CN110063253B - 一种选育高产文冠果品系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种选育高产文冠果品系的方法。该方法包括：收集高产文冠果开放授粉的种子，萌发出苗后，采用SSR分子标记鉴定父本，筛选自交亲和率在60％以上、胚珠可育率在90％以上、单株种子产量与相同条件下的对照树相比高出30％以上的母株；以文冠果容器树苗为砧木，嫁接所选单株接穗，对所结种子鉴定父本，证实为自交结实后，再进行第二代嫁接和父本鉴定。若再次证实为自交结实，则确定母株为决选单株；取其接穗，以3‑5年生文冠果实生苗为砧木，嫁接扩繁，获得自交可育高产文冠果品系。本发明采用SSR分子标记、容器育苗与嫁接等手段，开展文冠果自交可育高产良种培育，以解决文冠果高产良种的短缺问题。
Description
技术领域
本发明属于植物新品种培育领域，涉及一种选育高产文冠果品系的方法，特别涉及一种选育自交可育高产文冠果品系的方法。
背景技术
文冠果是我国北方特有的珍贵木本油料植物，其种子含油量很高，油的品质好，被国家粮食局列为健康食用油。然而文冠果坐果率很低，严重限制了它的开发利用。自20世纪50年代以来，我国一直十分重视文冠果高产良种选育，一些科研院所也做了大量工作，培育了一些地方良种。但这些良种在多年生产实践中并没有受到广泛认可和推广，因为没有表现稳定的高产性状。以前文冠果高产良种选育一般都是从优良单株选育开始，根据坐果多少的表型鉴定是否优良。如果确定为优良单株，则进行营养繁殖，最终培育为良种。这种选优方式存在不确定因素，所选单株可能并不真正优良，它们仅在具体传粉或特定气候及土壤微环境下表现优良高产，离开这个环境，性状可能完全不同。
绝大部分文冠果树表现自交败育现象，只有杂交传粉才能结实。杂交传粉植物在某一授粉环境下可能表现高产，但环境变化后，周围没有合适父本时，坐果将显著降低。过去由于缺乏研究，不了解文冠果自交与杂交传粉的亲和性特征，导致盲目选择。在这种情况下，有时即使筛选到自交结实高的个体，但后来没有相应的栽培管理手段而表现低产时，可能作为假优单株而被抛弃。
迄今为止，没有鉴定文冠果自交可育高产优株的方法及其新品种培育技术。
发明内容
发明人发现，在文冠果群体中确实存在极少数自交亲和与自交坐果率较高的个体。如果个体具有自交结实特征，将大大提高文冠果的坐果率，显著提高产量。基于此，本发明提供了一种选育自交可育高产文冠果品系的方法。
本发明所提供的选育自交可育高产文冠果品系的方法，可通过以下技术方案实现：利用多态性高和重复性好的SSR分子标记鉴定种子亲本，筛选自交结实高的丰产优良单株。采用容器育苗与嫁接手段，快速培育可移动与隔离的结实果树，结合SSR分子标记与人工授粉方法，最终确定具有自交可育高产性状的优株。通过建立接穗圃和嫁接等手段繁育良种。
具体而言，本发明所提供的选育自交可育高产文冠果品系的方法包括如下步骤：
(1)以若干具有高产表型的文冠果植株作为原始候选单株，自然开放传粉后，采集所述若干原始候选单株中每株所结的种子；
(2)将步骤(1)所得种子萌发出苗后，利用SSR分子标记鉴定父本，统计母株的自交亲和率、胚珠可育率以及种子产量，从中筛选出能够自交传粉，且自交亲和率达到60％以上、胚珠可育率达到90％以上、与相同条件下的对照树相比高出30％以上(如5年生单株种子产量达到1千克以上)的母株作为候选单株。
(3)以2-3年生的文冠果容器树苗作为砧木，嫁接所述候选单株的接穗，培育成结实果树；将所述结实果树移动到周围300m以上没有文冠果树的地方并结合人工套袋授粉，观察并统计所述结实果树的雌花坐果率和种子产量，从中筛选雌花坐果率达到30％以上，3年生树种子产量在0.2千克以上的植株，然后对所结种子利用SSR分子标记鉴定父本，验证是否为自交结实，筛选出自交结实植株。
(4)以2-3年生的文冠果容器树苗作为砧木，嫁接步骤(3)所选出植株的接穗，然后按照步骤(3)的方法重复操作，若再次证实为自交结实，则确定原母株为决选单株。
(5)利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，利用所述决选单株作为接穗进行嫁接与扩繁，从而获得自交可育高产文冠果品系。
步骤(1)中，所述自交亲和率和所述胚珠可育率的计算公式如下：
自交亲和率＝自交种子数/总种子数×100％；
胚珠可育率＝子房内种子数/总胚珠数×100％；
步骤(1)中，所述具有高产表型的文冠果植株可为单株种子产量与相同条件下的对照树相比高出30％以上的文冠果植株。具体如5年生树单株坐果量达到100个果实以上或种子产量在1千克以上的文冠果植株。
在所述方法中，所述对照树指的是半径在20米以内的相同条件下种植的同年生文冠果树。
步骤(2)和(3)中，所述SSR分子标记共19个，对应的19对检测引物如下：
由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对1；
由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；
由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3；
由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对4；。
由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA分子组成的引物对5；
由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA分子组成的引物对6；
由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA分子组成的引物对7；
