CN104293906B - 不结球白菜自交不亲和鉴定的ssr分子标记及其应用 - Google Patents

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CN104293906B CN201410182661.0A CN201410182661A CN104293906B CN 104293906 B CN104293906 B CN 104293906B CN 201410182661 A CN201410182661 A CN 201410182661A CN 104293906 B CN104293906 B CN 104293906B
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Abstract

本发明公开了一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用，其标记引物为Na12E02、KBRH138G23或BrSS15中的至少一种。本方法的SSR分子标记，可以应用于不结球白菜自交不亲和性的快速鉴定和检测，提高育种效率，加速育种进程。

Description

不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明属于作物遗传育种与生物技术领域，具体涉及不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记及用应用。
背景技术
不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)俗称青菜，小白菜，属于十字花科芸薹属芸薹种，是我国主要的叶菜类蔬菜。具有适应性强，生长期短、品质柔嫩、风味独特、营养丰富等特点，是我国南方人民终年喜食的大众化蔬菜，在蔬菜周年供应中占有重要地位。每年播种面积约800万亩，占长江中、下游地区蔬菜复种面积的30～40％。近年来不仅北方大量引种栽培，在东南亚、日本、美国及欧洲等国家和地区也广泛引种，逐渐成为世界性的蔬菜。
作为异花授粉作物，不结球白菜具有典型的自交不亲和性，杂种优势显著。为了提高不结球白菜的产量和品质，生产上多采用杂种一代进行制种。20世纪70年代中期，北京、上海、山东等地区开始应用自交不亲和系配制杂种进行白菜生产，取得了显著增产效果。利用自交不亲和系进行不结球白菜生产，可以获得较高的F1代杂交种产率，不会产生不良的胞质缺陷。因此自交不亲和育种是目前不结球白菜种质资源繁育的重要途径之一。但是对于自交不亲和性的鉴定存在较大难度。传统的检测方法包括荧光显微镜检法、亲和指数法等，需要在花期或结种后进行检测，周期长，操作繁琐，耗费大量的人力和物力，效率较低。
分子生物技术的飞速发展，特别是分子标记技术的建立和成熟，为作物的品种鉴定和遗传多样性分析提供了简单快捷的方法。分子标记辅助育种可以大大加快不结球白菜自交不亲和系的育种进程，提高育种效率。常用的分子标记包括SSR、AFLP、RAPD和AFLP等。其中SSR标记由于具有数量丰富、多态性高、重复性好等诸多优点，在生产科研领域被广泛应用。但是目前国内外关于不结球白菜自交不亲和分子标记的研究较少。史公军(不结球白菜自交不亲和基因的分子标记，硕士论文，南京农业大学，2001)利用RAPD标记获得了一个与不结球白菜自交不亲和性相关的分子标记，其遗传距离为7.54cM。由于RAPD标记为显性标记，不能区分杂合基因型和纯和基因型，并且操作繁琐，重复性和稳定性较差，无法用于实际生产中不结球白菜自交不亲和性的检测。目前关于不结球白菜自交不亲和基因连锁SSR分子标记的获得方法与应用未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对不结球白菜育种中亲和指数法的缺陷，如检测周期长、工作量大、容易受环境条件限制等，提供一种能够对苗期不结球白菜进行自交不亲和性检测的SSR分子标记，从而对不结球白菜植株的自交不亲和性进行快速鉴定，加快不结球白菜分子标记辅助育种进程。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记或者引物组合物，其特征在于其标记引物为Na12E02、KBRH138G23或BrSS15中的至少一种，其中
标记引物Na12E02为：
正向引物：5’-TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG-3’，
反向引物：5’-CAGCAGCCACAACCTTACG-3’；
标记引物KBRH138G23为：
正向引物：5’-TTTGACATCGTGCAATGCTA-3’，
反向引物：5’-TTGGGCTGGTCCTGAAGATA-3’；
标记引物BrSS15为：
正向引物：5’-CCATTCGCGAGGTTAGATTC-3’，
反向引物：5’-ACACAGCCACATCAAACCAA-3’。
本发明中优选的标记引物为BrSS15。
