CN114591973B - 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记 - Google Patents

芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记 Download PDF

Info

Publication number
CN114591973B
CN114591973B CN202210394917.9A CN202210394917A CN114591973B CN 114591973 B CN114591973 B CN 114591973B CN 202210394917 A CN202210394917 A CN 202210394917A CN 114591973 B CN114591973 B CN 114591973B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sesame
gene
si4cll1
male sterile
male sterility
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210394917.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114591973A (zh
Inventor
苗红梅
张海洋
马琴
李春
段迎辉
琚铭
郭秋月
王慧丽
徐芳芳
曹恒春
张战有
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Original Assignee
Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences filed Critical Henan Sesame Research Center Henan Academy Of Agricultural Sciences
Priority to CN202210394917.9A priority Critical patent/CN114591973B/zh
Publication of CN114591973A publication Critical patent/CN114591973A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114591973B publication Critical patent/CN114591973B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个控制芝麻核雄性不育性状的基因Si4cll1及其对应的SNP标记SiSNPms‑3。该基因位于芝麻第3条染色体上，长度为2331bp；该基因属于隐性控制基因，控制表型为花粉败育型。本申请中，发明人以现有核雄性不育突变体ms1812材料为基础，研究并克隆了调控ms1812核雄性不育性状的目的基因Si4cll1，并开发了首个芝麻核雄性不育基因（SNP）标记。基于这些成果，可为芝麻等农作物核雄性不育性状调控发育机理研究奠定理论基础，同时也可为芝麻的分子辅助育种技术发展、芝麻杂交种新品种筛选及新品种培育提供材料基础，因此具有较好的科研价值和经济应用价值。

Description

芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记
技术领域
本发明属于芝麻分子遗传育种技术领域，具体涉及一个控制芝麻核雄性不育性状的基因Si4cll1及其对应的SNP标记SiSNPms-3。
背景技术
芝麻（Sesamum indicum L., 2n=26）是重要的优质特色油料作物，籽粒富含不饱和脂肪酸、蛋白、膳食纤维和抗氧化物质，广泛用于食品加工、营养保健和医药行业。早期研究表明，芝麻属于一种杂交优势较强的作物，由此为芝麻杂交育种工作奠定了良好理论基础。
基于杂交育种工作理论，1993年，我国芝麻科学家采用隐性核雄性不育系ms86-1，选育出了世界上首个芝麻杂交种豫芝9号(ms86-1 × Danbackggae) (屠礼传等，芝麻杂交种豫芝九好的选育与利用，1994，河南农业科学)。品种比较试验结果显示，与常规对照品种（豫芝4号）相比，豫芝9号的产量显著提升了29.52%，表现出超强的杂种优势。
近年来，为加快芝麻杂种优势利用和杂交种选育，多个雄性不育系被创制和发现。例如：李逸德等（Studies on induced mutation of sesame male sterility，In: IAEA(ed) Sesame improvement by induced mutations，IAEA-TECDOC-1195，2001）年采用60Cogama 射线诱变，从豫芝4号中创制出了6个雄性不育株；张海洋等采用EMS诱变技术，从豫芝11号中创制出了世界上首个光敏型核雄性不育株Sipsms304，并成功用于杂交种生产(Ultra-dense SNP genetic map construction and identification of SiDt genecontrolling the determinate growth habit in Sesamum indicum L.，Sci Rep，2016；中国专利：ZL201411814406.3)。
