CN107466844B - 一种提高萝卜杂交结实率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高萝卜杂交结籽率的方法。为了解决两个综合性状均表现优良且配合力好的萝卜亲本材料，在杂交制种过程中出现杂交结籽率低的问题，本发明利用分子标记技术提高双亲的亲和性，从而提高制种产量，降低繁种成本。首先对双亲自交不亲和基因的S单元型进行鉴定，并开发不同S单元型间的分子标记，然后对双亲材料进行分子标记辅助选择，筛选获得双亲间S单元型不一致的单株进行亲本扩繁，扩繁亲本用于杂交制种。本发明能够解决双亲不亲和引起的萝卜杂交结实率低问题，显著提高其制种产量。

Description

一种提高萝卜杂交结实率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高萝卜杂交结实率的方法，属于分子植物育种技术领域。
背景技术
萝卜是重要的十字花科蔬菜作物，在全世界各地广泛栽培。萝卜是异花授粉作物，具有明显的杂种优势。自交不亲和系和雄性不育系是萝卜杂交制种及利用杂种优势的重要途径。但在实际育种过程中，两个优良材料在配制一代杂种过程中有时会出现花期杂交结实率低的现象，其主要原因是两个萝卜材料带有相同的S单元型，从而导致不亲和反应的发生。因此如何解决因自交不亲和引起的萝卜杂交结实率低的问题变得十分迫切。
植物的自交不亲和性(Self-incompatibility，SI)在高等植物中广泛存在，是植物预防近亲繁殖、防止自交衰退和保持遗传多样性的重要遗传机制。萝卜的自交不亲和体系属于孢子体自交不亲和，遗传上由一个具有复等位基因的高度多态性的S位点控制，包含3类参与SI识别反应的基因，即S位点糖蛋白基因(SLG)、S位点受体激酶基因(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白基因(SCR/SP11)，分别编码雌、雄不亲和决定因子，每一个S位点又被称为一个“S单元型”。到目前为止，在萝卜属和芸薹属中约有100多个S单元型被鉴定，在栽培萝卜中鉴定了约40个S单元型。
在实际育种中，了解每份材料的S单元型信息对配制杂交组合具有重要的指导意义。传统的自交不亲和性的鉴定方法是亲和指数法。它是通过在田间进行花期人工自交或者株间杂交，通过调查授粉花数和结籽数来测定自交或杂交亲和与否。随着分了生物学、生物信息学的发展，对萝卜S基因研究工作逐渐深入，主要集中在S单元型中SLG、SRK、SCR/SP11基因序列的多样性分析，同时陆续公布了S单元型的基因序列信息(目前为止，在NCBI上共有41个)，这为利用基因测序技术鉴定萝卜材料的S单元型提供了可靠的理论依据。
发明内容
本发明提供一种提高萝卜杂交结实率的新方法，便于解决因萝卜双亲不亲和引起的杂交结实率低的问题，具有较好的可操作性和应用价值。
一种提高萝卜杂交结实率的方法，步骤如下：
(1)杂交制种田观察：在杂交制种田调查单株结实的差异，其中结实率高的单株为杂交亲和单株，杂交结实率低的单株为杂交不亲和单株。
(2)S单元型鉴定：分别鉴定杂交制种田中杂交亲和单株、杂交不亲和单株和父本的S单元型。
(3)分子标记开发：根据步骤(2)的鉴定结果，开发不同S单元型间的多态性分子标记。
(4)亲和单株筛选并扩繁：利用步骤(3)开发的分子标记，在亲本中筛选具有上述杂交亲和单株S单元型的植株并扩繁，获得新的杂交制种本。
(5)杂交种生产：利用步骤(4)扩繁获得的新的杂交制种母本和父本，按照合适的定植比例种植，生产杂交种。
所述杂交制种田中结实率高的亲和单株应为结实率极显著高于其他不亲和单株，与常规萝卜杂交结实率相近。
所述S单元型鉴定的鉴定方法包括：基因组DNA提取；PCR扩增；基因克隆与测序；序列比对；其中萝卜自交不亲和S基因扩增特异引物为上游序列5’-AGGCTTCAGCATATAAACCTTG-3’；下游引物5’-TTACCGGGCATCGATGACTGA-3’。
所述分子标记是根据双亲不同S基因序列多态性设计的，操作简单、可用于大规模样品检测的分子标记类型，包括但不限于PCR-RFLP、SNP标记。
所述亲和单株筛选并扩繁，应包含利用分子标记进行单株筛选后，进行材料田间真实性、一致性鉴定，去除杂株，避免扩繁时引起亲本生物学混杂。所述杂交种生产，应保证父母本按合适比例定植且授粉蜂源充足。
所述杂交制种田中未发现结实率高的亲和单株，可以利用同样的方法对自交代数较低的亲本进行鉴定和选择；也可以对父本材料进行鉴定选择和改造。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种提高萝卜杂交结实率的方法。本发明基于萝卜自交不亲和理论，利用分子标记技术在制种亲本中筛选具有不同S单元型的亲和单株并扩繁，用于解决因双亲不亲和引起的萝卜杂交结实率低问题。本发明能够显著提高萝卜杂交制种产量，降低制种成本，有利于新品种的推广应用。
附图说明
图1、“京红3号”萝卜杂交制种田中亲和单株与不亲和单株结实情况。
图2、“京红3号”母本和父本单株S单元型类型及分子标记鉴定。
图3、“京红3号”母本中具有不同S单元型单株的结实情况。
图4、S-11和S-38单元型SRK基因序列比对结果。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解。
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、“京红3号”双亲S单元型的鉴定
“京红3号”是北京市农林科学院蔬菜研究中心育成的红皮系列萝卜新品种之一，具有肉质根皮色鲜红、肉色白，根形圆正、抗病性强、熟食品质佳等优点，适于华北、东北地区秋季种植。该品种利用雄性不育系制种制种田仅有约20％的母本单株结实正常(亲和单株)，亩产量20公斤左右(图1)，制种成本高，制约其进一步推广应用。分析认为可能是由于双亲含有相同的S单元型造成了杂交不亲和，引起杂交结实率低，因此有必要对其双亲的S单元型进行鉴定。
(1)供试体材料包括来自“京红3号”制种田的父本系、杂交亲和单株、杂交不亲和单株。取萝卜幼嫩叶片采用CTAB法提取基因组DNA。
(2)引物来源：利用NCBI公布的部分SRK基因序列(AY052579～AY052585；AY534533～AY534543)，通过序列比对根据保守序列设计特异扩增引物，上游序列5’-AGGCTTCAGCATATAAACCTTG-3’；下游引物5’-TTACCGGGCATCGATGACTGA-3’。
PCR反应体系：包含100ng基因组DNA，3μl 10×PCR Buffer，2.4μl dNTPs(2.5mM)，上述上下游引物(10μM)各0.6μl，0.3μl Taq酶(5U/μl)，加ddH2O至30μl。
PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(3)利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对上述PCR产物进行纯化后，连接到pMD18-T载体上，并转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得SRK基因单克隆片段，并进行基因测序。
(4)利用NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast在线比对，结果发现“京红3号”父本系和制种田杂交不亲和单株的S单元型为S-11(序列表序列3)，杂交亲和单株的S单元型没有获得比对结果，认定为新的S单元型，命名为S-38(序列表序列4)。
实施例2、S-11和S-38单元型多态性标记的开发与辅助选择
如图4所示，经DNAMAN软件比对发现上述S-11与S-38单元型SRK基因存在9个碱基的差异，且包含多态性Taqa I内切酶酶切位点(5’-AGCT-3’)。根据此位点的变异开发PCR-RFLP标记用于“京红3号”杂交亲和单株的筛选。
分别取“京红3号”父本、不育系(母本)及其保持系各300株，利用上述PCR-RFLP标记进行亲和单株筛选。如图2所示，父本的S单元型全部为S-11，母本不育系中S单元型为S-38的单株占15.5％，S单元型为S-11的单株占84.5％，保持系中S单元型为S-38和S-11的单株分别为2％和98％。
2015年12月利用分子标记对“京红3号”母本不育系及其保持系进行选择，分别选出S单元型为S-38的不育系90株，S单元型为S-38的保持系30株，按照3∶1的定植比例定植于亲本繁殖棚，初花期放蜜蜂2匹，繁殖亲本，并于当年秋季进行纯度鉴定。
实施例3、生产试验
2015年12月利用分子标记对“京红3号”母本不育系进行选择，分别选出S单元型为S-38、S-11和S-11/S-38的母本单株各20株，与父本(S单元型为S11)定植于同一制种棚内，初花期放蜜蜂2匹，进行杂交制种试验。如图3所示，具有S-38单元型的母本材料结荚数显著多于S单元型为S-11的母本材料，分别收获种子40.3g和450.2g。表明利用标记对“京红3号”亲本的S单元型进行选择后，能够显著提高其杂交制种产量。
2016年秋分别将来自S单元型为S-38和S-11母本收获的“京红3号”杂交种播种于露地，检测品种的真实性和一致性，结果显示来自不同S单元型母本收获的杂交种，均表现为“京红3号”的品种特征。
本发明的方法在不影响品种特性的情况下，大幅提高了因双亲不亲和引起的萝卜杂交结实率低的问题。
Figure ISA0000151036440000011
Figure ISA0000151036440000021
Figure ISA0000151036440000031
Figure ISA0000151036440000041

