CN111534628B - 用于鉴定美洲黑杨性别的ssr分子标记引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用，属于分子遗传育种技术领域。本申请以提取的美洲黑杨基因组DNA为模板，利用SSR分子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的引物对进行PCR扩增，若扩增产物中含有与SSR分子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的分子量相符的条带，则所述待测美洲黑杨为雄株，反之为雌株。在美洲黑杨育种和栽培管理过程中，可以在苗期利用叶片等营养组织提取DNA进行性别鉴定，用于美洲黑杨不飞絮雄株的早期选择，也可用于美洲黑杨造林过程中，对苗木性别的监测与管理，从而有效控制苗木达到性成熟龄后飞絮带来的问题。

Description

用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种用于鉴定美洲黑杨性别 的SSR分子标记引物组及其应用。

背景技术

杨树(Populus spp.)是世界上分布最广、栽培面积最大的速生用材树种之 一，对经济发展、环境建设发挥着重要的作用。我国杨树人工林面积约9000万 亩，居世界首位，另外我国还有3750万亩的杨树天然林。美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)是杨属(Populus)黑杨派树种，原产于北美洲，分布于美国 西部、中部和西南部，加拿大西南端及墨西哥西北部。美洲黑杨是生长迅速的 高大乔木，是重要的速生用材造林树种之一，在全球广泛引种栽培。美洲黑杨 成具有成材速度快、抗性好、生态适应性强的特点。我国于20世纪70年代引 进美洲黑杨，在我国长江中下游和黄淮海平原大面积推广，已成为我国南方速生杨的主要栽培品种。仅以江苏为例，美洲黑杨栽培面积达1400万亩，蓄积量 5500万m³，年产木材635万m³，碳汇12587万吨。但由于杨树飞絮带来严重 环境问题，引发越来越广泛的社会关注。据测算，一棵成年杨树雌株每年产生 超过1公斤的杨絮，以前江苏主推的美洲黑杨无性系基本上是雌株，每年产生 超10万吨的飞絮。

杨絮在每年春季漫天飞舞，已经成为当前制约杨树产业发展重要因素。杨 树飞絮会造成严重的环境污染，并带来火灾隐患等一系列问题。杨树是雌雄异 株植物，杨絮是雌株在性成熟后开花产生的，它是附着在种子表面的一种絮状 纤维，由子房底部胎座表层细胞凸起发育形成。雄株花序只有花药，没有子房， 则不会产生种子和杨絮。目前生产上主要采用选育和种植杨树雄株来解决这一 问题。因此，开发可靠的方法技术，用于美洲黑杨性别早期鉴定有重要应用价 值。

美洲黑杨雌雄性别的差异主要体现在花序结构上，雌花由三片柱头和子房 构成，雄花由多个花药簇生在花托上构成。其它器官包括根、茎、叶、树皮均 不能体现雌雄之间的差别。但是，美洲黑杨的童期较长，一般为6-7年才达到 开花年龄。所以在品种的选育过程中，由于不能在苗期进行性别鉴定，往往需 要等到植株开花后才能选育不产生杨絮的雄株，因此，开发出用于苗期性别鉴 定的技术手段，可以大大缩短育种周期，提高选育效率。另外，在美洲黑杨造 林与推广过程中，由于缺乏在苗期进行性别鉴定的技术方法，无法对美洲黑杨 苗木的性别进行有效管理，一旦雌株混入，达到性成熟龄后就会带来飞絮污染。因此，开发用于美洲黑杨早期性别鉴定的分子标记，对美洲黑杨营林过程中苗 木的性别监测与管理也有重要应用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供上述用 于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记的引物组；本发明所要解决的再一问题是 提供上述SSR分子标记及其引物组在美洲黑杨性别早期鉴定和性别标记辅助选 择育种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组，SSR分子标记选自 NJFU582、NJFU600和NJFU602中的至少一个；引物组包括用于扩增SSR分 子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的引物对；

