CN102080080B - 一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，属于棉花遗传育种技术领域。通过构建陆地棉种内的分子标记遗传连锁图谱，对抗黄萎病性状进行QTL定位，选用进入连锁群区段的显著性SSR标记及其与抗病QTLs连锁的SSR标记对不同的陆地棉株系进行筛选，最终得到了可用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的三个SSR标记。这三个标记包括其引物和引物组合，适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种。利用获得的分子标记，对不同陆地棉株系进行抗黄萎病分子标记辅助选择，最后得到抗黄萎病的株系。

Description

一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记

技术领域

本发明属于棉花遗传育种技术领域，涉及用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，具体涉及陆地棉抗黄萎病性状的分子标记定位、分子标记辅助选择效果评价及育种应用。

背景技术

利用分子标记技术，筛选不受环境因子影响，并与我国现有的抗黄萎病种质的抗性基因紧密连锁的分子标记，就可应用于辅助选择抗病育种，从而加速抗黄萎病育种的进程。

筛选与数量性状基因相连锁的分子标记的常用方法是进行QTL定位。QTL定位通过分子标记进行遗传连锁分析，检测数量性状基因座并估算其效应大小。由于陆地棉种内的遗传基础比较狭窄，国内外在进行棉花抗黄萎病性状的QTL定位时，常用陆地棉和海岛棉的种间杂交来构建分离群体(高玉千等，棉花抗黄萎病基因的QTL定位，棉花学报，2003，15(2)：73～78；杜威世等，棉花黄萎病抗性基因SSR标记研究，西北农林科技大学学报，2004，32(3)：20～24；Bolek等，Mapping of verticillium wilt resistance genes in cotton，Plant Science，2005，168：1581～1590；甄瑞等，海岛棉抗黄萎病基因SSR标记研究，棉花学报，2006，18(5)：269～272；昝伟等，海岛棉抗黄萎病性状分子标记的研究及QTL的定位，新疆农业科学，2008，45(5)：805～808)，这样得到的抗病QTL常常来自海岛棉亲本，获得的分子标记只适用于海岛棉与陆地棉的杂交组合后代进行分子标记辅助选择(李志坤等，棉花抗黄萎病基因的分子标记辅助选择研究。中国科技论文在线，http://www.paper.edu.cn)。而当前棉花生产及育种实践中大量使用的是陆地棉品种或陆地棉与陆地棉品种之间配制的杂交组合，因此，如何发掘并有效利用陆地棉品种中与抗性基因相连锁的分子标记，是实现分子标记辅助选择抗病育种的关键。

对于陆地棉抗黄萎病基因的分子标记研究，目前仅限于找到了抗病标记，并没有深入地对这些抗病相关的标记进行抗性方面的研究(蒋锋等，陆地棉抗黄萎病基因的分子标记定位。中国科学C辑，2009，39：849-861)，或者在验证分子标记的辅助选择效果时，仅仅局限于双亲分离群体，而没有将其应用到整个大田育种群体(王芙蓉等，陆地棉品种抗黄萎病性状的分子标记及其辅助选择效果。棉花学报，2007，19：424-430)。

为了开发陆地棉抗黄萎病性状的分子标记，申请人构建了陆地棉种内的分子标记遗传连锁图谱，利用单因子方差分析及复合区间作图对抗黄萎病性状进行QTL定位，选用进入连锁群区段的显著性SSR标记及其与QTLs连锁的SSR标记对不同的陆地棉株系进行筛选，最终得到了可用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的标记组合。

发明内容

本发明需要解决的问题是获得适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的分子标记，包括其引物和引物组合，并将其用于陆地棉抗病材料的选育。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的SSR分子标记，按照下列步骤获的：

1.构建抗黄萎病陆地棉品种‘常抗棉’和感黄萎病陆地棉标准系‘TM-1’杂交的F₂分离群体，利用SSR、RAPD和SRAP三种分子标记构建陆地棉品种间分子标记遗传连锁图，同时利用F_2∶3家系对抗黄萎病性状进行分子标记定位。结果如图1所示。

