Q064的PAGE凝胶电泳图；
图60为SSR引物Q071的PAGE凝胶电泳图；
图61为SSR引物Q072的PAGE凝胶电泳图；
图62为SSR引物Q075的PAGE凝胶电泳图；
图63为SSR引物Q076的PAGE凝胶电泳图；
图64为SSR引物Q079的PAGE凝胶电泳图；
图65为SSR引物Q082的PAGE凝胶电泳图；
图66为SSR引物Q084的PAGE凝胶电泳图；
图67为SSR引物Q089的PAGE凝胶电泳图；
图68为SSR引物Q091的PAGE凝胶电泳图；
图69为SSR引物Q095的PAGE凝胶电泳图；
图70为SSR引物Q098的PAGE凝胶电泳图；
图71为SSR引物Q101的PAGE凝胶电泳图；
图72为SSR引物Q103的PAGE凝胶电泳图；
图73为SSR引物Q104的PAGE凝胶电泳图；
图74为SSR引物Q106的PAGE凝胶电泳图；
图75为SSR引物Q110的PAGE凝胶电泳图；
图76为SSR引物Q115的PAGE凝胶电泳图；
图77为SSR引物Q116的PAGE凝胶电泳图；
图78为SSR引物Q117的PAGE凝胶电泳图；
图79为SSR引物Q125的PAGE凝胶电泳图；
图80为SSR引物Q126的PAGE凝胶电泳图；
图81为SSR引物Q129的PAGE凝胶电泳图；
图82为SSR引物Q130的PAGE凝胶电泳图；
图83为SSR引物Q132的PAGE凝胶电泳图；
图84为SSR引物Q134的PAGE凝胶电泳图；
图85为SSR引物Q135的PAGE凝胶电泳图；
图86为SSR引物Q137的PAGE凝胶电泳图；
图87为SSR引物Q138的PAGE凝胶电泳图；
图88为SSR引物Q140的PAGE凝胶电泳图；
图89为SSR引物Q141的PAGE凝胶电泳图；
图90为SSR引物Q146的PAGE凝胶电泳图；
图91为SSR引物Q147的PAGE凝胶电泳图；
图92为SSR引物Q149的PAGE凝胶电泳图；
图93为SSR引物Q156的PAGE凝胶电泳图；
图94为SSR引物Q157的PAGE凝胶电泳图；
图95为SSR引物Q160的PAGE凝胶电泳图；
图96为SSR引物Q161的PAGE凝胶电泳图；
图97为SSR引物Q164的PAGE凝胶电泳图；
图98为SSR引物Q166的PAGE凝胶电泳图；
图99为SSR引物Q167的PAGE凝胶电泳图；
图100为SSR引物Q172的PAGE凝胶电泳图；
图101为SSR引物Q174的PAGE凝胶电泳图；
图102为SSR引物Q176的PAGE凝胶电泳图；
图103为SSR引物Q178的PAGE凝胶电泳图；
图104为SSR引物Q179的PAGE凝胶电泳图；
图105为SSR引物Q182的PAGE凝胶电泳图；
图106为SSR引物Q184的PAGE凝胶电泳图；
图107为利用SSR核心引物M003至引物Q042，所能够扩增出的各种条带类型结果及其相应的数字代号(图片每一引物最左方M为北京全式金生物技术有限公司所提供的100bpPlus DNA Ladder所显示的条带，共含有12条条带，由下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp)；
图108为利用SSR核心引物Q055至引物Q178以及Bt基因特异引物，所能够扩增出的各种条带类型结果及其相应的数字代号(图片每一引物最左方M为北京全式金生物技术有限公司所提供的100bp Plus DNA Ladder所显示的条带，共含有12条条带，由下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp、1500bp)；
图109为利用16对SSR核心引物(引物M003至引物Q178以及Bt特异引物)所构建的早熟棉花品种中棉所50的SSR指纹图谱；其中，(a)为待检品种中棉所50种胚的SSR扩增带型；(b)为待检品种中棉所50种皮的SSR扩增带型；(a)、(b)中横线上为各SSR引物及其对应的带型，横线下为各带型所对应的数字化指纹。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物设计及筛选
1、材料与方法
1.1实验材料
实验材料及其来源见表1，引物初步筛选所用的材料A1-G2采集均采用了当年新萌发种子的幼嫩叶片。待检的材料中棉所50则是分别采用了种子的种皮和种胚。
表1实验材料及来源
编号 种名 采集地点 采集时间
A1 中棉所72父本 中棉所科贸公司 2011.3.7
A2 中棉所72母本 中棉所科贸公司 2011.3.7
B1 中棉所75父本 中棉所科贸公司 2011.3.8
B2 中棉所75母本 中棉所科贸公司 2011.3.8
C1 中棉所63父本 中棉所科贸公司 2011.3.8
C2 中棉所63母本 中棉所科贸公司 2011.3.8
D1 中棉所48父本 中棉所科贸公司 2011.3.9
D2 中棉所48母本 中棉所科贸公司 2011.3.9
F1 中棉所52父本 中棉所科贸公司 2011.3.9