其中，用于扩增SSR分子标记NJFU582的引物对如下：

NJFU582正向引物：5′-CAATATTTGTATTGCCCGTAG-3′；

NJFU582反向引物：5′-CCACTGTTCCATGTTTTAAGG-3′；

用于扩增SSR分子标记NJFU600的引物对如下：

NJFU600正向引物：5′-GGACAACACACAAGGCTCTGC-3′；

NJFU600反向引物：5′-TCGTGGGTTGATGTGTAGAGG-3′；

用于扩增SSR分子标记NJFU602的引物对如下：

NJFU602正向引物：5′-TGCAAGTACAACAGGAGTTCAA-3′；

NJFU602反向引物：5′-TCCACCGACAAGAGACAAAGA-3′。

上述引物对中的引物经过经过修饰和/或经过标记物标记也在本申请的保 护范围。

含有上述用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组的试剂盒。

所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨分子标记辅助选择育种中的应用。

所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨性别鉴定、监测、管理中的应用。

所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨不飞絮雄株选育中的应用。

进一步的，SSR分子标记引物组在美洲黑杨性别鉴定、监测、管理中的应 用，包括以下步骤：提取待测美洲黑杨的基因组DNA；以提取的美洲黑杨基因 组DNA为模板，利用SSR分子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的引物对 进行PCR扩增，若扩增产物中含有与SSR分子标记NJFU582、NJFU600和 NJFU602的分子量相符的条带，则所述待测美洲黑杨为雄株，反之为雌株。

进一步的，PCR反应体系为：每25μL体系中，20ng/μL DNA模板2μL， 10μmol/μL正、反向引物各0.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，10mmol/L DNTPs 0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，ddH₂O 17.3μL。

进一步的，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火 45s，72℃延伸60s，共35个循环；再72℃延伸10min，最后4℃保温。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：

本发明通过美洲黑杨全同胞F₁群体，对性别决定位点进行精细定位；再结 合美洲黑杨自然群体材料进行性别决定位点关联分析。最后，美洲黑杨的性别 决定位点定位在19号染色体236Kb区间内。然后利用第三代高通量测序技术 对美洲黑杨雄株进行de novo全基因组测序组装，获得性别紧密连锁区的X染 色体和Y染色体单倍型序列。通过比对性别定位区间X和Y染色体单倍型序 列，结合自然群体位点杂合度分析，找到了一段42Kb的Y染色体特异的半合 子序列。根据这段Y染色体特异的半合子序列开发SSR引物，对美洲黑杨自然群体材料进行PCR扩增，筛选出美洲黑杨雄株特异的三对SSR通用引物 (NJFU582、NJFU600和NJFU602)。这三对引物在美洲黑杨雄株中均能扩增 出清晰稳定的PCR产物电泳谱带，但在雌株中不能扩增出任何PCR产物。利 用本发明开发的通用SSR引物NJFU582、NJFU600和NJFU602可以实现美洲 黑杨性别的早期鉴定，可以应用于美洲黑杨造林苗木的性别监测，在不飞絮杨 树分子标记辅助选择育种和杨树飞絮管理中都有重要应用。

附图说明

图1是美洲黑杨性别决定位点的精细定位图；图中，美洲黑杨的性别决定 位点，利用全同胞F₁群体，被精细定位在19号染色体的近端粒区；图A：通 过72株小群体的初定位结果；图B：通过1077株大群体精细定位在236Kb的 区间内；图中SLR(Sex-linked region)为性别紧密连锁区；

图2是美洲黑杨性别决定位点的全基因组关联分析(GWAS)结果图；图 中，美洲黑杨的性别关联序列信号均分布在19号染色体的近端粒区；图中SLR (Sex-linked region)为性别紧密连锁区；

图3是美洲黑杨性别紧密连锁区X和Y染色体单倍型间的序列比对图；图 中TCP、CLC、MET1为位于半合子区附近的编码基因，Tel为端粒；Y染色体 上的环状片段即美洲黑杨性别决定区为Y染色体特异的半合子序列；

图4是扩增NJFU582的引物对美洲黑杨自然群体材料进行性别分子鉴定的 凝胶电泳图；图A是36棵雄株扩增产物的电泳谱带；图B是36棵雌株的扩增 产物电泳结果，雌株中均未扩增出任何PCR产物电泳谱带；

图5是扩增NJFU600的引物对美洲黑杨自然群体材料进行性别分子鉴定的 凝胶电泳图；图A是36棵雄株扩增产物的电泳谱带；图B是36棵雌株的扩增 产物电泳结果，雌株中均未扩增出任何PCR产物电泳谱带；

图6是扩增NJFU602的引物对美洲黑杨自然群体材料进行性别分子鉴定的 凝胶电泳图；图A是36棵雄株扩增产物的电泳谱带；图B是36棵雌株的扩增 产物电泳结果，雌株中均未扩增出任何PCR产物电泳谱带。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明 的分子生物学实验方法，均可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁 克一书中所列的方法或本领域的常规方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进 行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)美洲黑杨的性别决定位点的精细定位

