CN102212519B - 一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及其应用，属于生物技术技术领域。本发明提供一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；鉴别上述cDNA分子标记的特异引物，上游引物F240核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物R240核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；以及上述cDNA分子标记及特异引物在鉴别洋葱质核互作雄性不育育性恢复系及保持系材料中的应用。本发明所述的cDNA分子标记稳定；辅助选择操作简便，节约成本。

Description

一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及其应用，属于生物技术技术领域。

技术背景

洋葱(Allium cepa L.)，又称圆葱、葱头，百合科、葱属，二年生植物，已有5000多年的栽培历史，是一种世界性蔬菜，至少有175个国家栽培洋葱。据FAO(2009)统计，世界洋葱种植面积370万公顷，产量7230万吨，在所有的蔬菜作物中，其种植面积居第二位，产量居第三位；其中，我国具有世界最大的洋葱生产面积和产量，生产面积超过100万公顷，总产量2107万吨，约占全世界产量的30％。洋葱素有保健食品的美称，不仅可鲜食，还大量用于加工制品，富含多种硫化物和糖类是其独特风味的主要成分，具有降低和预防血栓形成，降血脂、降血压、抗动脉硬化、预防心肌梗塞的作用，深受消费者的喜爱。

自1925年Jones[Jones H，Clarke A.Inheritance of male sterility in the onion and theproduction of hybrid seed.Proc Am Soc Hortic Sci，1943，43：189-194]首先在“意大利红”(Italian Red)品种中发现雄性不育株后，国外便开始了洋葱杂种优势利用的研究，开创了蔬菜杂交育种的先例。我国洋葱栽培历史较短，品种资源较匮乏，目前种植的品种可分为红皮、黄皮及白皮洋葱，栽培品种以常规品种为主，随着农业产业结构的调整，对洋葱优良品种的需求日益增加。我国上世纪八十年代从日本、美国等国家引种杂交品种，其品质、产量及一致性都明显优于常规种[Berninger E.Contribution a l’etude de la sterilite male de l’oignon(Allium cepa L).Ann Amehor Plantes，1965，15：183-199]。由于洋葱品种选育的周期长，为普通蔬菜作物白菜、萝卜的2-4倍，生产上主要以进口品种为主，缺少具有自主知识产权的杂交一代品种，因此，需要花费大量的外汇从国外进口杂交种，导致洋葱生产成本居高不下，增加了农民生产负担和种植风险。要改变我国在洋葱育种领域上的落后局面，关键在于尽快广泛收集品种资源，走现代分子生物学技术与常规育种相结合的道路，加快分子标记辅助选择以及雄性不育系利用的研究。因此，不育系、保持系和父本自交系的筛选鉴定工作已成为目前亟待解决的问题，并且已成为制约洋葱产业发展的关键性环节。

目前，在洋葱质核互作雄性不育的鉴定中，细胞质鉴定的分子标记研究已经取得了显著的进展。但是在细胞核鉴定上，由于洋葱基因组DNA巨大(17.9pg)[Labani R and ElkingtonT.Nuclear DNA variation in the genus Allium L.(Liliaceae).Heredity，1987，59：119-128]，每条染色体上的核苷酸有15,290Mbp，是玉米基因组的6倍、番茄的16倍、拟南芥的107倍[King J J，Bradeen J M，Bark O，et al.A low-density genetic map of onion reveals a role fortandem duplication in the evolution of an extremely large diploid genome.Theoretical andApplied Genetics，1998，52：52-62]，国内外均未取得突破性进展。

和Havey在两个开放授粉的洋葱群体内[

AF，J McCallum，Y Sato and MJ Havey.Molecular tagging of the Mslocus in onion.Journal ofthe American Society for Horticultural Science，2002，127：576-582]，以AOB272标记为辅助工具，尝试选择保持系，但发现该标记与保持系几乎没有关联。原因可能是在长久的开放授粉环境下，AOB272标记与Ms位点之间已经进行了充分的染色体交换，因此只用该分子标记无法准确地在开放授粉群体中选出保持系。尽管如此，该标记对洋葱恢复基因的研究上仍具有非常重要的意义。