F2 中棉所52母本 中棉所科贸公司 2011.3.9
G1 中棉所59父本 中棉所科贸公司 2011.3.10
G2 中棉所59母本 中棉所科贸公司 2011.3.10
中棉所50 中棉所农场 2013.5.10
1.2实验方法
1.2.1基因组DNA的提取
1.2.1.1初筛用的12个样本的叶片DNA提取
取2小片鲜叶放入2ml的离心管中，加入700uL新鲜配制的DNA提取缓冲液(表2)，用MM-301型研磨仪磨碎，保存于-20℃的冰箱中备用。DNA提取是采用改良的CTAB法(Pa-terson,1993)。具体操作如下：(1)将样品解冻，10000rpm离心5min(4℃)，弃上清；(2)于沉淀中加入650uL的65℃预热的裂解缓冲液(表3)，震散样品，混匀，放65℃中水浴，每隔10分钟取出上下摇匀，40min后取出样品；(3)加入650uL氯仿:异戊醇(24:1)混合液，翻转50次左右，12000rpm离心10min(4℃)；(4)抽提上清转入1.5ml的离心管中，加2/3体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转50次，混匀，静置5min，等待DNA沉淀；(5)取1.5ml的空离心管，加入75％的乙醇约400uL；(6)取灭菌的200uL规格的枪头，挑取沉淀的DNA小团至空离心管中，清洗5分钟。如果DNA沉淀仍不干净，可以再如此清洗一次。(7)倒掉75％的乙醇，加100％的无水乙醇，沉淀DNA。(8)倒掉100％的无水乙醇，风干DNA样品；(9)加300-500uL的TE缓冲液(10mM Tris/HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0),pH 8.0)溶解DNA(4℃,30min以上)，并保存备用。
1.2.1.2待检陆地棉棉花品种种皮DNA的提取
取待检品种的单粒种子，剪刀剥离种皮后，将种皮放入2ml的离心管中，用MM301混合型研磨仪30转/秒研磨1分钟，磨碎后立即加入700uL新鲜配制的DNA提取缓冲液(表2)。DNA提取是采用改良的CTAB法(Pa-terson,1993)，具体操作同上，4℃冰箱保存备用。
1.2.1.3待检陆地棉棉花品种种仁DNA的粗提
取待检品种的单粒种子，剪刀剥去种皮为棉仁，棉仁装于1个2mL的离心管中，再装1粒5mm的钢珠。加超纯水500uL，用MM301混合型研磨仪30转/秒研磨1分钟，再加超纯水1000uL摇匀。常温条件下，12000转/分钟离心10分钟。上清液表面有一层油脂，用枪头挑去油层，取上清液100-150uL至96孔PCR板上作为模板备用，4℃条件下保存。
表2-3列出DNA的提取液和裂解缓冲液的浓度和配方。缓冲液清亮，很快变黄，室温可保存1-2周，用前加1/100体积的β-Me(巯基乙醇)，CTAB溶解要数小时。
表2DNA提取缓冲液
Figure BDA0001639378440000091
表3裂解缓冲液
工作液(终浓度) ml ml 存储液
1.4M NaCl 40.908(g) 8.1816g(g) NaCl(固体)
0.1M Tris.HCl 50 10 1.0M Tris.HCl(pH8.0)
20mM Na.EDTA 20 4 0.5M Na.EDTA(pH8.0)
2％PVP 10(g) 2 10％PVP
2％CTAB 10(g) 2 10％CTAB
1％(V/V)β-Me 5 1 Liquid
dd Water 425 85 -
Total 500 100 -
1.2.2 SSR-PCR扩增
1.2.2.1引物设计
本发明SSR引物的设计采用构建基因组文库，筛选物种的SSR位点，根据位点两侧的序列来设计引物，由之前GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行了SSR引物的设计，通过Primer 5.0软件完成引物的设计。根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得并合成了268对引物，引物具体情况见表4。由于本发明设计引物的来源大都为EST序列数据，故所用SSR标记大都属于EST-SSR标记。
表4合成的268对SSR引物具体情况表
Figure BDA0001639378440000092
Figure BDA0001639378440000101
Figure BDA0001639378440000111
Figure BDA0001639378440000121
Figure BDA0001639378440000131
Figure BDA0001639378440000141
Figure BDA0001639378440000151
1.2.2.2引物筛选