由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA分子组成的引物对8；
由序列表中序列17和序列18所示的两条单链DNA分子组成的引物对9；
由序列表中序列19和序列20所示的两条单链DNA分子组成的引物对10；
由序列表中序列21和序列22所示的两条单链DNA分子组成的引物对11；
由序列表中序列23和序列24所示的两条单链DNA分子组成的引物对12；
由序列表中序列25和序列26所示的两条单链DNA分子组成的引物对13；
由序列表中序列27和序列28所示的两条单链DNA分子组成的引物对14；
由序列表中序列29和序列30所示的两条单链DNA分子组成的引物对15；
由序列表中序列31和序列32所示的两条单链DNA分子组成的引物对16；
由序列表中序列33和序列34所示的两条单链DNA分子组成的引物对17；
由序列表中序列35和序列36所示的两条单链DNA分子组成的引物对18；
由序列表中序列37和序列38所示的两条单链DNA分子组成的引物对19。
步骤(2)和(3)中，所述“利用SSR分子标记鉴定父本”的方法为共显性标记遗传规律分析法。
同位点共显性标记的5种遗传规律为：
AA×aa＝Aa
Aa×aa＝Aa+aa
Aa×Aa＝AA+Aa+aa
AA×AA＝AA
aa×aa＝aa
根据以上遗传规律推断亲本。
在所述方法中，步骤(5)具体为：利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，嫁接所述决选单株的接穗，从而建立自交可育高产文冠果的接穗圃。然后利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，通过嫁接所述接穗圃中的接穗进行扩繁，从而获得自交可育高产文冠果品系。
本发明还保护由前文所述19对检测引物中的全部或部分组成的引物对组。
所述引物对组在选育自交可育高产文冠果品系中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明根据发明人多年对文冠果生殖生物学研究，发现在文冠果群体中，确实存在极少数自交可育的高产单株。基于这个研究与发现，采用SSR分子标记、容器育苗及嫁接等手段，开展文冠果自交可育高产良种培育，高效快速解决文冠果高产良种的短缺问题，满足当前文冠果产业发展的迫切需要。
附图说明
图1为部分样本的DNA提取及检测结果。
图2为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)引物筛选的部分图。
图3为毛细管电泳检测的部分结果图。上图为A2样本的P1-21引物对检测结果；下图为A3样本的P1-21引物对检测结果。
图4为文冠果容器育苗。A为幼苗期；B为结果期。
图5为文冠果嫁接苗。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所提供的选育自交可育高产文冠果品系的方法，大致包括如下步骤：
(1)以若干具有高产表型的文冠果植株(5年生树单株坐果量达到100个果实以上或种子产量在1千克以上)作为原始候选单株，自然开放传粉后，采集所述若干原始候选单株中每株所结的种子。
(2)将步骤(1)所得种子萌发出苗后，利用SSR分子标记鉴定父本，统计母株的自交亲和率、胚珠可育率以及种子产量，从中筛选出能够自交传粉，且自交亲和率达到60％以上、胚珠可育率达到90％以上、5年生单株种子产量达到1千克以上(与相同条件下的对照树相比高出30％以上)的母株作为候选单株。
(3)以2-3年生的文冠果容器树苗作为砧木，嫁接所述候选单株的接穗，培育成结实果树；将所述结实果树移动到周围300m以上没有文冠果树的地方并结合人工套袋授粉，观察并统计所述结实果树的雌花坐果率和种子产量，从中筛选雌花坐果率达到30％以上，3年生树种子产量在0.2千克以上的植株，然后对所结种子利用SSR分子标记鉴定父本，验证是否为自交结实，选出经验证为自交结实的植株。
(4)以2-3年生的文冠果容器树苗作为砧木，嫁接步骤(3)选出植株的接穗，然后按照步骤(3)的方法重复操作，若再次证实为自交结实，则确定原母株为决选单株。
(5)利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，利用所述决选单株作为接穗进行嫁接与扩繁，从而获得自交可育高产文冠果品系。
实施例1、文冠果基因组DNA的获得
采用CTAB法提取样本的基因组DNA，具体操作如下：
1)在65℃水浴锅中预热CTAB提取液；
2)在液氮中迅速研磨样品，将粉末状材料转入2mL离心管中，加入预热的CTAB提取液(每克样品加入3～5ml的提取液)，65℃保温30～60min，每隔10min轻轻颠倒混匀；
3)11000rpm条件下离心5min，取上清转入新离心管；
4)加入等体积酚/氯仿(1∶1，体积比)，充分混匀，11000rpm离心10min，取上清转入新离心管；
5)加入等体积氯仿，充分混匀，11000rpm离心10min，取上清转入新离心管；
6)重复步骤4)和5)；
7)加入2/3体积的异丙醇混匀，室温放置，沉淀15min；
8)11000rpm条件下离心6min，弃上清；
9)将沉淀用70％的乙醇漂洗一次，室温条件下11000rpm离心2min，弃上清，重复洗一次；
10)提取产物取2-3μL用2％琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于-20℃保存备用。
部分样本的DNA提取及检测结果如图1所示。由图可见：提取到纯度较高，较完整的总DNA。
实施例2、SSR引物筛选
(1)PCR反应体系：