基因标记的目的是实现分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection，MAS)。洋葱质核互作雄性不育细胞质和细胞核分子标记的开发与利用可大大减少工作量，提高育种效率。虽然目前可以利用与细胞质位点雄性不育连锁的标记鉴别出单株的细胞质类型，淘汰可育材料中S型细胞质，只从N型细胞质类型的单株中选保持系，从而减少测交组合数和自交株数，减少工作量，避免盲目性，提高了选择效果[Havey MJ.Identification of cytoplasms using thepolymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion.Theor Appl Genet，1995，90：263-268]。然而在细胞核的鉴定上，仍需田间杂交、测交进行两代试验、4-6年的时间。因此，洋葱细胞核标记的开发可以减少鉴定杂交后代的工作量、时间消耗以及试验成本。获得洋葱细胞核育性标记，剔除育性恢复材料，筛选保持系，对于洋葱不育系和保持系配套，选育洋葱杂交种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记及由该分子标记设计的特异引物，该cDNA分子标记及特异引物能对洋葱花蕾期的花蕾cDNA进行快速准确鉴定，剔除育性恢复材料，筛选保持系，从而加快洋葱质核互作雄性不育新品系的选育，建立新型的洋葱杂交种亲本选配体系。

一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

鉴别上述cDNA分子标记的特异引物，上游引物F240核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物R240核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述cDNA分子标记及特异引物在鉴别洋葱质核互作雄性不育育性恢复系及保持系材料中的应用。

上述应用，步骤如下：

提取洋葱样本花蕾期的花蕾总RNA，然后将总RNA反转录为cDNA，再经过上述特异引物PCR扩增后，检测是否含有上述cDNA分子标记，含有上述cDNA分子标记的样本即为洋葱质核互作雄性不育育性恢复材料样本，剔除育性恢复材料，结合表型性状或者细胞质标记即可筛选出育性保持材料样本。

提取洋葱样本花蕾期的花蕾总RNA，采用Trizol法进行操作(试剂盒购自Invitrogen，California，USA；操作步骤按产品说明书)。

所述总RNA反转录为cDNA可按现有技术进行操作，也可按参照EasyScript First-StrandcDNA Synthesis SuperMix产品说明书的步骤操作(购自TransGen Biotech，Beiiing，China)

所述特异引物PCR扩增，反应体系如下：

25μL体系，其中含Mg²⁺的10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM dNTPs 2.0μL(每种脱氧核苷酸浓度均为2.5mM)，0.5μmol/L上游引物F2401.0μL、0.5μmol/L下游引物R2401.0μL，模板DNA 1.0μL(100pg)，5U/μL Taq DNA polymerase 0.3μL，ddH₂O 17.2μL；

反应程序如下：

94℃预变性4min；94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

检测是否含有上述cDNA分子标记，步骤如下：

将经过PCR扩增后的产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电压140v，电泳时间30分钟，溴化乙啶染色后，与同样经上述条件于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后溴化乙啶染色的DNA分子标记进行比较，如果在距泳道起始点相同距离的位置有条带，则含有cDNA分子标记。

上述操作步骤及操作条件如无特殊说明，均按本领域常规操作步骤及操作条件实施。

有益效果：

本发明选用洋葱细胞质雄性不育材料(118)及其相应的育性恢复材料(12-10)杂交，然后用后代可育株单株S(Msms)与母本不育系118回交，根据回交一代的育性分离分为可育群体S(Msms)和不育群体S(msms)。从可育和不育群体中分别各选择8株，构建可育池和不育池。然后用蕾期花蕾总RNA的cDNA模板进行SRAP分析，获得了在恢复材料中特异表达的片段，并根据该特异表达的片段设计了鉴定细胞核的稳定的cDNA分子标记特异引物，为洋葱分子标记辅助选择育种体系奠定了基础，与目前技术相比，其优点是：

(1)cDNA分子标记稳定：本发明选用洋葱质核互作雄性不育材料(118)及其相应的育性保持材料(218)、恢复材料(12-10)回交一代分离群体中可育和不育株组的蕾期花蕾cDNA为模板进行扩增，获得了恢复材料特异表达片段的cDNA分子标记，并对不同来源的其他六份材料进行了验证，其表型与分子标记鉴定结果完全一致。