本发明的SSR分子标记的引物组合物可以应用在不结球白菜自交不亲和基因鉴定方面。该应用可包括如下步骤：通过PCR扩增育种分离世代材料的DNA，如果能够扩增出150bp片段、380bp片段或240bp片段中的至少一种，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。特别是对于标记引物Na12E02，在扩增时如果能够扩出150bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在；对于标记引物KBRH138G23，对不结球白菜DNA进行扩增时，如果能够扩出380bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在；对于标记引物BrSS15，对不结球白菜DNA进行扩增，如果能够扩出240bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。
本发明中所述的育种分离世代材料为近等基因系获得的高度分离的F2后代群体或者高度分离的BC1后代群体。
本发明的不结球白菜自交不亲和性SSR分子标记获得方法按以下步骤进行：从育种分离世代材料中提取DNA。根据已发表的文献资料，初步筛选出2个与不结球白菜自交不亲和基因有关的SSR分子标记Na12E02和KBRH138G23。为获得与自交不亲和基因遗传距离较近的分子标记，利用大白菜基因组数据库(http://brassicadb.org)，在Na12E02附近3cM范围内开发设计SSR引物。根据PCR扩增结果筛选出与不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记BrSS15。
本发明的不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记获得方法具体包括如下步骤：
(1)从育种分离世代材料中提取DNA：选择不结球白菜自交不亲和分离世代材料P1、P2、F1和F2的种子进行播种；待幼苗长至3～4片真叶时，每植株取1片幼叶，用改良的CTAB法提取DNA；
(2)不结球白菜自交不亲和SSR分子标记的筛选：根据已发表的文献资料，从332对SSR引物中初步选择用于不结球白菜自交不亲和基因筛选的分子标记进行PCR扩增。根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及亲和指数统计结果，从中筛选出2个与不结球白菜自交不亲和基因有关的SSR分子标记，引物序列如下：Na12E02：正向引物：5’-TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG-3’，反向引物：5’-CAGCAGCCACAACCTTACG-3’；KBRH138G23：正向引物：5’-TTTGACATCGTGCAATGCTA-3’，反向引物：5’-TTGGGCTGGTCCTGAAGATA-3’。
(3)不结球白菜自交不亲和基因连锁SSR分子标记的开发：
在Perl语言环境下运行MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)，利用大白菜基因组数据库(http://brassicadb.org)，在Na12E02附近3cM范围内开发设计SSR引物。利用Primer3.0引物设计软件对检索到的SSR序列进行批量引物设计。根据PCR扩增和电泳结果，从中筛选出与不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记BrSS15，引物序列为：正向引物：5’-CCATTCGCGAGGTTAGATTC-3’，反向引物：5’-ACACAGCCACATCAAACCAA-3’。
(4)SSR分子标记的PCR扩增：以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应包括以下步骤：扩增体系的总体积为10微升，40ng·μL-1DNA模板0.5μL，10×PCR buffer1μL，Mg2 +0.8μL，2.5mmol·L-1dNTPs0.8μL，100ng·μL-1的上，反向引物各0.5μL，2.5U·μL-1的Taq酶0.1μl，ddH2O5.8μl；PCR反应程序为：95℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
(5)电泳检测及图像分析：使用8％的聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分离，50V预电泳30min后，取PCR扩增产物上样。120V恒压电泳，直至二甲苯青到达凝胶的2/3位置处停止电泳。银染法染色后拍照保存。
(6)自交不亲和性状表现型的田间观察和统计：对F2分离群体进行花期和蕾期人工套袋自交，调查种子的结实情况。自交亲和指数可以按照如下公式计算：自交亲和指数＝自交结实种子总数/套袋自交花蕾总数。对于自交亲和指数小于1的认为是自交不亲和，自交亲和指数大于1的认为是自交亲和。
(7)数据整理和连锁分析：将各个株系的带型按照亲本类型分类。SSR标记名称用引物名称表示。根据田间自交亲和指数结果，利用Mapmaker3.0对F2分离群体扩增的SSR标记和自交不亲和基因之间的遗传关系进行统计分析。采用MapDraw进行图谱的绘制，以确定与自交不亲和基因连锁的SSR分子标记。
本发明利用SSR技术筛选得到的与自交不亲和基因连锁的分子标记Na12E02和KBRH138G23，对应的遗传距离分别是3.08cM和5.35cM(图5)。采用MISA和Primer3.0软件开发设计，获得与自交不亲和基因紧密连锁SSR引物BrSS15，其遗传距离为0.49cM(图6)。与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明开发的SSR分子标记BrSS15与不结球白菜自交不亲和基因紧密连锁，大大提高了不结球白菜自交不亲和分子标记结果的可靠性。