对于所合成的268对引物，本发明在实验最初阶段使用12个样本DNA(A1至G2)进行了预实验，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，筛选出106对为具有差异效果的引物。进一步通过对中棉所6个杂交种样本，对这106对引进行筛选。最终选择出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，再加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种中棉所50的特异指纹图谱。
对于每对引物的退火温度，以其前后引物Tm值的均值作为中间梯度，上下各浮动1℃，以期获得较为合适的退火温度，并验证其具有良好的多态性。
1.2.2.3适于KOD FX产品的SSR-PCR反应体系的优化
一个合适的SSR-PCR反应体系对于良好的实验结果的获得是必不可少的。根据本发明人实验室已有的实验基础，所采取的PCR反应体系根据KOD FX产品的说明，在10μl反应体系中进行，具体反应体系见表5。
表5 PCR反应体系(10uL)
反应物 反应体积
2×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>) 5.0uL
2mmol/L的dNTPs 2.0uL
Prime-F 0.3uL
Prime-R 0.3uL
Taq酶(KOD FX特异) 0.2uL
模板DNA 1.0uL
ddH<sub>2</sub>O 1.2uL
所述PCR扩增的程序包括：94℃2min→[98℃10s→(每对引物的大致退火温度，另外上下浮动1℃，做3个梯度)，30s→68℃30s]x30个循环→4℃Forever。以此3个梯度，摸索适宜的退火温度反应完成后，于PAGE凝胶电泳中进行检测。
1.2.3待检品种的PAGE凝胶电泳
1.2.3.1 PCR扩增
用筛选好的16对差异性稳定、多态性好的引物，按照优化的适于KOD FX产品的10μl反应体系，分别对待检品种的种皮、种胚粗提DNA进行PCR扩增反应。
1.2.3.2检测及带型数据分析
PCR反应完成后，先进行PAGE凝胶电泳检测。采用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度8～10％，凝胶大小180×120×2mm，电泳缓冲液为1×TBE，恒压200V，电泳45分钟左右。电泳结束后，凝胶放至固定液中固定6-8分钟，然后银染、显色。固定、银染、显色参考张军等(张军，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测[J].棉花学报，2000，12(5)：267-269.)介绍的方法(略做修改)。
条带确认无误后，记录电泳条带类型。条带类型数据分析表示如下：1表示母本P1带型；2表示父本P2带型；3表示共显性带型，4表示新发现的其他类型的带型，以后发现的新带型依次记录为“5、6、……”。
1.2.4品种中棉所50的DNA数字化指纹图谱的构建
品种指纹图谱的构建方法参考刘逢举等2012年的指纹图谱构建方法(刘逢举，王冰，杨付新.中棉所系列棉花杂交种12个亲本的SSR指纹图谱构建与应用[C].中国棉花学会2012年年会论文汇编.安阳：中国棉花杂志社，2012：58-61.)，从筛选好的引物中选择出差异较为稳定、多态性好的16对引物，将其按照固定顺序，通过利用PAGE凝胶电泳的结果，记录每对引物对棉花品种中棉所50的种皮、种胚的扩增条带类型数据，对棉花品种样品的DNA形成连续的数字编号。比较种皮、种胚的扩增结果，最终确定中棉所50的各个扩增条带类型数字编号，将其作为早熟棉花品种中棉所50的DNA数字化指纹图谱。
2、实验结果
2.1 SSR-PCR反应体系的优化
通过待检样本，对所设计的268对引物的退火温度设计了3个梯度，进行了初步探索。对其效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物，在总引物中占据了40％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。
SSR-PCR反应程序：94℃2min→[98℃10s→(每对引物合适的退火温度)，30s→68℃30s]x30个循环→4℃，∞。每对引物(268对)合适的退火温度及扩增情况，则如表6所示。
表6(268对)SSR引物合适的退火温度及条带清晰度、多态性情况总述
Figure BDA0001639378440000161
Figure BDA0001639378440000171
Figure BDA0001639378440000181
Figure BDA0001639378440000191
Figure BDA0001639378440000201
Figure BDA0001639378440000211
2.2棉花品种间SSR扩增差异
通过对12个样本(A1至G2)进行SSR扩增反应，对棉花品种的特异SSR标记进行了筛选。在初步筛选结果中，268对引物中共有106对引物在六个样本中具有较清晰的疑似不一致的扩增效果，表现形式主要以条带长度不一致(图1-图106)。
2.3棉花品种中棉所50的数字化DNA指纹图谱的构建
