CN110643728A - 一种提高白杨杂交育种效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高白杨杂交育种效率的方法。本发明从366对SSR引物中筛选出扩增条带稳定、多态性好的能够用于混合白杨授粉子代群体的父本鉴定的15对SSR引物，其核苷酸序列为SEQ ID No.1‑SEQ ID No.30所示。本发明还提供了一种提高白杨杂交育种效率的方法，包括：(1)收集多个育性相似白杨雄株无性系的花粉；(2)将花粉等质量均匀混合；(3)混合花粉与育性良好的杨树雌株杂交得到杂交子代群体；(4)利用所述SSR引物鉴别出目标性状子代的父本。本发明以混合花粉进行杂交授粉，建立杂交子代群体，再利用分子标记技术，鉴别出具有目标性状的子代父本，从而有效的提高杂交育种效率，减少工作量。
Description
技术领域
本发明涉及一种杨树育种的方法，尤其涉及一种提高白杨杂交育种效率的方法，属于白杨杂交育种领域。
背景技术
杂交是创造变异和培育林木新品种的重要手段和方法之一。随着生物技术的蓬勃发展，新的育种技术和方法不断涌现，如SNP分子标记辅助育种技术、基因组选择育种技术、基因编辑技术等。由于林木育种具有周期长，这些新技术还未能在林木育种中发挥重要作用，至今还未见相关新品种成功培育的报道。杂交仍是林木遗传改良行之有效的方法。
杨树是杨柳科杨属树种的统称，具有生长速度快、抗逆性强、适应范围广等特点，是中国北方五大造林树种之一。目前，中国林业生产中推广应用的主要杨树品种，如北林系列、南林系列以及速生杨系列等均系通过父母本两两杂交，并经过多年的田间遗传测定所选育(苏晓华,丁昌俊,马常耕.我国杨树育种的研究进展及对策.林业科学研究,2010,23(01):31-37；王瑞文,郭赟,周忠诚.杨树育种研究进展.湖北林业科技,2016,(06):33-35+80)。当亲本数量较多时，传统的父母本两两杂交存在工作量大，选择效率低等问题，亟待提供一种能够有效提高白杨杂交育种效率的方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种能够准确鉴别白杨雄株无性系混合授粉杂交子代的父本的SSR分子标记；
本发明的目的之二是应用所筛选出的SSR分子标记建立一种提高白杨杂交育种效率的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
根据已知的白杨SSR引物序列，通过数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)查找出366对引物，进行引物的筛选。在筛选过程中，利用父母亲本DNA样本，采用TP-M13-SSR PCR技术进行PCR反应扩增，根据Schuelke(Schuelke M.An economicmethod for the fluorescent labeling of PCR fragments.Nature biotechnology,2000,18(2):233-234.)的方法，SSR共需要三种引物，包括上游引物，下游引物以及标有荧光(ROX，FAM，TAMRA，HEX等)的荧光引物。利用父母本的基因组DNA，对366对多态性好的SSR引物进行扩增，数据结果经GeneMarker V2.2.0软件进行分析，利用CERVUS 3.0软件，筛选可用于子代个体父本鉴定的SSR引物对，最终筛选出15对扩增条带稳定、多态性好的SSR引物对，其核苷酸序列分别为SEQ ID No.1-SEQ ID No.30所示。
在所筛选出的15对有效SSR引物中，除了引物SSR14不能确定其所在染色体的位置之外，其余14对SSR引物分布于9条染色上。这15对SSR引物中共检测出91个等位位点，每对引物产生的等位基因位点不等，介于3-11之间变化，平均约为6.07个等位位点。其中，引物SSR01扩增出的等位基因位点数最多，为11个；SSR03扩增出的等位基因位点数最少，仅3个。
多态性信息含量(PIC)是某个基因位点变异程度高低的指标之一，且PIC值大于0.5的属于高度多态性位点，介于0.25-0.5的属于中度多态性位点，而小于0.25的属于低度多态性位点(白凤莹,曾青青,康宁,等.毛白杨基因库优树倍性检测及性状对比分析.北京林业大学学报,2015,37(04):113-119)。本试验中，PIC值介于0.459-0.836之间变动，平均多态性性信息含量为0.655。只有引物SSR02和SSR03的PIC值小于0.5，分别为0.459和0.484，属于中度多态性位点。其他13对引物的PIC值均大于0.5，均属于高度多态性位点。说明这套引物具有较好的鉴别能力。所筛选得到的这15对多态性引物中，有3对引物的母本位点缺失，由于子代群体的母本相同，所以不影响鉴别结果。利用CERVUS 3.0软件进行子代个体鉴定，确认每一父本的基因型在多父本亲本中是唯一的，因此，能够将筛选出的这15对SSR引物用于混合授粉子代群体的父本鉴定。