(2)本发明可在不结球白菜育种进程中进行，利用SSR分子标记可以对植株个体的叶片DNA进行准确、快速的分型，可以针对任何品种及世代的植物材料进行自交不亲和性检测。本发明可在苗期开展早期鉴定，又不影响植株的正常生长。
附图说明
图1是父母本及F1、F2代DNA的提取图。
P1为自交不亲和亲本210；P2为自交亲和亲本002；F1为F1代植株；1-11为F2代单株。
图2是SSR分子标记Na12E02在亲本、F1和部分F2群体中的扩增结果。
M为100bp DNA Marker；P1为自交不亲和亲本210；P2为自交亲和亲本002；F1为F1代植株；1-45为F2代植株。
图3是SSR分子标记KBRH138G23在亲本、F1和部分F2群体中的扩增结果。
M为100bp DNA Marker；P1为自交不亲和亲本210；P2为自交亲和亲本002；F1为F1代植株；1-45为F2代植株。
图4是SSR分子标记BrSS15在亲本、F1和部分F2群体中的扩增结果。
M为100bp DNA Marker；P1为自交不亲和亲本210；P2为自交亲和亲本002；F1为F1代植株；1-45为F2代植株。
图5是F2群体亲和指数分布。
图6是SSR分子标记Na12E02、KBRH138G23和BrSS15的遗传连锁图。
Na12E02、KBRH138G23和BrSS15与SI基因的遗传距离分别为3.08、5.35和0.49cM。
具体实施方式
利用SSR等分子标记技术寻找与自交不亲和基因连锁的标记，为定位及克隆这些基因提供了极其有用的工具，并为分子标记辅助育种打下良好的基础。分子标记辅助选择不受环境条件的限制，可实现苗期选择，减少工作量，加快育种进程。目前国内外未见关于不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记方面的报道。
实施例1：不结球白菜亲本及F2代单株自交不亲和性的检测
本例的具体实施步骤是：
1、亲本材料与杂交群体建立：
亲本为不结球白菜品种‘矮脚黄’的两个近等基因系：自交亲和系002和自交不亲和系210，由南京农业大学于园艺学院白菜课题组育成并保存(曹寿椿，侯喜林，郝秀明.不结球白菜矮脚黄自交不亲和系选育及繁种技术的研究.南京农业大学学报，2002，25：111-113)。其中002表现为强自交不亲和性，亲和指数＜1.0；210表现为自交亲和性，亲和指数＞5.0。以210为母本，002为父本进行杂交授粉，获得F1杂交组合210×002，通过自交，获得高度分离的F2后代群体用于自交不亲和性鉴定、分子标记的筛选及连锁分析。
2、样品采集和DNA的提取
待不结球白菜幼苗长至4片真叶时，取幼嫩叶片0.1g，用改良的CTAB法提取植株材料的DNA，样品在-20℃下冷冻保存。
改良CTAB法提取DNA步骤为：配制CTAB缓冲液(100mL)：CTAB2g；Tris–HCl(pH8.0)0.1mol·L-1；EDTA-Na2(PH8.0)20mmol·L-1；NaCl1.4mol·L-1；PVP2g；dd H2O29g。2％的CTAB提取缓冲液于65℃提前预热并按体积比加β-巯基乙醇。将0.1g幼嫩叶片研磨成细粉末状，加入1mL CTAB提取缓冲液，迅速转移至离心管；65℃水浴70min，期间每15min左右取出摇匀；12000rpm离心5min，取上清，加1mL氯仿/异戊醇轻摇，12000rpm离心10min，重复一次；取1mL预冷异丙醇，将上清液缓慢加入，-20℃静置2-3小时；12000rpm离心10min，加70％乙醇1mL，12000rpm离心5min，重复一次；风干，加入50～100μL含RNase的ddH2O溶解DNA，用1％的琼脂糖电泳检测(图1)，-20℃冰箱保存备用。
3、SSR引物的筛选与开发：
不结球白菜自交不亲和SSR分子标记的筛选：根据已发表(Lowe AJ,Moule C,Trick M,Edwards KJ.Efficient large-scale development of microsatellites formarker and mapping applications in Brassica crop species.Theoretical andApplied Genetics,2004,108:1103-1112；Cui XM,Dong YX,Hou XL,Cheng Y,Zhang JY,Jin MF.Development and characterization of microsatellite markers in Brassicarapa ssp.chinensis and transferability among related species.AgriculturalSciences in China,2008,7:257-265)的文献资料，利用亲本DNA和PCR扩增方法对不结球白菜自交不亲和基因的分子标记进行初步筛选。根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及亲和指数统计结果，从332对SSR引物中选择具有多态性的SSR引物在F2群体的DNA中进行验证。根据PCR扩增和电泳结果筛选出2个与不结球白菜自交不亲和基因有关的SSR分子标记Na12E02和KBRH138G23(图2和3)，引物序列如下：Na12E02：正向引物：5’-TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG-3’，反向引物：5’-CAGCAGCCACAACCTTACG-3’；KBRH138G23：正向引物：5’-TTTGACATCGTGCAATGCTA-3’，反向引物：5’-TTGGGCTGGTCCTGAAGATA-3’。