根据上述PAGE凝胶电泳的结果，从对于棉花品种具有疑似差异扩增效果的106对引物中选取了15对引物，再加上1对Bt基因特异引物(表7、图107、图108)，用于早熟棉花品种中棉所50的数字化DNA指纹图谱的构建。利用适于KOD FX产品的SSR-PCR反应体系，对待检品种中棉所50的种皮、种胚的扩增产物分别进行了PAGE凝胶电泳；根据凝胶电泳结果详细得出了每对引物在待检品种中棉所50中的扩增条带的长度，按照引物的固定顺序，记录每对引物扩增出的带型数据，即可形成待检品种中棉所50的DNA指纹图谱。所述中棉所50的指纹图谱为2111112112212211。数字为各引物所扩增条带的类型(见图109)，图109中，图a为待检品种中棉所50种胚的SSR扩增带型，图b为待检品种中棉所50种皮的SSR扩增带型。
表7 16对核心SSR引物的相关特征(引物代号及引物序列)
Figure BDA0001639378440000221
[1]柳李旺，朱协飞，郭旺珍，等.分子标记辅助选择聚合棉花Rfl育性恢复基因和抗虫Bt基因[J].分子植物育种，2003，1(1):48－52。
本发明上述16对核心引物，能够用于早熟棉花品种中棉所50鉴定。以待测棉花品种的基因组DNA为模板，分别采用上述16对引物对进行PCR扩增，如果PCR扩增产物满足标准1)至标准16)中的14条以上，待测棉花品种即为中棉所50或候选的中棉所50。本发明可应用于中棉所50的准确鉴定，保证中棉所50种子的质量。
标准1)：采用所述M003引物对时，满足如下带型：大于400bp具有2条弱带、在300bp和100bp之间具有3条亮带；标准2)：采用所述M006引物对时，满足如下带型：在600bp和500bp之间具有2条亮带、在500bp和400bp之间具有1条较弱带、在400bp和300bp之间具有2条亮带；标准3)：采用所述M009引物对时，满足如下带型：在500bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有2条亮带；标准4)：采用所述M017引物对时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条亮带、在200bp以下具有1条粗带；标准5)：采用所述M036引物对时，满足如下带型：在300bp以上无带、在300bp和200bp之间具有1条粗带；标准6)：采用所述M037引物对时，满足如下带型：在400bp以上可能具有2条弱带、在300bp和200bp之间仅具有1条亮带；标准7)：采用所述M068引物对时，满足如下带型：在1000bp和900bp之间具有1条带，在400bp和200bp之间具有4条带；标准8)：采用所述M077引物对时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有2条带、在300bp和200bp之间具有1条带；标准9)：采用所述M084引物对时，满足如下带型：在800bp和700bp之间具有1条带、在700bp和600bp之间具有1条带；标准10)：采用所述Q024引物对时，满足如下带型：在600bp和500bp之间仅具有1条细带、在300bp和200bp之间仅具有1条粗带；标准11)：采用所述Q042引物对时，满足如下带型：在300bp以上无明显条带、在300bp和100bp之间具有3条带；标准12)：采用所述Q055引物对时，满足如下带型：在600bp和400bp之间具有3条带、300bp和200bp之间具有2条带；标准13)：采用所述Q76引物对时，满足如下带型：在800bp和500bp之间具有2条亮带、在300bp和200bp之间具有3条带；标准14)：采用所述Q129引物对时，满足如下带型：大于600bp具有2条带、在450bp和600bp之间具有3条带；标准15)：采用所述Q178引物对时，满足如下带型：在600bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有3条带；标准16)：采用所述Bt特异性引物对时，满足如下带型：在900bp和1000bp之间具有1条亮带。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用
<130> HN-2001-180102A
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 1
cccacccttt tcttcttttt 20
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<400> 26
tggtggattc acatccaaag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 27
ggggcgatat atacgatgtt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 28
