CN104293888A - 筛选杨树生长和木材品质性状的snp位点、筛选方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选杨树生长和木材品质性状的SNP位点、筛选方法、试剂盒及应用。其中，该SNP位点为毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基。应用本发明的毛白杨GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生长和木材品质性状关联的7个功能SNP标记，可以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种筛选杨树生长和木材品质性状的SNP位点、筛选方法、试剂盒及应用。
背景技术
杨树是北半球地区广泛栽培的重要用材树种，具有广泛的工业用途，是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要原料，有重要的经济价值。随着杨树工业用材林定向培育的发展，对杨树新品种也提出了相应的要求，不仅要求其速生，而且需具备优良的木材品质。在杨树优良品种的定向培育中，与造纸有关的材性性状，如木材密度、纤维长度和宽度、微纤丝角，以及纤维素、木质素含量等，是仅次于生长指标的主要考虑因素。
分子标记辅助选择育种，是指利用分子标记对育种材料进行选择，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法，可以很好的提高育种效率。在分子育种应用之前，需要鉴定与目标性状关联的分子标记。单核苷酸多态性（SNP）是继限制性片段长度多态性（RFLP）和微卫星多态性（SSR）之后发展起来的第3代分子标记，它具有数量多、分布广泛、遗传稳定性高、共显性等特点，是目前分子遗传学研究中重要技术手段。目前，通过对表型和基因型进行联合遗传学的研究，从而利用这些功能位点进行优良种质资源的选择育种，已经成为人工林新品种选育的重要途径。
基于SNP的关联作图为分子标记辅助选择育种提供了一种新的策略，但是选择有效的分子标记是本领域技术人员一直努力的方向。
发明内容
本发明旨在提供一种筛选杨树生长和木材品质性状的SNP位点、筛选方法、试剂盒及应用，以提供一种快速、准确筛选杨树生长和木材品质性状的方法和试剂盒。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种筛选杨树生长和木材品质性状的SNP位点。该SNP位点为毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基。
进一步地，毛白杨GA20氧化酶基因第617位为A/G、第888位为C/T、第1138位为A/T和第1607位为C/T以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位为C/T、第92位为C/T和第229位为A/C。
根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选杨树生长和木材品质性状的方法。该方法包括以下步骤：S1，提取毛白杨的基因组DNA；S2，测定毛白杨GA20氧化酶基因第617位、 第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基的多态性；S3，根据步骤S2的测定结果进行筛选。
进一步地，毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AA、第888位基因型为TT、第1138位基因型为AA和第1607位基因型为CC以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为CC、第92位基因型为TT和第229位基因型为AC时，毛白杨生长和木材品质最好。
进一步地，毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AG或GG、第888位基因型为CC、第1138位基因型为AT和第1607位基因型为TT以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为TT、第92位基因型为CC和第229位基因型为CC时，毛白杨生长和木材品质最差。
进一步地，步骤S2中在测定毛白杨GA20氧化酶基因第617位碱基用的引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，测定第888位碱基用的引物为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，测定第1138位碱基用的引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9，测定第1607位碱基用的引物为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12碱基以及测定毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位碱基用的引物为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、测定第92位碱基用的引物为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和测定第229位碱基用的引物为SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21。
根据本发明的再一个方面，提供了一种筛选杨树生长和木材品质性状的试剂盒。该试剂盒包括碱基序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21的引物。
进一步地，该试剂盒还包括PCR扩增试剂，扩增试剂包括PCR扩增缓冲液，25mmolL-1MgCl2，10mmolL-1dNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水。