于2012年构建了美洲黑杨杂交F₁群体，该群体包括1077个杂交子代，种 植于泗洪林场。截止到2019年，杂交子代已经全部达到性成熟。获得杂交子代 的性别表型。首先，在杂交群体中随机选择72个子代个体进行性别决定位点的 初步定位，结果性别决定点定位于19号染色体的近端粒区，在性别位点与SSR 位点N110之间只检测到一个重组单株(图1A)。然后，在目标区间内开发SSR 引物，并利用全部的杂交子代1077株个体对性别位点进行精细定位。结果美洲 黑杨性别决定位点被定位于19号染色体近端粒的236Kb区间内，在性别决定 位点和SSR位点N362之间共检测到了4个重组单株，性别决定位点与SSR位 点N283和N293完全连锁(图1B)。

(2)美洲黑杨性别决定位点的全基因组关联分析

在泗洪林场的美洲黑杨种质资源圃中，选择49棵雌株，46棵雄株进行高 通量的重测序，测序深度为杨树基因组的20倍。以杨树种质创新与品种改良重 点实验室构建的美洲黑杨基因组为参考序列，对美洲黑杨的性别决定位点进行 基于SNP的全基因组关联分析。结果显示，美洲黑杨的性别决定位点被关联到 19号染色体的近端粒区，且与性别100％的关联信号全部位于分离群体的精细 定位区间内(SLR区)(图2)。

(3)美洲黑杨性别紧密连锁区的单倍型构建

选择杂交群体的母本和一株雄株子代进行全基因组测序，测序平台是 PacBioSequel，每个个体获得75倍测序深度的原始数据。通过基因组组装，获 得了美洲黑杨雌、雄个体的参考基因组。利用精细定位结果中的连锁引物进行 性别决定区间的锚定。结果显示，通过与性别连锁的SSR引物进行雌、雄参考 基因组的锚定时，在雄株参考基因组中得到X和Y染色体单倍型在性别决定区 间的完整序列。比对X与Y染色体单倍型序列，发现Y染色体上有一段42Kb 半合子序列，全基因组关联分析中发现的所有与性别100％关联的信号全部位于 该区段内(美洲黑扬性别决定区)。因此，这段Y染色体特异的半合子序列， 可以用于开发鉴定美洲黑杨性别的特异引物(图3)。

(4)美洲黑杨性别鉴定引物开发

根据美洲黑杨Y染色体特异的半合子序列，利用BatchPrimer3进行SSR引 物的开发设计。设计的参数要求包括扩增产物大小为100-350bp，Tm值为55-65 ℃。在美洲黑杨种质资源库中随机选择雌、雄各5株进行引物的筛选。最终选 择了3对SSR引物(NJFU582、NJFU600和NJFU602)在雄株中可以稳定扩增 得到清晰稳定的PCR产物电泳谱带，而在雌株中则得不到任何扩增产物。利用 美洲黑杨种质资源库中性别已知的426株个体，用于验证上述3对引物对美洲 黑杨种性别鉴定的准确性。结果显示，3对引物的鉴定结果均为100％准确。图 4、图5和图6分别是SSR引物NJFU582、NJFU600和NJFU602对美洲黑杨种 质材料性别鉴定的凝胶电泳图，图4、图5、图6中，图A是36棵雄株扩增产 物的电泳谱带；图B是36棵雌株的扩增产物电泳结果，雌株中均未扩增出任 何PCR产物电泳谱带。

在本申请中使用到的美洲黑杨材料来源于美洲黑杨种质资源库。该种质资 源库保存在江苏省泗洪林场，材料于1994年从美国密西西比河沿岸的美洲黑杨 自然群体中采集，美洲黑杨种质资源库于1998年建成。每年对资源库中的材料 进行生长量测定和性别调查，获得了所有植株的准确的性别数据，为性别鉴定 引物的开发和验证提供了的材料。目前主推的美洲黑杨品种，大多出自该种质 资源库中的材料或其杂交后代。因此，选择该种质资源库中美洲黑杨材料进行 性别鉴定引物的验证，有广泛的代表性。