(2)分子标记辅助选择操作简便，节约成本：洋葱是两年生植物，其育种年限是白菜、萝卜等蔬菜育种年限的2-4倍，常规选育方法，周期长，成本高，费时又费力。通过本发明，只需对洋葱蕾期花蕾cDNA，进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，即可有效的鉴定材料细胞核的育性。在目前尚无稳定可靠DNA分子标记鉴定核基因育性的情况下，该cDNA分子标记，不仅避免了常规方法繁琐的筛选过程，还可以节省4-6年杂交测交时间以及此过程中大量劳动消耗、费用消耗，从而使得其操作过程更简单、有效。

附图说明

图1洋葱不同组织器官总RNA电泳图；

图2不育材料及其育性恢复材料相关序列扩增多态性(SRAP)分析的PAGE电泳图；

图3育性恢复材料特异扩增片段蛋白的结构域图；

图4AcPME氨基酸同源比对图；

图5AcPME氨基酸进化树分析；

图6WHR240标记组织特异性表达电泳图；

图7WHR240标记在6种不同来源洋葱材料中的鉴定电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图，对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中的材料与方法：

1、植物材料

不育材料(118)：从洋葱品种金球中发现并通过3次测交、回交选育而成，选育方法参见[Jones，H.A.and A.Clarke.1943.Inheritance of male sterility in the onion and the productionof hybrid seed.Proc.Amer.Soc.Hort.Sci.43：189-194]；

育性保持材料(218)：选育方法参见[Jones，H.A.and A.Clarke.1943.Inheritance of malesterility in the onion and the production of hybrid seed.Proc.Amer.Soc.Hort.Sci.43：189-194]；

育性恢复材料(12-10)及育性恢复材料(146)：来源于日本洋葱品种早黄金，核基因型为MsMs，通过测交、回交方法选育而成，选育方法参见[Pike，L.M.1986.Onion breeding.In：Basset，M.J.(ed.)Breeding Vegetable Crops.AVI Publishing Co.，Connecticut，pp，357-394]

育性恢复材料(149)：来源于日本洋葱品种大宝，通过测交、回交等方法选育而成，选育方法同育性恢复材料(12-10)。

育性恢复材料(153)：来源于日本洋葱品种泉州中甲高黄，通过测交、回交方法选育而成，选育方法同育性恢复材料(12-10)。

育性恢复材料(156)：来源于日本洋葱品种拉姆达，通过测交、回交方法选育而成，选育方法同育性恢复材料(12-10)。

不育材料(102)：从日本品种秀玉丸中发现并通过3次测交、回交选育而成，选育方法参见[Jones，H.A.and A.Clarke.1943.Inheritance of male sterility in the onion and the productionof hybrid seed.Proc.Amer.Soc.Hort.Sci.43：189-194]；

育性保持材料(202)：通过测交、回交选育而成。方法同不育材料(102)，为试验材料。

2、总RNA的提取与检测

洋葱总RNA提取采用Trizol法(试剂盒购自Invitrogen，California，USA)，琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测。

3、总RNA的反转录

参照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix产品说明书的步骤操作(购自TransGen Biotech，Beijing，China)。

4、基因池的建立

应用分离群体分组分析法(Bulked Segregation Analysis)即BSA法，选用洋葱细胞质雄性不育材料(118)及其相应的育性恢复材料(12-10)杂交，然后用后代可育株单株S(Msms)与母本不育系118回交，根据回交一代的育性分离分为可育群体S(Msms)和不育群体S(msms)。从可育和不育群体中分别各选择8株，构建可育池和不育株池。将不育材料的8个单株和可育材料8个单株的cDNA样品分别等量混合，组成洋葱雄性不育池及其育性恢复基因池。

5、引物的设计与合成

参照Li(Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new markersystem based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica.Theoretical and Applied Genetics，2001.103：455-461.)中的描述，设计了100对SRAP引物；