根据本发明的再一个方面，提供了一种毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位SNP位点在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
应用本发明的毛白杨GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生长和木材品质性状关联的7个功能SNP标记，可以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。同时，也为研究GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因的功能机制和这两个基因在林木育种中的应用提供了重要的理论研究基础。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了毛白杨GA20氧化酶基因与杨树生长和木材品质性状显著关联的功能SNP标记在基因中的位置；以及
图2示出了毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基与杨树生长和木材品质性状显著关联的功能SNP标记在基因中的位置。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
利用传统育种选择生长快和木材品质好的树木费时而且难度大、成本高，稳定性差，为了解决这一技术问题，本发明开发出与杨树生长和木材品质性状关联的功能SNP标记，可以在早期就鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程。
本发明采用基于候选基因的连锁不平衡作图的方法，选取随机分布于毛白杨天然分布区的毛白杨基因型个体作为关联群体，筛选到与木材品质性状（综纤维素含量、纤维长、纤维宽和微纤丝角）和生长性状（树高）显著相关的7个SNP标记。本发明的与杨树生长和木材品质性状关联的功能SNP标记具体是通过如下步骤而获得的：
（1）选取毛白杨个体组成的自然群体作为关联群体并提取每株个体的基因组DNA；
（2）对关联群体的每株个体进行表型测定，包括：木质素含量，综纤维素含量，α-纤维素含量，纤维长，纤维宽，微纤丝角，树高，胸径，材积和树高比胸径；
（3）利用关联群体里的部分个体，获取每株个体的毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因序列，比较序列发现基因内出现频率>10%的SNP位点，并在关联群体中进行基因型分型；
（4）利用TASSEL软件进行关联分析，并对结果进行了FDR多重检测，最终获得毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生长和木材品质性状显著关联的SNP分子标记。
赤霉素（GAs）是一类重要植物生长调节激素，参与控制植物多种发育和生理过程，包括种子萌发、茎的伸长、叶片伸展、表皮毛发育、根的生长，以及花和果实的发育等。据报道，GA20氧化酶是GA生物合成过程中的关键酶，改变植物体内GA20的水平，不仅可严重影响植株表型生长，还影响了木质部纤维细胞的数量和木质纤维细胞的长度。而UDP-葡萄糖脱氢酶催化氧化UDP-葡萄糖成UDP-葡萄糖醛酸，后者随后转化成半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖等UDP-葡萄糖衍生物。这些都是植物细胞壁中半纤维素和果胶物质合成的前体。因此UDP-葡萄糖脱氢酶基因在高等植物的细胞壁形成中具有重要作用。本发明选取毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因进行研究从而寻找与生长和木材品质性状显著关联的功能位点。毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因的基因序列均已为本领域技术人员所知，毛白杨GA20氧化酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.22，毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基 因的核苷酸序列为SEQ ID NO.23。
SEQ ID NO.22:
1 gtaccaactc tccctccctg cttctcaaac ctcacacaat cacatacata catacatata
61 tatacacaca cccacacgca gaccgtgccc tgccacaaaa tttgtaatgc aatggcaata
121 gattgcatca aaaccatgcc atccataacc acccctcaac accacccaaa agatcaggat
181 caatgcaaag atgatggcaa gtcttttgtt tttgatgcac aagttcttcg acaccagaca
241 aacatacccc agcagttcgt ttggcctgac catgaaaagc ctaatattaa tgcacctgaa
301 ctccaagtcc cgcttgtaga cttgggtgat ttcctctctg gcaaccctgt tgctgcagtg
361 gaagcttcaa gacttgttgg tgaagcatgt aaaaaacatg gtttctttct agttgttaat
421 catggagttg ataaaacact cattgcccat gctcataatt acgttgacac cttcttcaaa
481 ttgccacttt ctgagaaaca aaaggcccag agaaagattg gcgagtcctg tggatatgct
541 agcagcttta ctggcaggtt ttcctctaaa cttccatgga aagaaacgct ttcttttcgc
601 tacacagctg aggagaattc atcaaaacac atcgaggaat actttcataa cagaatgggg