在此基础上，本发明提供了一种提高白杨杂交育种效率的方法，包括以下步骤：
(1)收集2种以上的育性相似白杨雄株无性系的新鲜花粉；
(2)称取相同质量的花粉，均匀混合得到混合花粉；
(3)将混合花粉与育性良好的杨树雌株杂交，获得杂交子代群体；
(4)利用所筛选得到的15对SSR引物从杂交子代群体中鉴别出具有目标性状子代的父本。
所述的白杨树种是毛白杨(Populus tomentosa)、响叶杨(P.adenlpodn)、毛新杨(P.tomentosa×P.balleana)、银腺杨(P.alba×P.glandulosa)、银腺杨×毛白杨杂种等。
所述的杨雄株无性系包括：1340、4123、4201、4421、5016、5017、5025、5042、6305或‘鲁毛50’。
所述的杨树雌株是银腺杨。
其中，在步骤(4)中利用筛选出的SSR多态性引物进行扩增反应，利用CERVUS 3.0软件进行分析，通过似然比(LOD)值筛选父本。
本发明以等质量方式混合10种毛白杨雄株无性系花粉与银腺杨雌株进行授粉杂交，获得混合授粉杂交子代。利用SSR引物对混合授粉子代进行父本鉴定，根据鉴定结果可见，利用15对SSR引物，可鉴定10个毛白杨雄株无性系混合授粉杂交子代的父本。而在育种实践中，仅仅需要鉴定具有改良目标性状的子代即可。这说明通过以混合花粉进行杂交授粉，建立杂交子代群体，再利用分子标记技术，鉴别出具有目标性状的子代父本，从而有效的提高杂交育种效率，减少工作量。
附图说明
图1引物SSR16、SSR01、SSR12和SSR15在第一组父本中的扩增效果。
图2引物SSR16、SSR03、SSR08和SSR11在第二组父本中的扩增效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1鉴别毛白杨雄株无性系混合授粉杂交子代的父本的SSR分子标记的筛选及在提高白杨杂交育种效率中的应用
1.材料与方法
1.1材料
冬季落叶后，从山东冠县毛白杨基因库中采集1340、4123、4201、4421、5016、5017、5025、5042、6305、‘鲁毛50’等10个无病虫害、花芽饱满的毛白杨雄株和银腺杨雌株花枝，塑料布包裹后运输至温室待用。
1.2花粉收集
将毛白杨雄花枝水培于10-20℃的温室，3-5d换一次水。待花药成熟开裂后，分别收集各无性系花粉，储存于10mL的离心管内，放入适量硅胶，并做好标记，用保鲜膜密封，置于-20℃冰箱内保存待用。
1.3花粉混合与杂交
称取相同质量的毛白杨花粉，均匀混合后，置于-20℃冰箱内保存待用。当银腺杨雌蕊柱头发育至最佳授粉时期，即授以等质量混合的花粉于柱头。授粉后，银腺杨雌花枝继续水培于温室。
1.4种子收集与播种
待银腺杨蒴果成熟开裂时，及时套袋，收集种子，置于含有适量硅胶的10mL离心管内保存。
将草炭土、珍珠岩和蛭石按5:2:1的比例均匀混合，装入穴盘压实，并用自来水浇透。将种子点播于穴盘，用插签作好标记。播种3-5d后，种子开始发芽。在幼苗生长过程中，注意防止水分亏缺，及时清理杂草。
1.5基因组DNA提取
待小苗长至5-10cm，摘取新鲜叶片，采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒，提取银腺杨母本、10个毛白杨父本以及杂交子代群体植株的基因组DNA。
1.6多态性引物筛选及父本鉴定
根据已知的白杨SSR引物序列，通过数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)查找出366对引物(表3和表4所示的引物)进行引物的筛选。在筛选过程中，利用父母亲本DNA样本，采用TP-M13-SSR PCR技术进行PCR反应扩增，根据Schuelke(SchuelkeM.An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments.Naturebiotechnology,2000,18(2):233-234.)的方法SSR共需要三种引物，包括上游引物，下游引物以及标有荧光(ROX，FAM，TAMRA，HEX等)的荧光引物。PCR反应体系见表1。
表1 PCR扩增反应体系
具体程序如下：94℃ 5min；94 ℃30sec，待测引物的最适退火温度30sec，72℃30sec共25个循环；94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 30sec共8个循环；72℃ 8min，4℃保存。得到的PCR扩增产物在ABI-3730 xl基因分析仪上进行毛细管电泳检测；数据结果经GeneMarker V2.2.0软件进行分析，利用CERVUS 3.0软件，筛选可用于子代个体父本鉴定的SSR引物对。