在Perl语言环境下运行MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)，利用大白菜基因组数据库(http://brassicadb.org)，在Na12E02附近3cM范围内开发设计SSR引物。开发标准如下：单核苷酸，二、三、四、五、六核苷酸重复的最少次数分别为18、9、6、5、4和4次以上。利用Primer3.0引物设计软件对检索到的SSR序列进行批量引物设计。引物设计的主要参数为：GC含量为30％～60％之间；退火温度(Tm)控制在50～60℃之间；引物长度在22～25bp之间。根据PCR扩增和电泳结果，从合成的22对引物筛选获得与不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记BrSS15，在F2群体中表现出显著多态性(图4)。引物序列为：正向引物：5’-CCATTCGCGAGGTTAGATTC-3’，反向引物：5’-ACACAGCCACATCAAACCAA-3’。
4、PCR扩增：
以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序为：扩增体系的总体积为10微升，40ng·μL-1的DNA模板0.5μL，10×PCR buffer1μL，Mg2+0.8μL，2.5mmol·L-1dNTPs0.8μL，100ng·μL-1的引物各0.5μL，2.5U·μL-1的Taq酶0.1μL，ddH2O5.8μL；PCR反应程序为：95℃2min预变性后，接着94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃延伸10min。
5、电泳检测和图像分析：
在8％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，包括以下步骤：预电泳：将梳子小心拔出，50V预电泳30min；上样：预电泳结束后，PCR扩增产物10μL，加入2μL的6×LoadingBuffer混匀，取3μL上样；电泳：120V恒压电泳，直至二甲苯青到达凝胶的2/3位置处停止电泳。使用银染法进行凝胶染色，步骤如下：将凝胶放入由10％乙醇和0.5％冰醋酸溶液配置而成的固定液中，放在摇床上轻摇约12-20min，直至胶面指示剂颜色褪掉。用0.2％AgNO3溶液染色12-20min，用去离子水漂洗2次。在显色液中显色至条带清晰为止，
然后拍照保存。
6、自交不亲和性的田间观察和遗传统计分析：
对亲本杂交的F2分离群体进行花期和蕾期人工套袋自交，待种子成熟时用干净的硫酸纸袋分别采收花期自交和蕾期自交获得的种子，并挂于通风处风干后脱粒，调查种子的结实情况。自交亲和指数可以按照如下公式计算：自交亲和指数＝自交结实种子总数/套袋自交花蕾总数。通过自交亲和指数的高低来判断自交亲和性的强弱，自交亲和指数小于1的认为是自交不亲和，自交亲和指数大于1的认为是自交亲和。
F2群体的亲和指数分布显示(图5)，大部分F2单株的蕾期亲和指数大于1，仅有12株小于1；花期亲和指数大于1的植株中，亲和指数在1-1.99的范围内F2单株最多，为24株，在9-9.99范围内最少，仅为3株；花期亲和指数小于1的F2单株为45株。适合性测验显示(表1)，F2群体的χ2均小于χ2 0.05(χ2 0.05＝3.841，df＝1)，具有显著性差异。自交亲和株与自交不亲和株的比例接近3：1，说明不结球白菜自交不亲和性可能由一对隐性基因控制。表1不结球白菜F2代分离群体中亲和性分离
7、数据整理和连锁分析：
将各个株系的带型按照亲本类型分类，若标记呈共显性：与母本210带型相同者记为“1”，与父本002带型相同者记为“2”，与F1带型相同者即杂合带型记为“3”。标记呈显性标记分为两种情况：若母本210等位基因为显性，则父本002带型记为“2”，杂种带型记为“5”；若父本002等位基因为显性，则母本002带型记为“1”，杂种带型记为“4”。无论在显性标记还是共显性标记中，由于某些原因造成的带型不清晰或着数据有缺失均用“–”表示。SSR标记名称用引物名称表示，多态性条带多于一条的，按照多态性条带的分子量由小到大编号。根据田间自交亲和指数结果，利用Mapmaker3.0对F2分离群体扩增的SSR标记和自交不亲和基因之间的遗传关系进行统计分析。采用MapDraw进行图谱的绘制(图6)。
8、结果与分析：
分子标记筛选结果表明，Na12E02、KBRH138G23和BrSS15与不结球白菜自交不亲和性有关，扩增片段大小分别为150bp、380bp和240bp(图2-4)。对引物BrSS15的带型进行统计，F2代中有38株扩增出与自交亲和亲本210相同的带型，说明这些植株具有自交亲和性；42株扩增出与自交不亲和亲本002相同的带型，说明这些植株具有自交不亲和性；扩增出的杂合带型有77株，有1株没有扩增出条带。通过分析软件Mapmaker3.0计算，发现筛选获得的标记BrSS15与不结球白菜自交不亲和基因基因连锁，遗传距离为0.49cM(图6)。