661 gaagatttcg ctgaattcgg gtatgttaca gttttttttc ccaattcaat ttggttttgt
721 tcaatgttgt ctattgagat tggttaatgt tctcttcgac actaagactt ctcgtcttct
781 gttttcacca ggacggtgta tcaggactac tgtgaggcca tgagcacttt gtcactaggg
841 atcatggagc tattaggaat gagcctcggt gtgagcagag aacattttag ggaattcttt
901 aacgagaatg attcaataat gaggctcaac tactaccctc catgccaaaa acctgacctt
961 actttaggca ccggtcctca ttgtgatcca acttccttaa ccatcctcca tcaagaccaa
1021 gtgggtggtc ttcaagtgtt tgtggacaac gaatggcgtt cgattaaccc caattttgac
1081 gcttttgttg ttaacattgg tgacaccttc atggtaagat attaacttta ttcgcgctag
1141 tgaaggcggt tctgtccttt tcattaagat aaataaatag aattgcccta cacgtacgcg
1201 gatgataatt gacaattcct ttaaattatc accgaatttg cattaatgat tacaaaaggt
1261 acagatattt agtgggtttt tgttgttttg caggctctat cgaatggtat atacaagagc
1321 tgtttgcacc gagcagtggt gaacagccaa acaccaagaa aatctctcgc tttctttctg
1381 tgtccaaaga atgacaagat ggtaactcca ccacatgaat tagtggacac atgcaatccg
1441 agaatatatc cagatttcac atggcctatg ttgctcgaat tcacacaaaa gcattaccga
1501 gctgacatga agacacttga ggtgttcaca aactggcttc atcaacgaag ttttacctga
1561 acaagtgggt caggtgatgt atcccacaaa tgcacttggg ggcatgttat tggtcttttt
1621 cttggaaaaa aaataatgaa agcgatgttg atgggagagg agaggagacg aaaggga
SEQ ID NO.23:
1 ggaggaatgg cggtgtgtat ttaaacacaa ccccgccctc ttcgctctca ttccattcag
61 ttaaacttca gacagccaca gataaaactg gcctgtctct ctactttcct ccaccgaggt
121 accctctctc tctctctctc tctcacacac acacacacat taatttctct ttgtagtcaa
181 attcttttag atctaatgat gtttttttcg ctcattttaa cccttgatac gtgatttcaa
241 aatcaagctc aatgctccga atcttctttc aagtctttct agctttgaat tacatgcggt
301 agatctgcta gtattctgtt tggatcttag tattctcagc tgtggtactt catccaaagt
361 ctagatctag tcaaatatat ttgcgtttgg agaattggta tggaatcgag ggtgggtttt
421 atgagctttt gttagttatc tacttgcata tgaatgaatt aagagatatg aatatgttgt
481 ttggctttgg ctttgattct tcattgtgtg tggatgtggt ttgcacatgc tttatttgtt
541 tcatctgcaa cggcaggtta gcttgcatgg aagatctgaa agtgaacggt tttgatttgt
601 ttcttttccc ttcatatatg tgttgaattt cccttctttc aggttgtgaa cgtagacaag
661 gaaaatggtg aagatctgtt gcattggagc agggtatgtc ggcgggccta caatggctgt
721 catcgcactc aagtgcccgt caattgaagt ggtggttgtt gacatctggg aacctaggat
781 tgcagcctgg aacagtgacc agctccccat ctatgagcca ggcctgtatg atgtggtgaa
841 ggagtgccga ggcaggaatc tcttcttcag caaagacgtg gagaagcatg tcgctgaggc
901 tgatatagtt tttgtttcgg tcaacacccc taccaaaact caaggtcttg gagctggcaa
961 agctgcagat ctgacgtact gggagagcgc agcacgcaca attgctgatg tgtccaaatc
1021 tgacaaaatc gttgttgaga aatcaacagt cccagttaaa actgccgagg caattgaaaa
1081 gatcttgacc cacaacagta aggggatcaa attccagatc ctctcaaacc ctgagttcct
1141 tgcagaagga actgcaatcg gtgatctgtt tcaacctgat cgtgtcctca ttggagggag
1201 ggaaacccca gaaggccaga aggcaatcca agcattgaag gatgtctatg ctcattgggt