根据特异片段WHR350(序列如SEQ ID NO.6所示)序列设计一对cDNA分子标记的特异引物：

上游引物F240：5′CTCAAGATGGAAGTGGGCAGTTTACC 3′；SEQ ID NO.2

下游引物R240：5′ATCTCCCATAACAGCGA ATGTCGC 3′；SEQ ID NO.3

根据NCBI-GenBankTublin(登录号为：CF436740.1、CF447127.1)中记载的基因序列设计了对照引物：

上游引物Tub-F：5′GCCTTGAGCATGGGATTCAG 3′；SEQ ID NO.4

下游引物Tub-R：5′GTGGAGAGGACACTGTTGTATGG 3′；SEQ ID NO.5

上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成，PAGE纯化。

6、PCR扩增及检测

PCR扩增在美国伯乐公司生产的TC-XP-D型基因扩增仪上进行。

6.1SRAP扩增体系：25μL反应体系中10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(每种脱氧核苷酸浓度均为2.5mM)2.0μL，上游SRAP引物、下游SRAP引物(0.5μmol/L)各1.0μL，模板DNA 1.0μL(100pg)，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.3μL，ddH₂O17.2μL；

SRAP扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；PCR产物于6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，银染后数码相机拍照。

6.2组织特异性表达扩增体系和程序：25μL体系，其中10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(每种脱氧核苷酸浓度均为2.5mM)2.0μL，上游引物F240、下游引物R240(0.5μmol/L)各1.0μL，模板DNA 1.0μL(100pg)，Taq DNA polymerase(5U/μL)0.3μL，ddH2O17.2μL；

PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸30sec，29个循环；72℃延伸5min，4℃保存；PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳分离分析，溴化乙啶染色，凝胶成像系统自动成像。

7、特异条带回收纯化、克隆与测序

片段回收按照TIANgel Midi Purification Kit(购自Tiangen公司)使用说明回收扩增片段；连接、转化、鉴定采用分子克隆II的方法；DNA序列测定委托北京博尚生物技术有限公司完成。

8、单株验证

通过田间分离群体中观察判断各株的育性，在蕾期提取花蕾总RNA，反转录为cDNA后进行PCR扩增，以Tublin(Tub-F：5′GCCTTGAGCATGGGATTCAG3′；Tub-R：5′GTGGAGAGGACACTGTTGTATGG 3′)基因为对照，反应体系、程序以及检测方法参照6.2。

9、组织特异性表达分析

以WHR240(上游引物F240，下游引物R240)为扩增引物，Tublin(上游引物Tub-F，下游引物Tub-R)为对照引物，对不同材料、不同发育时期、不同部位的样品进行组织特异性表达分析，反应体系、程序以及检测方法参照6.2。

10、序列分析

序列进入NCBI数据库进行Blastn分析，蛋白的同源比对分析和进化树分析采用DNAMAN软件。

11、WHR240标记在其他材料中的验证

利用WHR240标记引物对已知基因型的不同来源的其他材料(146、149、153、156、102和202)进行验证，反应体系、程序以及检测方法参照6.2。

实施例1

一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

鉴别上述cDNA分子标记的特异引物，上游引物F240核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物R240苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

该cDNA分子标记由如下步骤获得：

(1)不同组织材料样品总RNA检测分析

应用Trizol法提取洋葱不同样品的总RNA，然后用DNaseI处理总RNA，目的是彻底去除残留的DNA污染。对提取的总RNA进行分光光度计检测，其中OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8-2.0之间；非变性琼脂糖凝胶电泳分析28s、18s条带清晰、无弥散，未检测到DNA残留(如图1所示)。证实提取的总RNA样品无DNA残留，可以进行下一步的试验。

(2)SRAP扩增及组织特异性表达分析

使用100对SRAP引物对洋葱蕾期可育群体和不育群体进行差异表达分析，获得在洋葱可育群体中特异表达片段(如图2所示)，回收、测序该片段，命名该片段为：WHR350(序列如SEQ ID NO.6所示)，然后根据该片段的序列设计特异引物：