2.选择单因子方差分析中表现显著性的SSR标记，和复合区间作图分析中与抗性QTL紧密连锁的SSR标记。这些标记在连锁图谱上的分布在附图1中用下划线标出。

3.选择不同的陆地棉株系，利用病圃对这些陆地棉株系进行抗黄萎病性鉴定，这些株系的编号及系圃在附图2所示。

4.从田间取步骤3)的陆地棉株系和常抗棉、TM-1植株的嫩绿叶片提取其总DNA。

5.用步骤2)的SSR引物扩增步骤4)所示的材料(附图3)。

6.分析图2所示的陆地棉株系标记基因型，获得陆地棉抗黄萎病性状的分子标记，附图4。

7.利用获得的抗黄萎病相关的SSR分子标记，对不同陆地棉株系进行分子标记辅助选择，最后得到抗黄萎病的株系。

本发明的有益效果是：

1.本发明将陆地棉株系按标记基因型分为“抗病标记基因型”和“感病标记基因型”，在对株系进行分子标记辅助选择时，首先淘汰掉大部分“感病标记基因型”株系和“感病”表现型株系，大大减小了选择的工作量；同时，要求当选株系在基因型上含有一个以上的本发明获得的抗黄萎病相关的分子标记，在表现型上要求“抗病”或“耐病”，保证了表现型和基因型的一致性，大大提高了选择的效率和准确性。

2.综合利用本发明的3个标记(附图4种只标出了两个)对陆地棉株系进行筛选，决选到的5个抗黄萎病株系在2008年、2009年的相对病指，最高的为19.94，最低得为15.31，按抗病反应型分级标准全都达到了抗病水平。这说明利用本发明获得的分子标记还可以筛选到抗病性表现稳定的陆地棉株系，提高抗病育种中选择的效率和选择的准确性。

附图说明

图1：是本发明实施例1所构建的棉花分子标记遗传连锁图谱(常抗棉和TM-1的F₂代的遗传连锁图谱)及其QTL定位信息，其中带下画线的标记为本发明实施例1所选择的SSR标记，含SSR标记39个，RAPD标记2个，SRAP标记7个，图距由Kosombi函数转化而来，最大图距46.1cM

图2：是本发明实施的棉花株系编号及其系谱来源。

图3：是本发明的引物对棉花株系的扩增图(SSR引物在陆地棉后代选系中的基因型)，M为Marker；1、Marker；2、TM-1；3、常抗棉；其它泳道为陆地棉后代选系。

图4：是本发明获得的陆地棉抗黄萎病性状的分子标记序列。

具体实施方式

实施例1

1.取96个陆地棉株系(如图2所示)，分别以常抗棉、TM-1作为对照，将所述的材料种于黄萎病病圃，单行区，两次重复；

2.于播种前接种中等致病力的安阳菌系黄萎病菌，于6月、7月、8月黄萎病发病高峰期以感病对照病株率达80％或病指达50左右时，调查各供试材料的发病情况，采用5级制进行棉花黄萎病分级(表1)，并计算病情指数和相对病情指数，最后按材料计算其平均数作为平均病指。病情指数和相对病情指数的计算公式如下：

病情指数DI＝【(一级病株数×1+二级病株数×2+三级病株数×3+四级病株数×4)÷(调查总株数×4)】×100

相对病情指数RDI＝校正系数K×鉴定材料病指

校正系数K＝50/感病对照的实际病指，50为规定感病对照的标准病指表1：

3.从所述的田间材料植株上取嫩绿叶片提取其总DNA，具体方法参照1993年Paterson等(Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF.A rapid method for extractionof cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP and PCR analysis[J].Plant Mol Biol Rep，1993，11：122-127)报道的方法提取；

4.利用图1中的SSR标记进行分析，具体步骤如下：

4.1SSR标记分析：

PCR扩增反应体系为10μL：25ngDNA，1μM上游引物，1μM下游引物，1×buffer(67mmol/L Tris-HCl，pH8.8，16mmol/L(NH₄)₂SO₄)，0.2mmol/L dNTPs，2.5mmol/L MgCl₂，，TaqDNA聚合酶0.5U。

PCR反应程序：95℃变性3min；94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸3min。10℃保存。PCR扩增在PTC-200Themocycler上进行。

PCR产物通过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离，电泳在DYCZ-30型垂直电泳槽上进行210V恒压条件下电泳1h，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液用1×TBE，。电泳结束后进行染色，银染的具体操作可以参考相关文献(张军，武耀庭，郭旺珍等.棉花微卫星标记的PAGE/银染快速检测[J].棉花学报，2000，12(5)：267-269.)，有带或无带分别记录为+和-

4.2数据整理及分析

对陆地棉株系的分子标记记录方法如下：+表示具有常抗棉标记的显性标记基因型，-表示不具有常抗棉标记的显性标记基因型，++表示具有常抗棉标记的共显性纯合基因型，+-表示共显性杂合基因型，--表示具有TM-1标记的共显性纯合基因型。

首先对标记基因型分离情况进行统计，对每个标记按标记基因型进行分组，进一步计算每组的相对病指。对于显性标记，如果利用该标记的标记基因型进行分组后，每组的相对病指数值大小按无标记基因型(-)到有标记基因型(+)的排列顺序依次递减，则确定该标记在辅助选择上具有有效性；对于共显性标记，如果利用该标记的标记基因型进行分组后，每组的相对病指数值大小按无标记纯合基因型(--)、杂合基因型(+-)、有标记纯合基因型(++)的排列顺序依次递减，则确定该标记在辅助选择上具有有效性。

对于初步确定的有效性标记，利用SAS软件对分组后每组的平均相对病指数值进行差异显著性分析，只有达到显著或极显著水平差异的标记，才被确定为适用于陆地棉抗黄萎病分子标记辅助选择育种的SSR分子标记。

4.3有效性SSR标记分析

根据相对病指数值大小与标记基因型的符合情况，得到4个有效性标记，经标记BNL1721筛选，96个株系中有标记纯合基因型个体的平均相对病指27.87，无标记个体的平均相对病指40.49，两者差值12.62，极差异显著；经标记BNL2733和BNL3452筛选之后，有/无标记基因型个体的平均相对病指差值分别是12.05和17.43，前者达显著水平，后者属于极显著差异(见表2)。BNL3660在本研究中表现为共显性，筛选之后，平均相对病指虽然从有标记纯合基因型、杂合基因型到无标记纯合基因型呈现依次递减规律，但3种基因型之间的差值较小，变化范围仅在2.06到5.11之间(见表2)，不同标记基因型个体之间的平均相对病指差异不显著。

表2各标记基因型植株的平均相对病指

4.4经差异显著性分析，本发明获得三个陆地棉抗黄萎病性状的SSR分子标记(附图4)，均为显性分子标记，其最佳PCR退火温度分别为：60℃，PCR扩增产物长度为：160-260bp。

实施例2

1.取不同的陆地棉株系种植于田间(如图2)。

2.从所述的田间材料植株上的嫩绿叶片中提取其总DNA。

3.利用病圃对陆地棉株系进行抗黄萎病鉴定，具体鉴定方法见实施例1。

4.利用本发明的单个SSR引物序列进行分析，具体步骤如下：

4.1SSR引物标记分析：

PCR扩增反应体系为10μL：25ngDNA，1μM上游引物，1μM下游引物，1×buffer(67mmol/L Tris-HCl，pH8.8，16mmol/L(NH₄)₂SO₄)，0.2mmol/LdNTPs，2.5mmol/L MgCl₂，，TaqDNA聚合酶0.5U。

PCR反应程序：95℃变性3min；94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸3min。10℃保存。PCR扩增在PTC-200Themocycler上进行。

4.2PCR产物通过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离，电泳在DYCZ-30型垂直电泳槽上进行210V恒压条件下电泳1h，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液用1×TBE，。电泳结束后进行银染。

4.2数据整理及分析

对陆地棉株系的分子标记记录方法如下：+表示有标记基因型，-表示无标记基因型。

将96个株系按“有标记基因型”和“无标记基因型”分为两组，将前者定为“抗病标记基因型”，后者定为“感病标记基因型”。将抗病性鉴定获得的株系的相对病情指数作为该株系的抗病表现型，其中，相对病指在1-20范围内为“抗病”，20-35为“耐病”，35以上为“感病”。

对株系选择的标准为：

(1)表现型为“抗病”，标记基因型为“抗病标记基因型”，则该株系当选。

(2)表现型为“耐病”，有两个以上的标记基因型为“抗病标记基因型”，则该株系当选。

(3)表现型为“感病”的株系均淘汰。

(4)表现型为“抗病”，三个标记基因型均为“感病标记基因型”的株系淘汰。

(5)表现型为“耐病”，有两个以上的标记基因型为“感病标记基因型”的株系淘汰。

4.3单个分子标记辅助选择的效果

根据4.2中对株系的选择标准，利用标记BNL1721筛选到48个抗病标记基因型株系，其中有11个株系表现为抗病，10个株系表现为耐病，27个株系表现为感病，因此利用该标记筛选到11个抗病株系；标记BNL2733筛选到5个抗病基因型株系其表现型均为抗病；标记BNL3452筛选到54个抗病基因型株系，有14个株系表现抗病，8个株系表现为耐病，32个株系表现为感病，因此利用该标记筛选到14个抗病株系。