1261 tcctgaagac cgcatcctaa ccaccaacct ttggtctgca gagctgtcca agcttgctgc
1321 caatgccttt ttggcccaaa ggatttcctc cgttaatgcc atgtcagcac tctgtgaggc
1381 aactggggct gatgttgccg aggtgtccta tgctgttgga aaggattcaa ggattggtcc
1441 caagttcttg aatgctagtg ttggttttgg tggatcctgc ttccagaagg atattctgaa
1501 tcttgtttac atctgcgagt gcaatggcct tccagaggtg gcagagtact ggaaacaagt
1561 catcaagatc aatgattacc agaagagccg atttgtgaac cgtgttgttt catccatgtt
1621 taacacagtc tctcaaaaga agattgccat tttagggttc gctttcaaga aggacactgg
1681 cgacactagg gagacccctg ccattgatgt gtgccaggga ctgttgggag acaaggctct
1741 cttgagcata tatgatccac aggtccagaa agaacatatt cagagggatc ttatcatgaa
1801 aaagtttgat tgggatcatc ctctccatct ccagccgaag agttccagct ctgttgttga
1861 gcaagtgact gttacttctg atgcctatga ggcaacaaag gaagcccatg gtgtttgcat
1921 cttgacagag tgggatgaat tcaagactct tgattacaag aagatatatg acaacatgca
1981 gaaaccagct tttgtgtttg atggaaggaa tgttgtgaat gcagataagc tgagggagat
2041 tggtttcatt gtgtactcca ttggtaagcc actggatgca tggctcaagg acatgcctgc
2101 catcgcataa agggagatgc tgatgggtgg ttagctcatg ctatgggcca accaaatata
2161 gttcgaggca gtgaatctga ttctttacgg gggttttttt tttattttat tttattatta
2221 ttattcttgt cattgtttct tgctttcatc tagttctggg acagtttgcc atggtgaaag
2281 taagaggctt tacattttgc cttacattgc gtttccccac atcactgtca tgtggcactc
2341 g
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选杨树生长和木材品质性状的SNP位点，该SNP位点为毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基。
应用上述的毛白杨GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生长和木材品质性状关联的7个功能SNP标记，可以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。同时，也为研究GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因的功能机制和这两个基因在林木育种中的应用提供了重要的理论研究基础。
其中，毛白杨GA20氧化酶基因第617位为A/G、第888位为C/T、第1138位为A/T和第1607位为C/T以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位为C/T、第92位为C/T和第229位为A/C。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选杨树生长和木材品质性状的方法，该方法包括以下步骤：S1，提取毛白杨的基因组DNA；S2，测定毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基；S3，根据步骤S2的测定结果进行筛选。采用该方法筛选杨树生长和木材品质性状，可以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。
本发明的发明人发现，当毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AA、第888位基因型为TT、第1138位基因型为AA和第1607位基因型为CC以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基 因第69位基因型为CC、第92位基因型为TT和第229位基因型为AC时，毛白杨生长和木材品质最好。毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AA时，纤维长、纤维宽、综纤维素和树高表型值最高；毛白杨GA20氧化酶基因第888位基因型为TT时，纤维长最长；毛白杨GA20氧化酶基因第1138位基因型为AA时，纤维宽最宽；毛白杨GA20氧化酶基因第1607位基因型为CC时，纤维宽最宽；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为CC时，纤维长最长；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第92位基因型为TT时，纤维长最长；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第229位基因型为AC时，纤维长最长且综纤维素含量最高。
毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AG或GG、第888位基因型为CC、第1138位基因型为AT和第1607位基因型为TT以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为TT、第92位基因型为CC和第229位基因型为CC时，毛白杨生长和木材品质最差。毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AG时，纤维长和树高表型值最低，基因型为GG时，纤维宽和综纤维素表型值最低；毛白杨GA20氧化酶基因第888位基因型为CC时，纤维长最短；毛白杨GA20氧化酶基因第1138位基因型为AT时，纤维宽表型值最低；毛白杨GA20氧化酶基因第1607位基因型为TT时，纤维宽表型值最低；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为TT时，纤维长最短；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第92位基因型为CC时，纤维长最长；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第229位基因型为CC时，纤维长最短且综纤维素含量最低。
也就是说，具有上述两种基因型的杨树，其品质属于两种较极端的情况，其他的SNP基因位点组合，杨树的品质处于这两种情况之间。因此，本领域技术人员可以根据这7个SNP位点的碱基预测毛白杨生长和木材品质性状。
优选地，步骤S2中在测定毛白杨GA20氧化酶基因第617位碱基用的引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，测定第888位碱基用的引物为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，测定第1138位碱基用的引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9，测定第1607位碱基用的引物为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12碱基以及测定毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位碱基用的引物为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、测定第92位碱基用的引物为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和测定第229位碱基用的引物为SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21。
表1
采用上述引物，能够高效、准确地鉴定出SNP位点的碱基。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选杨树生长和木材品质性状的试剂盒。该试剂盒包括碱基序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21的引物。采用上述引物，能够高效、准确地鉴定出毛白杨GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生长和木材品质性状关联的7个功能SNP标记，可以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。
优选地，该试剂盒进一步包括PCR扩增试剂，扩增试剂包括PCR扩增缓冲液，25mmolL-1MgCl2，10mmolL-1dNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水等。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基位点在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明中提及的分子生物学技术，本领域技术人员均可按照常规操作进行，以下对本发明优选的实验步骤做详细的描述：
（1）DNA提取
毛白杨总DNA提取按DNeasy Plant Mini Kits（Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA）描述的方法进行。
（2）扩增目的基因
应用25μL DNA聚合酶链反应（PCR）体系，以毛白杨成熟木质部cDNA为模板，加入2.5μL10×buffer，1.8μL25mmolL-1MgCl2，1μL10mmolL-1dNTP，Taq DNA聚合酶1.0U（以上试剂购自Promega公司），100nmolL-1引物各1μL（SEQ ID NO.24-29），加适量双蒸水至25μL。扩增引物如表2中所示。
PCR反应条件为：94℃预变性3分钟，93℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。最终扩增出长约1600bp和2300bp的cDNA片段。
表2
（3）PCR产物的克隆、测序
将PCR扩增得到的目的基因片段回收后连接于pGEM-T上。连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，送公司测序。
（4）SNP发现和基因型分型
以最大程度地反映毛白杨自然分布区域的40个基因型（取自全国毛白杨种质资源库）个体的总DNA为模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收、纯化目的片段后与PGEM-T载体连接，转化后挑取阳性单克隆进行序列测定，然后将每一基因片段的核苷酸序列拼接成完整的基因序列。组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对每一基因的40个序列进行分析，标出SNP位点。基因分型采用锁核酸（LNA）法(Koshkin等，Tetrahedron Lett.(1998)39,4381-4384）。