以子代群体基因组DNA为模板，利用筛选出的SSR多态性引物进行扩增反应，利用CERVUS 3.0软件进行分析，通过似然比(LOD)值筛选父本。LOD值表示相比于随机候选父本，疑似父本传递给子代基因的可能性，且LOD值越大，鉴定结果越准确(Marshall T C,SlateJ,Kruuk L E B,et al.Statistical confidence for likelihood-based paternityinference in natural populations.Molecular Ecology,1998,7(5):639-655；Jones AG,Small C M,Paczolt K A,et al.A practical guide to methods of parentageanalysis.Molecular Ecology Resources,2010,10(1):6-30；韩志强.基于SSR分子标记分析的毛白杨育种亲本选配策略研究.北京林业大学,2018)。
2.实验结果
2.1引物的筛选
利用父母本的基因组DNA，对366对多态性好的SSR引物(表2和表3)进行扩增，最终筛选出15对扩增条带稳定、多态性好的SSR引物，这15对有效引物的详细信息见表3，在父母本中的位点信息见表4。
表2 SSR16-SSR366引物序列
从366对引物(表2中的SSR16-SSR366引物和表3中的SSR01-SSR15引物)中进行筛选；最终，入选的有效引物15对(表3中的SSR01-SSR15)，未入选的351引物(表2中的SSR16-SSR366)未能区分两组父本，第一组是1340、4123、4201、4421和6305；第二组是5016、5025、5042。
从图1可以看出，第一组父本中的每一父本在引物SSR16中均扩增出一个等位位点，且位点均为107，即不能区分第一组的父本。而有效引物SSR01在第一组父本中均扩增出两个等位位点，仅有4123和4421的扩增位点一致，均为308/344，说明SSR01可以区分1340、4201和6305；有效引物SSR12在这五个父本中均扩增出两个等位位点且4201的扩增位点不同于其他父本，因此可用来区分4201与其他父本；在有效引物SSR15中，每一父本均扩增出一个等位位点，1340的位点为298，4123和4201的位点均为294，而4421和6305的位点均为296，综上，即可区分父本1340、4123、4201、4421和6305。
从图2可以看出，引物SSR16在第二组父本中均扩增出一个等位位点，且位点均为107，即不能区分第二组的父本，而在有效引物SSR03中，父本5025的扩增位点为364，不同于父本5016和5042；有效引物SSR08中，父本5042的扩增位点为158/170，不同于父本5016和5025；有效引物SSR11中，父本5016的扩增位点为167/189，不同于父本5025和5042，综上，即可区分父本5016、5025和5042。
BLAST比对结果表明(表3)，在15对有效SSR引物中，除了引物SSR14不能确定其所在染色体的位置之外，其余14对SSR引物分布于9条染色上。这15对SSR引物中共检测出91个等位位点，每对引物产生的等位基因位点不等，介于3-11之间变化，平均约为6.07个等位位点。其中，引物SSR01扩增出的等位基因位点数最多，为11个；SSR03扩增出的等位基因位点数最少，仅3个。
多态性信息含量(PIC)是某个基因位点变异程度高低的指标之一，且PIC值大于0.5的属于高度多态性位点，介于0.25-0.5的属于中度多态性位点，而小于0.25的属于低度多态性位点(白凤莹,曾青青,康宁等.毛白杨基因库优树倍性检测及性状对比分析.北京林业大学学报,2015,37(04):113-119)。本试验中PIC值介于0.459-0.836之间变动，平均多态性性信息含量为0.655。只有引物SSR02和SSR03的PIC值小于0.5，分别为0.459和0.484，属于中度多态性位点。其它13对引物的PIC值均大于0.5，均属于高度多态性位点。说明这套引物具有较好的鉴别能力。
15对多态性引物(SSR01-SSR15引物)中有3对引物的母本位点缺失，由于子代群体的母本相同，所以不影响鉴别结果。利用CERVUS 3.0软件进行子代个体鉴定，确认每一父本的基因型在多父本亲本中是唯一的，符合下一步试验要求，可用于混合授粉子代群体的父本鉴定。
2.2子代群体的父本鉴定
以等质量方式混合10种毛白杨雄株无性系花粉与银腺杨雌株进行授粉杂交，获得混合授粉杂交子代。利用所筛选的15对SSR引物(SSR 01-SSR 15)对混合授粉子代进行父本鉴定，鉴定结果如表5所示。
从表5可以看出，利用所筛选出的这15对特异性SSR引物可鉴定10个毛白杨雄株无性系混合授粉杂交子代的父本。而在育种实践中，仅仅需要鉴定具有改良目标性状的子代即可。这说明以混合花粉授粉杂交能够有效的减少杂交工作量，提高杂交选种效率。
表5等质量混合授粉子代的父本鉴定结果
序列表
<110> 北京林业大学