SSR(共20μL)：ddH2O 7.2μL，MIX 10μL，正向引物F 0.3μL，反应引物R 0.3μL，DNA模板(实施例1所得文冠果基因组DNA)2μL，Taq 0.2μL。
(2)PCR反应采用如下循环参数：
SSR PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃复性35s，72℃延伸40s，共35个循环；最终72℃延伸3min。
(3)引物信息：
表1筛选引物信息
(4)将PCR产物加上上样缓冲液，94℃变性10min后于6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)引物筛选的部分图如图2所示。根据电泳图谱，从200对SSR引物中筛选出19对条带清晰、多态性高和重复性好的SSR引物进行毛细管电泳检测。19对SSR引物见表1。
实施例3，毛细管电泳检测
利用以上实施例2筛选的条带清晰、多态性高和重复性好的19对SSR引物(表1)，合成荧光引物，通过毛细管电泳分析检测片段大小。
1、PCR扩增
(1)PCR反应体系：
SSR荧光引物体系(共20μL)：ddH2O 14.8μL，dNTP 0.4μL，Buffer 2μL，正向引物F0.3μL(20μM)，反向引物R 0.3μL(20μM)，DNA模板2μL，Taq 0.2μL。
(2)PCR反应采用如下循环参数：
SSR PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。
2、毛细管电泳分析
将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取9μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的PCR产物。然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，利用Genemarker中的Fragment(Plant)片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标的位置与各样品峰值的位置做比较分析，得到片段大小。
毛细管电泳检测所得片段大小的结果统计如表2所示的范例。毛细管电泳检测结果如图3所示的范例。
表2毛细管电泳检测所得片段大小的结果统计
注：表中的SSR引物编号与表1中相对应。表中的A、B、C、D和E分别代表相互间距在300m以上不同栽培地的文冠果，S代表这些植株的交配后代。
实施例4、种子亲本检测与自交可育高产植株的鉴定
以若干具有高产表型的文冠果优株(5年生单株坐果量达到1千克以上种子产量)作为原始候选单株，采集自然开放传粉种子。每种样品来自50个果实，每果实取3粒种子。种子萌发出苗后，利用实施例2筛选出的19对SSR引物分别鉴定父本，统计其母株的自交亲和率、胚珠可育率与种子产量。从中筛选能够自交传粉，且自交亲和率达到60％以上、胚珠可育率达到90％以上、单株种子产量达到1千克以上的母株入选下一环节。其中，自交亲和率＝自交种子数/总种子数×100％；胚珠可育率＝子房内种子数/总胚珠数×100％。
其中，亲本鉴定采用共显性标记遗传规律分析法，根据同位点共显性标记的5种遗传规律推断亲本。
AA×aa＝Aa
Aa×aa＝Aa+aa
Aa×Aa＝AA+Aa+aa
AA×AA＝AA
aa×aa＝aa
根据以上共显性标记遗传规律鉴定亲本。
高产表型优株种子的亲本鉴定结果如表3所示。
表3高产表型优株的自交/杂交传粉种子的亲本鉴定结果范例
注：表中的SSR引物编号与表1和表2中相对应，亲本及种子样品编号与表2中的植物样品编号相对应。
结果显示，S1和S2为C1的自交传粉后代。C1优株的自交亲和率为61％，胚珠可育率为93％，5年生单株种子产量为1.3千克。该单株初步判断为自交可育高产优良单株(候选单株)，进入下一环节。
然后利用已培育2-3年的文冠果容器树苗(图4为文冠果容器育苗。A为幼苗期；B为结果期)作为砧木，嫁接以上初步选择的自交可育丰产的优良单株(C1优株)接穗，通过合理栽培管理措施，快速培育结实果树。然后将以上每个容器树苗(即培育而成的结实果树)移动到周围300m没有文冠果树的地方，并对每株20个雌花进行人工自交授粉。通过合理水肥管理促使结果，观察并统计所述结实果树的雌花坐果率和种子产量，从中筛选雌花坐果率达到30％以上，3年生树种子产量在0.2千克以上的植株；然后对所结种子再进行SSR亲本鉴定(方法同上)，最终确定是否为自交结实和高产优株。经鉴定嫁接苗所结种子确实是自交结实，且单株雌花坐果率达到40％，3年生树种子产量达0.25千克。
进一步，再次以文冠果容器树苗(2-3年生)作为砧木，嫁接前文所得“经鉴定所结种子确实是自交结实，且单株雌花坐果率达到40％，3年生树种子产量达0.25千克的嫁接苗”的接穗，然后按照上述方法重复操作，结果再次证实了其自交和高产的性状。以该嫁接苗的母株(即C1优株)作为决选单株，进入下一环节。
实施例5、通过实生苗嫁接，扩繁自交可育高产优良单株
利用3-5年生健壮的文冠果种子实生苗作为砧木，嫁接实施例4所得的自交可育高产优良单株(决选单株)接穗，通过合理水肥管理，快速建立自交可育高产优良品系接穗圃。在此基础上，也利用3-5年生健壮的文冠果种子实生苗作为砧木，进行快速扩繁自交可育高产良种。图5为文冠果嫁接。
<110> 中国科学院植物研究所
<120> 一种选育高产文冠果品系的方法
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<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
acaaccaaaa cccagaagca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