（5）表型的测定
利用近红外光谱测定仪测定每个基因型个体的木质素含量、纤维素含量、棕纤维素含量三个木材化学性状指标；利用X射线衍射仪测定微纤丝角，纤维长、纤维宽三个物理性状；利用生长性状测定工具测定其胸径、树高、材积等指标。
（6）标记性状关联分析
利用TASSEL软件中的混合线性模型进行基因型和表型的关联分析，首先选择P<0.05的关联位点，然后利用FDR假阳性多重检测，选择Q<0.05的与生长和木材品质性状显著关联的SNP功能位点。
利用关联作图的方法鉴定毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生 长和木材品质相关的功能SNP标记。
1、关联群体的选择：全国毛白杨基因库于1982年收集并保存，包括1047株基因型个体。对毛白杨主要分布区内气象条件进行调研，依据热、光和水等16个气象因子，最终将整个毛白杨分布区划分为南部气候区、东北部气候区和西北部气候区。所有材料在三个气候区覆盖的10省市（北京、河北、河南、山东、山西、陕西、甘肃、宁夏、安徽和江苏）的100个县收集，通过根繁方式统一种植在山东省冠县国营苗圃。本发明从全国毛白杨基因库中选取能够最大程度地反映毛白杨天然分布范围的426株个体作为关联群体。
2、表型的测定：共有10种表型用于关联分析，包括木质素含量、综纤维素含量、α-纤维素含量、纤维长、纤维宽、微纤丝角、树高、胸径、材积和树高与胸径之比。取样时通过取木钻从关联群体的426株个体的1.35m处取样，所取的木材样品材料包含树皮和髓。材料长15厘米直径为10毫米，采集于2010年。生长性状收集于2011年。利用近红外光谱测定仪测定每个基因型个体的木质素含量、纤维素含量、棕纤维素含量三个木材化学性状指标；利用X射线衍射仪测定微纤丝角，纤维长、纤维宽三个物理性状；利用生长性状测定工具测定其胸径、树高、材积等指标。
3、SNP发现：从全国毛白杨基因库中选出40株个体，它们能够最大程度地反映毛白杨天然分布范围。以这40株个体的总DNA为模板，对每株个体的GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因进行克隆测序。
3.1扩增目的基因
应用25μL DNA聚合酶链反应（PCR）体系,以毛白杨成熟木质部cDNA为模板,加入2.5μL10×buffer,1.8μL25mmolL-1MgCl2,1μL10mmolL-1dNTP，Taq DNA聚合酶1.0U（以上试剂购自Promega公司）,100nmolL-1引物各1μL（SEQ ID NO.24-29），加适量双蒸水至25μL。
PCR反应条件为：94℃预变性3分钟，93℃变性30秒，56℃退火30s，72℃延伸1分钟，共35个循环，72℃最后延伸5分钟。最终扩增出长约1600bp和2300bp的cDNA片段。
3.2PCR产物的克隆、测序
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，回收、纯化目的片段后连接于pGEM-T上。连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆进行序列测定。
结合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件分析毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因的40个序列，标出基因内的突变位点，计算SNP频率、SNP多样性指数和在基因不同区域的分布模式。结果见表3和表4，表3示出了毛白杨GA20Ox基因的核苷酸多态性，表4示出了毛白杨UGDH基因的核苷酸多态性。最终发现毛白杨GA20氧化酶基因内共55个SNP位点，其中29个为普通SNP（最小等位频率≥10%）；毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因内共59个SNP位点，其中22个为普通SNP（最小等位频率≥10%）。
表3
注：插入缺失的区域在计算时被排除
表4
注：插入缺失的区域在计算时被排除
（4）DNA提取和基因分型
从毛白杨个体的叶片中提取基因组DNA，毛白杨总DNA提取按DNeasy Plant Mini Kits（Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA）描述的方法进行。基因分型采用锁核酸（LNA）法(Koshkin等，Tetrahedron Lett.(1998)39,4381-4384），设计特定的引物对普通SNP在426株个体进行基因型分型，引物如表1中所示。
（5）关联分析：利用TASSEL2.1软件对基因分型结果与10个毛白杨生长和木材品质性状进行关联分析。运用混合线性模型（MLM）进行分析，最终获得与表型性状显著关联的功能SNP标记。在进行关联分析时，使用Q值和K值来减少假阳性关联，Q值用来估算群体结构，K值用来估算个体之间的亲缘关系。Q值和K值分别使用STRUCTURE VERISON2.3软件和SPAGeDi软件计算。最后使用Qvalue软件进行假阳性检验，选择Q<0.05的与生长和木 材品质性状显著关联的功能SNP标记。关联结果见表5，表5示出了毛白杨GA20氧化酶基因和UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与生长和木材品质显著关联的SNP分子标记。最终获得7个SNP标记与生长和木材品质性状显著关联，分别位于毛白杨GA20氧化酶基因的3’UTR、内含子和外显子以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因的5’UTR，解释表型变异率为3.44%到14.47%。获得的7个功能SNP标记不同基因型对应的表型平均值见表6。位于毛白杨GA20氧化酶基因617bp的SNP10与纤维长、纤维宽、综纤维素含量和树高显著关联，AA基因型对应的这四种表型均值均为三种基因型中最高；位于毛白杨GA20氧化酶基因888bp的SNP19与纤维长显著关联，TT基因型表型均值最高；位于毛白杨GA20氧化酶基因1138bp的SNP22与纤维宽显著关联，AA基因型表型均值最高；位于毛白杨GA20氧化酶基因1607bp的SNP29与纤维宽显著关联，CC基因型表型均值最高。位于毛白杨UGDH基因69bp的SNP1与纤维长显著关联，CC基因型表型均值最高；位于毛白杨UGDH基因92bp的SNP2与纤维长显著关联，TT基因型表型均值最高；位于毛白杨UGDH基因229bp的SNP7与纤维长和综纤维素含量显著关联，AC基因型对应的两种表型均值最高。因此我们可以根据实际需要来选择合适的功能SNP标记来筛选具有目的表型的个体。图1示出了毛白杨GA20氧化酶基因与杨树生长和木材品质性状显著关联的功能SNP标记在基因中的位置；图2示出了毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基与杨树生长和木材品质性状显著关联的功能SNP标记在基因中的位置。