序 列 表
SEQUENCE LISTING
<110> 南京农业大学
<120> 不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用
<130> 说明书
<140> 00
<141> 2013-08-20
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> SSR标记引物Na12E02左端序列
<222> (1)..(25)
<400> 1
ttgaagtagt tggagtaatt ggagg 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> SSR标记引物Na12E02右端序列
<222> (1)..(19)
<400> 2
cagcagccac aaccttacg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> SSR标记引物KBRH138G23左端序列
<222> (1)..(20)
<400> 3
tttgacatcg tgcaatgcta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> SSR标记引物KBRH138G23右端序列
<222> (1)..(20)
<400> 4
ttgggctggt cctgaagata 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> SSR标记引物BrSS15左端序列
<222> (1)..(20)
<400> 5
ccattcgcga ggttagattc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> SSR标记引物BrSS15右端序列
<222> (1)..(20)
<400> 6
acacagccac atcaaaccaa 20

Claims (5)

1.一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记的引物组合物，其特征在于其标记引物为BrSS15：
正向引物：5’- CCATTCGCGAGGTTAGATTC -3’，
反向引物：5’- ACACAGCCACATCAAACCAA -3’。
2.权利要求1所述的不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记的引物组合物在不结球白菜自交不亲和基因鉴定方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：通过PCR扩增
从育种分离世代材料中提取的DNA，如果能够扩增出240 bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于PCR反应体系为：每10微升体系中，40ng ·µL-1 DNA模板0.5 µL，10×PCR buffer 1 µL，Mg2＋ 0.8µL，2.5 mmol·L-1 dNTPs 0.8 µL，100ng ·µL-1的正/反向引物各0.5 µL， 2.5 U·µL -1的Taq酶0.1 µl，ddH2O 5.8µl；PCR扩增反应程序为：95℃预变性2 min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10 min；
采用改良的CTAB法从育种分离世代材料中提取DNA，其步骤为：配制CTAB缓冲液，每100mL中含有：CTAB 2g，pH 8.0的Tris –HCl 0.1 mol·L-1，pH 8.0的EDTA-Na2 20 mmol·L-1，NaCl 1.4 mol·L-1，PVP 2g，dd H2O 29g；将2%的CTAB提取缓冲液于65 ℃提前预热并按体积比加β-巯基乙醇；将0.1 g待提取DNA的幼嫩叶片研磨成细粉末状，加入1mL CTAB提取缓冲液，迅速转移至离心管；65 ℃水浴70 min，期间每15 min取出摇匀；12000 rpm离心5min，取上清，加1mL氯仿/异戊醇轻摇，12000 rpm离心10 min，重复一次；取1mL预冷异丙醇，将上清液缓慢加入，-20℃静置2-3 小时；12000 rpm离心10 min，加70%乙醇1 mL，12000 rpm离心5 min，重复一次；风干，加入50~100 µL含RNase的ddH2O溶解DNA，用1%的琼脂糖电泳检测，-20℃保存备用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于PCR产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，包括预电泳、上样和电泳步骤；电泳后使用银染法进行凝胶染色，染色步骤如下：将凝胶放入由10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液配置而成的固定液中，放在摇床上轻摇12-20 min，直至胶面指示剂颜色褪掉；用0.2% AgNO3溶液染色12-20min，用去离子水漂洗2次；在显色液中显色至条带清晰为止，然后拍照保存。
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