ggctggctct acgtgtgtat 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
ccgatgggaa cgtgaacaga 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
tgcagaccat ttgctctgtt g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 29
accagtgttt ttgagcccca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
caggccttgc ttctgactca 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 31
ttgtttgcgt tgctggagtg 20
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
tccatggaaa aagaaaccca gt 22
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
tctcaaattt ccagttccat taaatca 27
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
gctggagaga cttggccaaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 35
ggctgcaccg tgacagataa 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 36
ttcaaccttg tggggctctc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 37
ggagagccat cgagaagacg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 38
ggcgcaccct gatttgtttt 20
Claims (8)
1.一种选育自交可育高产文冠果品系的方法，包括如下步骤：
（1）以若干具有高产表型的文冠果植株作为原始候选单株，自然开放传粉后，采集所述若干原始候选单株中每株所结的种子；
（2）将步骤（1）所得种子萌发出苗后，利用SSR分子标记鉴定父本，统计母株的自交亲和率、胚珠可育率以及种子产量，从中筛选出能够自交传粉，且自交亲和率达到60%以上、胚珠可育率达到90%以上、单株种子产量与相同条件下的对照树相比高出30%以上的母株作为候选单株；
（3）以2-3年生的文冠果容器树苗作为砧木，嫁接所述候选单株的接穗，培育成结实果树；将所述结实果树移动到周围300 m以上没有文冠果树的地方并结合人工套袋授粉，观察并统计所述结实果树的雌花坐果率和种子产量，从中筛选出雌花坐果率达到30%以上、3年生树种子产量在0.2千克以上的植株，然后对所结种子利用SSR分子标记鉴定父本，验证是否为自交结实，筛选自交结实植株；
（4）以2-3年生的文冠果容器树苗作为砧木，嫁接步骤（3）筛选植株的接穗，然后按照步骤（3）的方法重复操作，若再次证实为自交结实，则确定原母株为决选单株；
（5）利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，利用所述决选单株作为接穗进行嫁接与扩繁，从而获得自交可育高产文冠果品系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述具有高产性状的植株为单株种子产量与相同条件下的对照树相比高出30%以上的植株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2）和（3）中，所述SSR分子标记共5对，对应的5对检测引物如下：
由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对2；
由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对3；
由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对4；
由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA分子组成的引物对5；
由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA分子组成的引物对8。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2）和（3）中，所述“利用SSR分子标记鉴定父本”的方法为共显性标记遗传规律分析法。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）为：利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，嫁接所述决选单株的接穗，从而建立自交可育高产的文冠果接穗圃；然后利用3-5年生的文冠果实生苗作为砧木，通过嫁接所述接穗圃中的接穗进行扩繁，从而获得自交可育高产文冠果品系。
6.引物对组，为权利要求3中的所述5对检测引物。
7.权利要求6所述的引物对组在鉴定文冠果亲本中的应用。
8.权利要求7所述的引物对组在选育自交可育高产文冠果品系中的应用。
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