表5
表6
本发明上述使用的试剂均可包含在筛选杨树生长和木材品质性状的试剂盒中。
从以上实验数据可以看出，本发明的毛白杨GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因内与杨树生长和木材品质性状关联的7个功能SNP标记，可以在杨树生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快和木材品质好的单株，从而大大加速育种进程，缩短选育周期。同时，也为研究GA20氧化酶基因和毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因的功能机制和这两个基因在林木育种中的应用提供了重要的理论研究基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
。
Claims (9)
1.一种筛选杨树生长和木材品质性状的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基。
2.根据权利要求1所述的SNP位点，其特征在于，所述毛白杨GA20氧化酶基因第617位为A/G、第888位为C/T、第1138位为A/T和第1607位为C/T以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位为C/T、第92位为C/T和第229位为A/C。
3.一种筛选杨树生长和木材品质性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取毛白杨的基因组DNA；
S2，测定毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位碱基；
S3，根据所述步骤S2的测定结果进行筛选。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AA、第888位基因型为TT、第1138位基因型为AA和第1607位基因型为CC以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为CC、第92位基因型为TT和第229位基因型为AC时，所述毛白杨的生长和木材品质好。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述毛白杨GA20氧化酶基因第617位基因型为AG或GG、第888位基因型为CC、第1138位基因型为AT和第1607位基因型为TT以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位基因型为TT、第92位基因型为CC和第229位基因型为CC时，所述毛白杨的生长和木材品质差。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中在测定毛白杨GA20氧化酶基因第617位碱基用的引物为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，测定第888位碱基用的引物为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，测定第1138位碱基用的引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9，测定第1607位碱基用的引物为SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12碱基以及测定毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位碱基用的引物为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、测定第92位碱基用的引物为SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18和测定第229位碱基用的引物为SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21。
7.一种筛选杨树生长和木材品质性状的试剂盒，其特征在于，包括碱基序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21的引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括PCR扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR扩增缓冲液，25mmolL-1MgCl2，10mmolL-1dNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水。
9.毛白杨GA20氧化酶基因第617位、第888位、第1138位和第1607位碱基以及毛白杨UDP-葡萄糖脱氢酶基因第69位、第92位和第229位SNP位点在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
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