(5)在上述美洲黑杨性别鉴定引物开发和实施过程中，使用到的关键操作 步骤说明如下：

1)美洲黑杨基因组DNA提取：

选取美洲黑杨的幼嫩叶片，保存在-80℃中备用。称取0.1g采集的叶片样品 在液氮中充分研磨，使用天根生化科技有限公司生产的植物DNA提取试剂盒(目 录号：DP320)，按照说明书中的操作步骤进行DNA提取。提取获得的DNA溶 液使用Thermo公司生产的NanoDrop 2000进行浓度测定，并调整最终模板浓度 为20ng/μL，用于后续的PCR扩增检测。

2)PCR反应体系

以提取的美洲黑杨基因组DNA为模板，且模板浓度为20ng/μL，选择25μL 反应体系用于PCR反应。其反应体系包括以下试剂和浓度：

PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃ 延伸60s，共35个循环；再72℃延伸10min，最后4℃保温。

3)PCR反应产物检测

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对于PCR反应产物的检测具有灵敏度高，检测 通量大的优点。因此，本发明专利推荐使用该方法电泳对PCR扩增后的产物进 行条带检测。具体的凝胶电泳方法如下：

①电泳：扩增产物经非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度30％，凝胶大 小180×120×1.5mm，电泳缓冲液为0.5×TBE，恒压200v，电泳1-1.5h。

②银染：在电泳结束后，把凝胶取下，放置在AgNO3溶液(2.0g AgNO3 溶于1000ml水中)中银染15min，溶液倒入废液回收桶中。

③显色：用显色液(20gNaOH，加水至1000mL)和10mL甲醛(现用现加) 显色，共5-8min，溶液倒入废液回收桶中

④漂洗：用自来水小心清洗2-3次凝胶，主要目的是清洗凝胶上的甲醛和 NaOH。

⑤拍照，读胶：把凝胶放置在X线胶片观察灯上进行拍照。根据每个电泳 道上是否有目的条带进行美洲黑杨植株性别鉴定。若泳道中存在目的条带，则该 植株为雄株，否则为雌株。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组及其应用

<130> 1

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> NJFU582正向引物(artificial)

<400> 1

caatatttgt attgcccgta g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> NJFU582反向引物(artificial)

<400> 2

ccactgttcc atgttttaag g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> NJFU600正向引物(artificial)

<400> 3

ggacaacaca caaggctctg c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> NJFU600反向引物(artificial)

<400> 4

tcgtgggttg atgtgtagag g 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> NJFU602正向引物(artificial)

<400> 5

tgcaagtaca acaggagttc aa 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> NJFU602反向引物(artificial)

<400> 6

tccaccgaca agagacaaag a 21

Claims (8)

1.用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组，其特征在于，所述SSR分子标记选自NJFU582、NJFU600和NJFU602中的至少一个；所述引物组包括用于扩增SSR分子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的引物对；

其中，用于扩增SSR分子标记NJFU582的引物对如下：

NJFU582正向引物：5'- CAATATTTGTATTGCCCGTAG -3'；

NJFU582反向引物：5'- CCACTGTTCCATGTTTTAAGG -3'；

用于扩增SSR分子标记NJFU600的引物对如下：

NJFU600正向引物：5'- GGACAACACACAAGGCTCTGC -3'；

NJFU600反向引物：5'- TCGTGGGTTGATGTGTAGAGG -3'；

用于扩增SSR分子标记NJFU602的引物对如下：

NJFU602正向引物：5'- TGCAAGTACAACAGGAGTTCAA -3'；

NJFU602反向引物：5'- TCCACCGACAAGAGACAAAGA -3'。

2.含有权利要求1所述的用于鉴定美洲黑杨性别的SSR分子标记引物组的试剂盒。

3.权利要求1所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨分子标记辅助选择育种中的应用。

4.权利要求1所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨性别鉴定、监测、管理中的应用。

5.权利要求1所述的SSR分子标记引物组在美洲黑杨不飞絮雄株选育中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：提取待测美洲黑杨的基因组DNA；以提取的美洲黑杨基因组DNA为模板，利用SSR分子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的引物对进行PCR扩增，若扩增产物中含有与SSR分子标记NJFU582、NJFU600和NJFU602的分子量相符的条带，则所述待测美洲黑杨为雄株，反之为雌株。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR反应体系为：每25μL体系中，20ng/μL DNA模板 2μL，10μmol/μL 正、反向引物各0.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，10mmol/LDNTPs 0.5μL，25mmol/L MgCl₂ 1.5μL，5U/μL Taq酶 0.2μL，ddH₂O 17.3μL。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环；再72℃延伸10min，最后4℃保温。

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