<120> 一种提高白杨杂交育种效率的方法
<130> BJ-1006-190604A
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
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<400> 30
acgcaagacc agctaggaaa 20
Claims (10)
1.用于白杨混合授粉子代群体的父本鉴定的15对SSR引物，其特征在于，第1对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；第2对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；第3对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；第4对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；第5对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；第6对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；第7对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示；第8对引物的核苷酸序列为SEQID No.15和SEQ ID No.16所示；第9对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示；第10对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示；第11对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示；第12对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示；第13对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示；第14对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示；第15对引物的核苷酸序列为SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示。
2.权利要求1所述的15对SSR引物在鉴别白杨雄株无性系混合授粉杂交子代的父本中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的白杨树种是毛白杨(Populustomentosa)、响叶杨(P.adenlpodn)、毛新杨(P.tomentosa×P.balleana)、银腺杨(P.alba×P.glandulosa)或银腺杨×毛白杨杂种。
4.一种提高白杨杂交育种效率的方法，包括以下步骤：
(1)收集2种以上的育性相似白杨雄株无性系的新鲜花粉；
(2)称取相同质量的花粉，均匀混合得到混合花粉；
(3)将混合花粉与育性良好的杨树雌株杂交，获得杂交子代群体；
(4)利用所筛选得到的15对SSR引物从杂交子代群体中鉴别出具有目标性状子代的父本。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的白杨树种是毛白杨(Populustomentosa)、响叶杨(P.adenlpodn)、毛新杨(P.tomentosa×P.balleana)、银腺杨(P.alba×P.glandulosa)或银腺杨×毛白杨杂种。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的杨雄株无性系包括：1340、4123、4201、4421、5016、5017、5025、5042、6305或‘鲁毛50’。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的杨树雌株是银腺杨。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，收集10种育性相似白杨雄株无性系的新鲜花粉。
9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)利用所筛选得到的15对SSR引物将杂交子代群体的样品进行扩增反应，利用CERVUS3.0软件进行分析，通过LOD值筛选父本。
10.一种鉴定白杨混合授粉子代群体的父本的PCR试剂盒，包括：SSR引物，PCR扩增试剂；其特征在于，所述的SSR引物是权利要求1所述的15对SSR引物。
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