Claims (4)

1.一种提高萝卜杂交结实率的方法，步骤如下：
(1)杂交制种田观察：在发生杂交不亲和的制种田中调查单株结实的差异，其中结实率高的单株为杂交亲和单株，杂交结实率低的单株为杂交不亲和单株；
所述杂交制种田中结实率高的亲和单株应为结实率极显著高于其他不亲和单株，与常规萝卜杂交结实率相近；
(2)S单元型鉴定：分别鉴定杂交制种田中杂交亲和单株、杂交不亲和单株和父本的S单元型；
所述S单元型鉴定的鉴定方法包括：基因组DNA提取；PCR扩增；基因克隆与测序；序列比对；其中萝卜自交不亲和S基因扩增特异引物为：
上游序列5’-AGGCTTCAGCATATAAACCTTG-3’；
下游引物5’-TTACCGGGCATCGATGACTGA-3’；
(3)分子标记开发：根据步骤(2)的鉴定结果，开发不同S单元型间的多态性分子标记；
(4)亲和单株筛选并扩繁：利用步骤(3)开发的分子标记，在亲本中筛选具有上述杂交亲和单株S单元型的植株并扩繁，获得新的杂交制种亲本；
(5)杂交种生产：利用步骤(4)扩繁获得的新的杂交制种母本和父本，按照合适的定植比例种植，生产杂交种。
2.根据权利要求1所述的方法，所述分子标记是根据双亲不同S基因序列多态性设计的，操作简单、可用于大规模样品检测的分子标记类型，包括但不限于PCR-RFLP、SNP标记。
3.根据权利要求1所述的方法，所述亲和单株筛选并扩繁过程中，鉴定群体大小应根据步骤(1)中杂交亲和单株出现的比例确定，利用分子标记进行单株筛选后应进行材料田间真实性、一致性鉴定，去除杂株，避免扩繁时引起亲本生物学混杂。
4.根据权利要求1所述的方法，所述杂交种生产过程应父母本按比例合适定植、且授粉蜂源充足。
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