实施例3

1.取不同的陆地棉株系(如图2)种植于田间。

2.从所述的田间材料植株上的嫩绿叶片中提取其总DNA。

3.利用病圃对陆地棉株系进行抗黄萎病鉴定，具体鉴定方法见实施例1。

4.综合利用本发明的三个SSR引物序列进行分析，具体步骤如下：

4.1SSR引物标记分析：

PCR扩增反应体系为10μL：25ngDNA，1μM上游引物，1μM下游引物，1×buffer(67mmol/L Tris-HCl，pH8.8，16mmol/L(NH₄)₂SO₄)，0.2mmol/L dNTPs，2.5mmol/L MgCl₂，，TaqDNA聚合酶0.5U。

PCR反应程序：95℃变性3min；94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸3min。10℃保存。PCR扩增在PTC-200Themocycler上进行。

PCR产物通过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子量大小分离，电泳在DYCZ-30型垂直电泳槽上进行210V恒压条件下电泳1h，凝胶大小180mm×120mm×2mm，电泳缓冲液用1×TBE，。电泳结束后进行银染。

4.2数据整理及分析

对陆地棉株系的分子标记记录方法如下：+表示有标记基因型，-表示无标记基因型。将96个株系按“有标记基因型”和“无标记基因型”分为两组，将前者定为“抗病标记基因型”，后者定为“感病标记基因型”。将抗病性鉴定获得的株系的相对病情指数作为该株系的抗病表现型，其中，相对病指在1-20范围内为“抗病”，20-35为“耐病”，35以上为“感病”。

对株系选择的标准为：

(1)表现型为“抗病”或“耐病”，并且三个标记基因型均为“抗病标记基因型”，则该株系当选；

(2)表现型为“抗病”或“耐病”，有一个以上的标记基因型为“感病标记基因型”的株系淘汰；

(3)表现型为“感病”的株系被淘汰。

4.3多个分子标记辅助选择的效果

综合利用3个标记对陆地棉株系进行筛选，最后决选到5个同时含有本发明的三个标记的株系(表3)，这些株系在2008年、2009年的相对病指，最高的为19.94，最低的为15.31，按抗病反应型分级标准全都达到了抗病水平。这就说明利用本发明获得的分子标记可以提高抗病育种中选择的效率和选择的准确性。

表3：决选株系在不同年份的平均相对病指

Claims (5)

1.一种用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，其特征在于，按照下列步骤获得：

1)利用抗黄萎病陆地棉品种“常抗棉”和感黄萎病陆地棉标准系“TM-1”杂交的F2分离群体，对抗黄萎病性状进行分子标记定位；

2)依据SSR标记，对田间育种群体进行分组；

3)分析每组的相对病指与标记基因型的有效性符合情况；

4)标记基因型组间的相对病指差异显著或极显著的标记，被确定为陆地棉抗黄萎病辅助选择育种的SSR分子标记；

被确定为陆地棉抗黄萎病辅助选择育种的SSR分子标记同时含有三个，标记名称分别为BNL1721、BNL2733和BNL3452；所述的三个SSR标记需用三对上、下游引物进行扩增；

所述的三对上、下游引物为：标记BNL1721的上游引物为5′-TGTCGGAATCTTAAGACCGG-3′和下游引物为5′-GCGCAGATCCTCTTACCAAA-3′，标记BNL2733的上游引物为5′-TCGAGGGTTTAGGGTTCCTG-3′和下游引物为5′-AATTGTGCAACACCTCCCTC-3′，标记BNL3452的上游引物为5′-TGTAACTGAGCAGCCGTACG-3′和下游引物为5′-GCCAAAGCAGAGTGAGATCC-3′。

2.根据权利要求1所述的用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，其特征在于，所述的对抗黄萎病性状进行分子标记定位，是用SSR、RAPD和SRAP三种标记构建遗传连锁图，再用F2：3家系对抗黄萎病性状进行标记定位。

3.根据权利要求1所述的用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，其特征在于，依据SSR标记对田间育种群体进行分组，依据表现显著性的SSR标记和复合区间作图中与抗性QTL紧密连锁的SSR标记的基因型，对群体进行+-标记记录分组。

4.根据权利要求1所述的用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，其特征在于，分析每组的相对病指与标记基因型的有效性符合情况，计算每组的平均相对病指，每组的相对病指数值大小按无标记纯合基因型--、杂合基因型+-、有标记纯合基因型++的排列顺序依次递减，则确定该标记在辅助选择上具有有效性。

5.根据权利要求1所述的用于陆地棉抗黄萎病性状辅助选择育种的分子标记，其特征在于，标记基因型组间的相对病指差异显著或极显著的标记，对初步确定的有效性标记，对其每组的平均相对病指数值进行差异显著性分析，达到显著或极显著水平差异的标记。

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