上游引物F240：5′CTCAAGATGGAAGTGGGCAGTTTACC 3′；SEQ ID NO.2

下游引物R240：5′ATCTCCCATAACAGCGAATGTCGC 3′；SEQ ID NO.3

PCR扩增后，获得大小为240bp的基因片段，命名为WHR240，序列如SEQ ID NO.1所示。

对洋葱育性恢复材料(12-10)、育性保持材料(218)和不育材料(118)的苗期(根、叶)、鳞茎期(根、鳞茎、叶)、蕾期(根、茎、蕾)的cDNA模板进行扩增，以明确特异表达片段表达部位和表达时期。结果表明仅在蕾期育性恢复材料的花蕾中存在WHR240片段的扩增条带，在其他部位没有扩增条带；而在保持材料(218)和不育材料(118)的苗期、鳞茎期和蕾期的根、茎、叶、蕾均未产生扩增条带(如图6所示)。

(3)个体验证

对通过观察判断洋葱质核互作回交一代群体中240份样本进行单株验证，所有的恢复材料样本中均有240bp的扩增带，而不育材料中不存在此带的扩增。说明应用上述特异引物(上游引物F240、下游引物R240)完全可以鉴别洋葱细胞核的育性。

(4)洋葱质核互作雄性不育恢复材料12-10特异表达片段WHR240的序列分析

对洋葱质核互作雄性不育恢复材料中12-10扩增出来的特异片段WHR240，经过回收、转化、克隆和测序，其序列碱基组成为A+T＝51.1％，C+G＝48.2％。把这段序列利用Genbank-blastn分析工具进行序列比对，同源性较高的为水稻果胶甲酯酶，同源性72％；玉米的果胶甲酯酶ZmPME，同源性70％；柳树的果胶甲酯酶基因SgPME1，同源性为69％；拟南芥果胶甲酯酶AtPME，同源性68％；高粱果胶甲酯酶SbPME，同源性66％；表明这段序列可能为果胶甲酯酶超家族成员。

翻译成蛋白进行Blastp对比，发现与水稻果胶甲酯酶(NP_001063246.1)、玉米果胶甲酯酶(NP_001169525.1)、柳树果胶甲酯酶(BAA89480.1)、拟南芥果胶甲酯酶(XP_002878962.1)、高粱果胶甲酯酶(XP_002445591.1)等有一定的同源性(如图4所示)，而且具有相同的结构域、活性位点、结合位点，因此，认为该基因编码蛋白质可能具有果胶甲酯酶的活性(如图3所示)。进化树分析表明洋葱果胶甲酯酶(AcPME)与水稻、玉米、高粱关系较近而与拟南芥、柳树关系较远(如图5所示)。

实施例2

实施例1中的cDNA分子标记及特异引物在鉴别洋葱质核互作雄性不育核恢复材料及育性保持材料中的应用上述应用，步骤如下：

采用Trizol法提取洋葱样本花蕾期的花蕾总RNA，然后将总RNA反转录为cDNA，再经过特异引物(上游引物F240、下游引物R240)PCR扩增后，产物于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，电压140v，电泳时间30分钟，溴化乙啶染色后，与同样经上述条件于1.5％琼脂糖凝胶进行电泳后溴化乙啶染色的DNA分子标记进行比较，如果在距泳道起始点相同距离的位置有条带，则含有cDNA分子标记，即为洋葱育性恢复材料样本，无此带扩增即为不育材料样本或者育性保持材料样本；然后根据表型有无花粉或者已经成功的细胞质分子标记筛选出育性保持材料。

经对已知的洋葱材料不育材料(118)、育性保持材料(218)、育性恢材料(12-10)以及育性恢复材料(146)、育性恢复材料(149)、育性恢复材料(153)、育性恢复材料(156)、不育材料(102)和育性保持材料(202)进行上述鉴别，结果如图7所示，育性恢复材料(146、149、153、156)中均有240bp条带，而在不育材料(102)和育性保持材料(202)中未见240bp条带。

根据WHR240标记结合表型有无花粉或者细胞质分子标记即可筛选配套的育性保持材料。

经田间验证，PCR结果与田间判断结果吻合。

Claims (2)

1.一种洋葱育性恢复的cDNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.鉴别权利要求1所述cDNA分子标记的特异引物，上游引物F240核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物R240核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

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