atggtctgtc tttccagctc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 29
cattccccac tttgctctta c 21
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 30
catgtttctt tgcccatc 18
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 31
gggcccgctg aatccaactg gagaggc 27
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 32
ccatacaact gcttgagtaa cccagaagtt g 31

Claims (8)

1.用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物，其特征在于，包括：
由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对1；
由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的下游引物组成的引物对2；
由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.6所示的下游引物组成的引物对3；
由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.8所示的下游引物组成的引物对4；
由核苷酸序列为SEQ ID No.9所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.10所示的下游引物组成的引物对5；
由核苷酸序列为SEQ ID No.11所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.12所示的下游引物组成的引物对6；
由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的下游引物组成的引物对7；
由核苷酸序列为SEQ ID No.15所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.16所示的下游引物组成的引物对8；
由核苷酸序列为SEQ ID No.17所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.18所示的下游引物组成的引物对9；
由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.20所示的下游引物组成的引物对10；
由核苷酸序列为SEQ ID No.21所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.22所示的下游引物组成的引物对11；
由核苷酸序列为SEQ ID No.23所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.24所示的下游引物组成的引物对12；
由核苷酸序列为SEQ ID No.25所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.26所示的下游引物组成的引物对13；
由核苷酸序列为SEQ ID No.27所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.28所示的下游引物组成的引物对14；
由核苷酸序列为SEQ ID No.29所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.30所示的下游引物组成的引物对15；以及，
由核苷酸序列为SEQ ID No.31所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.32所示的下游引物组成的引物对16。
2.权利要求1所述的SSR引物在构建中棉所50指纹图谱中的应用。
3.权利要求1所述的SSR引物在鉴定中棉所50中的应用。
4.一种中棉所50的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待测棉花品种的基因组DNA；（2）以提取的DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；（3）对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，如果PCR扩增产物满足以下标准1）至标准16），则判定待测棉花品种为中棉所50或候选的中棉所50；
其中，标准1）：采用所述引物对1时，满足如下带型：大于400bp具有1条弱带、在300bp和100bp之间具有3条亮带；标准2）：采用所述引物对2时，满足如下带型：在600bp和500bp之间具有2条亮带、在500bp和400bp之间具有1条较弱带、在400bp和300bp之间具有2条亮带；标准3）：采用所述引物对3时，满足如下带型：在500bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有2条亮带；标准4）：采用所述引物对4时，满足如下带型：在500bp和400bp之间具有2条亮带、在200bp以下具有1条粗带；标准5）：采用所述引物对5时，满足如下带型：在300bp以上无带、在300bp和200bp之间具有1条粗带；标准6）：采用所述引物对6时，满足如下带型：在400bp以上具有2条弱带、在300bp和200bp之间仅具有1条亮带；标准7）：采用所述引物对7时，满足如下带型：在1000bp和900bp之间具有1条带，在400bp和200bp之间具有4条带；标准8）：采用所述引物对8时，满足如下带型：在400bp和300bp之间具有2条带、在300bp和200bp之间具有1条带；标准9）：采用所述引物对9时，满足如下带型：在800bp和700bp之间具有1条带、在700bp和600bp之间具有1条带；标准10）：采用所述引物对10时，满足如下带型：在600bp和500bp之间仅具有1条细带、在300bp和200bp之间仅具有1条粗带；标准11）：采用所述引物对11时，满足如下带型：在300bp以上无明显条带、在300bp和100bp之间具有3条带；标准12）：采用所述引物对12时，满足如下带型：在600bp和400bp之间具有3条带、300bp和200bp之间具有2条带；标准13）：采用所述引物对13时，满足如下带型：在800bp和500bp之间具有2条亮带、在300bp和200bp之间具有3条带；标准14）：采用所述引物对14时，满足如下带型：大于600bp具有2条带、在450bp和600bp之间具有3条带；标准15）：采用所述引物对15时，满足如下带型：在600bp和450bp之间具有1条亮带、在400bp和200bp之间具有3条带；标准16）：采用所述引物对16时，满足如下带型：在900bp和1000bp之间具有1条亮带。
5.一种中棉所50指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待检测样本中棉所50的种皮、种胚基因组DNA；（2）分别以提取的种皮、种胚基因组DNA为模板，以权利要求1所述SSR引物建立PCR反应体系，进行PCR扩增；（3）对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据凝胶电泳结果，对棉花品种DNA的扩增带型结果形成数字编码，构建得到棉花品种中棉所50的DNA指纹图谱。
6.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于：步骤（3）按照引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16的固定排列顺序，通过凝胶电泳结果，依次记录棉花品种中棉所50的种皮、种胚经每对SSR引物扩增出现的条带类型，依据各个条带类型所赋予的数字，形成带型数字编号，即为棉花品种中棉所50的DNA指纹图谱。
7.按照权利要求4所述的鉴定方法或权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应体系包括：反应体系的总体积为10µL，其中，含Mg2+的2×Buffer 5.0uL、2mmol/L的dNTPs 2.0μL、KOD FX特异的Taq 酶0.2μL、上游引物和下游引物各0.3μL、DNA模板1.0µL、ddH2O 1.2µl。
8.按照权利要求4所述的鉴定方法或权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增的程序包括：94℃ 2 min；98℃ 10 s→每对SSR引物的退火温度 30 s→68℃30 s，共30个循环；4℃ Forever；
其中，所述每对SSR引物的退火温度为：引物对1的退火温度为55℃；引物对2的退火温度为55℃；引物对3的退火温度为57℃；引物对4的退火温度为55℃；引物对5的退火温度为55℃；引物对6的退火温度为55℃；引物对7的退火温度为55℃；引物对8的退火温度为57℃；引物对9的退火温度为55℃；引物对10的退火温度为55℃；引物对11的退火温度为57℃；引物对12的退火温度为59℃；引物对13的退火温度为57℃；引物对14的退火温度为57℃；引物对15的退火温度为55℃；引物对16的退火温度为57℃。
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利用SSR 分子标记构建邯棉559、邯棉802 和邯郸885 的指纹图谱;付小琼 等;《中国棉花》;20171231;第44卷(第9期);第8-12页 *

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