目前，我国共选育出郑杂芝H03、郑杂芝3号、中杂芝1号、中杂芝2号、皖杂芝1号、皖杂芝2号、皖芝6号及皖芝11号等系列芝麻杂交种(Zhang等，Traditional Breeding inSesame. In: Miao H, Zhang H, Kole C (ed) The Sesame Genome；Part of theCompendium of Plant Genomes book series，Springer，2021)，推动了我国芝麻杂交育种技术提升和产业发展。
多年来，尽管芝麻杂交育种工作取得了长足进步，但基因作为控制植物性状的根本性决定因素，目前尚未见到有关芝麻核雄性不育相关基因报道，因此，对相关不育基因的深入研究，可为芝麻育种工作的进一步改进奠定良好的理化基础和应用基础。
发明内容
本申请中，发明人以现有核雄性不育自然突变体ms1812材料为基础，利用已构建的芝麻杂交群体关联分析技术和芝麻基因组精细图，成功克隆获得了芝麻核雄性不育相关基因Si4cll1（4CL，4-coumarate:coenzyme A ligase，4-香豆酸:辅酶A连接酶；Si4cll1编码4CL-like类蛋白），并进一步开发设计了针对该基因和其对应SNP突变位点的SNP分子标记，以便为进一步的芝麻杂交种新品种培育甚至其他作物新品种培育奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
芝麻核雄性不育基因Si4cll1，该基因位于芝麻第3条染色体上，该基因长度为2331bp，包含7个外显子和6个内含子；
该基因属于隐性控制基因（相较于正常表型的等位基因，突变位点位于第1292位碱基上，1292位碱基突变后碱基为A），该基因控制表型为花粉败育型；
与野生型等位基因Si4CLL1所致表型相比，核雄性不育突变基因Si4cll1基因对芝麻核雄性不育突变性状的解释率为100%；
所述核雄性不育基因Si4cll1，其碱基序列如SEQ ID No.1所示， 具体如下：
CTAGAGCGTTTTCACCATGTTTTCTTTGATAAGCCTTCTCATAATCTTCCCCGAAGGTGATTTTGGGATAGCATCAACAAATTGCAGTACTCTCACTCTTTTGTAGCTGGCCACATTAGATGAAACATAGCCCATCATATCCTCTTCACTTTCTTTTGCTTTGTTGTTCATCACTACACATGCGGCTGGTATCTCTCCTGCTTCGTCGTCAGGTATCCTGCAAATAGTTGTCCTCTTTCCAGTTACTATCCCTTCATTATATACTCATTCCCTACTCCTAGTAGTTAATATAAAGAAGTATATAGATATTACCCCACAACCGCTGCATCTTCAACTGAAGGATGACTTAGAAGGATTGCCTCTAATTCAGCTGGAGCAACCTGTCACGGTACTTATAAATATCAACCTGTCATGTTCTTTGGACAATATTATTTATATTTATACAATGCAAATATAAGTGTGCTACAGCGAATAGCACCTGGAACCCTTTGTATTTGATCAACTCCTTGATTCGATCGACGATGAAAACATCTTCATCATCATCGATATAGCCAATGTCGCCTGTATGAAGCCACCCATCTTTGTCGATGGTGAGGGTCGTCTCATGCTCATTCTTGTAGTATCCTGAATGTTCTTGCATTAATATACAAAAAGTGCACATGAACATCACTAATATAGAAACAAAAGAAAAATGTGCATCATTCTTCGTTATCAAGGCCAACTTCACCTTTCATCACACATTGGCTCCTGACGCATATTTCTCCTGGAGTGTTCTTGGGAAGCGATTTACCCGACTCAGGATCGACAAACTTCACCTCCAAATTTGGAAGGATAAATCCCACTGAATTCTTCTTTGCAATCCCATGTCCCTTGTTTGGATCCCCATGAGTCAGGGTAATGCAGCTATGCTCAGTCATTCCATACGCCTAGAAGCATGAGTATATATATTAGAGAAAAGCTTCAAATATTTCTGGGACTAACTTTAGAAAGATCGTTGTGAATCACCTCTTGGACCTCAACCCCAGGGAACTTCTTCTCAAACTCATTAAGAATTTCAGGGGCGAGGGGGGCTGCAGCAGTCATGATGGACCTCAGCCTCAGCTTGCTGAGATCAAATTCATCCACTATCGGGTTCTTGACCAATCCTAATACAATGGGTGGGACGATAGGTGCAAATGTGACTTGGTGAGTGATCAGGGCTTTGAGAAATGCCCGGAGTTCATACCGACGCATCACCACCACTTTCCCCTTGTTTCTGATGGTGGCACAGCAGATTCCAGTCAGCCCGTATATGTGGAAAAACGGTATCAAGCCCAGTATAGTGATTTGTCCCACCAATTCTGGGCCTACGCTGAAGAGGCTGGAGCAGAGATTAGCCACCAAGTTCCGGTGAGTAAGCATCACTCCCTTCGATAGACCTGTCGTCCCTGATGTAAAGTATCACAACCCGAATATGACACCATCTTTGATACAGTAAAAGATCACAAATTCCTATAATTTAAATATCTTGATGTTACATATTGAACTTGACTCCCTAATAGCATTCACAGTATATTTTCTCTACCCTATAAATAAGTCTTCATGCTACTGCATATGTTCTATATATTTTTGTTTAAATTTGATCACCTGATGAGAAGGGGAGTGCGCATATATCAGTTTGCTGCACCTTATCATCAGTAGTATCAGCGCTGGCCTTGTCAGCTGCCTCAAGAAGTTCATCCCAGTATATAGTTCCCTCCACGCGGTCTTCGCCATGTATTATAACTGGCAATCCCAGATCTTTCACCTGGTGGAAAATCACCAAATCAATACTATGTAAGAACAATTATTCAGATGAGAAATAACCAAACTGTTGGCATAGAAAGGAACTGAAATTGCACATTTCGCTTATATAGTTAACTAATGTTTTACCTTATGATAGGTCGATCCATCAGTCACAACGAGCTTGGCATCAGCAGCCTCAGCTTGCTTCTTGATTTCTGATGCATGAGCACTCGGGTTTGCACCAGAGAAAATTCCTCCGGCTGCCATGATTCCAAGGGCAATGGTGGCGTAAACAGGCACATTTGGAAGGAGCACCACAACGACCCGGCCTTTCCTTAGCCCAAGTGACCTCAAGGCCCTGGAAAATCTCTTCACATCTCTGCTCACTTCCCCATAAGTACACCCTTTTCCGGTGACTGAATCCACAAACGCTACCTTGTCCTGATACAACTCCACGTTGGAAAGCACAAATTCCGGCAGCGTTACATCATCAGGAACCTGAACTGGTGGATATTTACTGCGGAAAATAATCTCTTCCTGCTTCAAGTTTTGAGCGTCGGTTCCCAT。
所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1的可育等位基因Si4CLL1，该基因所对应植株表型为正常型（或者说是花粉可育型），其碱基序列如SEQ ID No.2所示（1292位碱基为T），具体为：
CTAGAGCGTTTTCACCATGTTTTCTTTGATAAGCCTTCTCATAATCTTCCCCGAAGGTGATTTTGGGATAGCATCAACAAATTGCAGTACTCTCACTCTTTTGTAGCTGGCCACATTAGATGAAACATAGCCCATCATATCCTCTTCACTTTCTTTTGCTTTGTTGTTCATCACTACACATGCGGCTGGTATCTCTCCTGCTTCGTCGTCAGGTATCCTGCAAATAGTTGTCCTCTTTCCAGTTACTATCCCTTCATTATATACTCATTCCCTACTCCTAGTAGTTAATATAAAGAAGTATATAGATATTACCCCACAACCGCTGCATCTTCAACTGAAGGATGACTTAGAAGGATTGCCTCTAATTCAGCTGGAGCAACCTGTCACGGTACTTATAAATATCAACCTGTCATGTTCTTTGGACAATATTATTTATATTTATACAATGCAAATATAAGTGTGCTACAGCGAATAGCACCTGGAACCCTTTGTATTTGATCAACTCCTTGATTCGATCGACGATGAAAACATCTTCATCATCATCGATATAGCCAATGTCGCCTGTATGAAGCCACCCATCTTTGTCGATGGTGAGGGTCGTCTCATGCTCATTCTTGTAGTATCCTGAATGTTCTTGCATTAATATACAAAAAGTGCACATGAACATCACTAATATAGAAACAAAAGAAAAATGTGCATCATTCTTCGTTATCAAGGCCAACTTCACCTTTCATCACACATTGGCTCCTGACGCATATTTCTCCTGGAGTGTTCTTGGGAAGCGATTTACCCGACTCAGGATCGACAAACTTCACCTCCAAATTTGGAAGGATAAATCCCACTGAATTCTTCTTTGCAATCCCATGTCCCTTGTTTGGATCCCCATGAGTCAGGGTAATGCAGCTATGCTCAGTCATTCCATACGCCTAGAAGCATGAGTATATATATTAGAGAAAAGCTTCAAATATTTCTGGGACTAACTTTAGAAAGATCGTTGTGAATCACCTCTTGGACCTCAACCCCAGGGAACTTCTTCTCAAACTCATTAAGAATTTCAGGGGCGAGGGGGGCTGCAGCAGTCATGATGGACCTCAGCCTCAGCTTGCTGAGATCAAATTCATCCACTATCGGGTTCTTGACCAATCCTAATACAATGGGTGGGACGATAGGTGCAAATGTGACTTGGTGAGTGATCAGGGCTTTGAGAAATGCCCGGAGTTCATACCGACGCATCACCACCACTTTCCCCTTGTTTCTGATGGTGGCACAGCAGATTCCAGTCAGCCCGTATTTGTGGAAAAACGGTATCAAGCCCAGTATAGTGATTTGTCCCACCAATTCTGGGCCTACGCTGAAGAGGCTGGAGCAGAGATTAGCCACCAAGTTCCGGTGAGTAAGCATCACTCCCTTCGATAGACCTGTCGTCCCTGATGTAAAGTATCACAACCCGAATATGACACCATCTTTGATACAGTAAAAGATCACAAATTCCTATAATTTAAATATCTTGATGTTACATATTGAACTTGACTCCCTAATAGCATTCACAGTATATTTTCTCTACCCTATAAATAAGTCTTCATGCTACTGCATATGTTCTATATATTTTTGTTTAAATTTGATCACCTGATGAGAAGGGGAGTGCGCATATATCAGTTTGCTGCACCTTATCATCAGTAGTATCAGCGCTGGCCTTGTCAGCTGCCTCAAGAAGTTCATCCCAGTATATAGTTCCCTCCACGCGGTCTTCGCCATGTATTATAACTGGCAATCCCAGATCTTTCACCTGGTGGAAAATCACCAAATCAATACTATGTAAGAACAATTATTCAGATGAGAAATAACCAAACTGTTGGCATAGAAAGGAACTGAAATTGCACATTTCGCTTATATAGTTAACTAATGTTTTACCTTATGATAGGTCGATCCATCAGTCACAACGAGCTTGGCATCAGCAGCCTCAGCTTGCTTCTTGATTTCTGATGCATGAGCACTCGGGTTTGCACCAGAGAAAATTCCTCCGGCTGCCATGATTCCAAGGGCAATGGTGGCGTAAACAGGCACATTTGGAAGGAGCACCACAACGACCCGGCCTTTCCTTAGCCCAAGTGACCTCAAGGCCCTGGAAAATCTCTTCACATCTCTGCTCACTTCCCCATAAGTACACCCTTTTCCGGTGACTGAATCCACAAACGCTACCTTGTCCTGATACAACTCCACGTTGGAAAGCACAAATTCCGGCAGCGTTACATCATCAGGAACCTGAACTGGTGGATATTTACTGCGGAAAATAATCTCTTCCTGCTTCAAGTTTTGAGCGTCGGTTCCCAT。
所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1的等位基因Si4CLL1所对应的cDNA，碱基序列长度为1632bp，对应DNA序列中1292位碱基的突变位点，cDNA序列中第716位核苷酸为T；具体cDNA序列如下：
ATGGGAACCGACGCTCAAAACTTGAAGCAGGAAGAGATTATTTTCCGCAGTAAATATCCACCAGTTCAGGTTCCTGATGATGTAACGCTGCCGGAATTTGTGCTTTCCAACGTGGAGTTGTATCAGGACAAGGTAGCGTTTGTGGATTCAGTCACCGGAAAAGGGTGTACTTATGGGGAAGTGAGCAGAGATGTGAAGAGATTTTCCAGGGCCTTGAGGTCACTTGGGCTAAGGAAAGGCCGGGTCGTTGTGGTGCTCCTTCCAAATGTGCCTGTTTACGCCACCATTGCCCTTGGAATCATGGCAGCCGGAGGAATTTTCTCTGGTGCAAACCCGAGTGCTCATGCATCAGAAATCAAGAAGCAAGCTGAGGCTGCTGATGCCAAGCTCGTTGTGACTGATGGATCGACCTATCATAAGGTGAAAGATCTGGGATTGCCAGTTATAATACATGGCGAAGACCGCGTGGAGGGAACTATATACTGGGATGAACTTCTTGAGGCAGCTGACAAGGCCAGCGCTGATACTACTGATGATAAGGTGCAGCAAACTGATATATGCGCACTCCCCTTCTCATCAGGGACGACAGGTCTATCGAAGGGAGTGATGCTTACTCACCGGAACTTGGTGGCTAATCTCTGCTCCAGCCTCTTCAGCGTAGGCCCAGAATTGGTGGGACAAATCACTATACTGGGCTTGATACCGTTTTTCCACATATACGGGCTGACTGGAATCTGCTGTGCCACCATCAGAAACAAGGGGAAAGTGGTGGTGATGCGTCGGTATGAACTCCGGGCATTTCTCAAAGCCCTGATCACTCACCAAGTCACATTTGCACCTATCGTCCCACCCATTGTATTAGGATTGGTCAAGAACCCGATAGTGGATGAATTTGATCTCAGCAAGCTGAGGCTGAGGTCCATCATGACTGCTGCAGCCCCCCTCGCCCCTGAAATTCTTAATGAGTTTGAGAAGAAGTTCCCTGGGGTTGAGGTCCAAGAGGCGTATGGAATGACTGAGCATAGCTGCATTACCCTGACTCATGGGGATCCAAACAAGGGACATGGGATTGCAAAGAAGAATTCAGTGGGATTTATCCTTCCAAATTTGGAGGTGAAGTTTGTCGATCCTGAGTCGGGTAAATCGCTTCCCAAGAACACTCCAGGAGAAATATGCGTCAGGAGCCAATGTGTGATGAAAGGATACTACAAGAATGAGCATGAGACGACCCTCACCATCGACAAAGATGGGTGGCTTCATACAGGCGACATTGGCTATATCGATGATGATGAAGATGTTTTCATCGTCGATCGAATCAAGGAGTTGATCAAATACAAAGGGTTCCAGGTTGCTCCAGCTGAATTAGAGGCAATCCTTCTAAGTCATCCTTCAGTTGAAGATGCAGCGGTTGTGGGGATACCTGACGACGAAGCAGGAGAGATACCAGCCGCATGTGTAGTGATGAACAACAAAGCAAAAGAAAGTGAAGAGGATATGATGGGCTATGTTTCATCTAATGTGGCCAGCTACAAAAGAGTGAGAGTACTGCAATTTGTTGATGCTATCCCAAAATCACCTTCGGGGAAGATTATGAGAAGGCTTATCAAAGAAAACATGGTGAAAACGCTCTAG。
所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1的等位基因Si4CLL1的cDNA所编码Si4CLL1蛋白，编码543个氨基酸；
MGTDAQNLKQEEIIFRSKYPPVQVPDDVTLPEFVLSNVELYQDKVAFVDSVTGKGCTYGEVSRDVKRFSRALRSLGLRKGRVVVVLLPNVPVYATIALGIMAAGGIFSGANPSAHASEIKKQAEAADAKLVVTDGSTYHKVKDLGLPVIIHGEDRVEGTIYWDELLEAADKASADTTDDKVQQTDICALPFSSGTTGLSKGVMLTHRNLVANLCSSLFSVGPELVGQITILGLIPFFHIYGLTGICCATIRNKGKVVVMRRYELRAFLKALITHQVTFAPIVPPIVLGLVKNPIVDEFDLSKLRLRSIMTAAAPLAPEILNEFEKKFPGVEVQEAYGMTEHSCITLTHGDPNKGHGIAKKNSVGFILPNLEVKFVDPESGKSLPKNTPGEICVRSQCVMKGYYKNEHETTLTIDKDGWLHTGDIGYIDDDEDVFIVDRIKELIKYKGFQVAPAELEAILLSHPSVEDAAVVGIPDDEAGEIPAACVVMNNKAKESEEDMMGYVSSNVASYKRVRVLQFVDAIPKSPSGKIMRRLIKENMVKTL。
所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1所对应的cDNA，碱基序列长度为1632bp，对应DNA序列中1292位碱基的突变位点，cDNA序列中第716位核苷酸为A；具体cDNA序列如下：
ATGGGAACCGACGCTCAAAACTTGAAGCAGGAAGAGATTATTTTCCGCAGTAAATATCCACCAGTTCAGGTTCCTGATGATGTAACGCTGCCGGAATTTGTGCTTTCCAACGTGGAGTTGTATCAGGACAAGGTAGCGTTTGTGGATTCAGTCACCGGAAAAGGGTGTACTTATGGGGAAGTGAGCAGAGATGTGAAGAGATTTTCCAGGGCCTTGAGGTCACTTGGGCTAAGGAAAGGCCGGGTCGTTGTGGTGCTCCTTCCAAATGTGCCTGTTTACGCCACCATTGCCCTTGGAATCATGGCAGCCGGAGGAATTTTCTCTGGTGCAAACCCGAGTGCTCATGCATCAGAAATCAAGAAGCAAGCTGAGGCTGCTGATGCCAAGCTCGTTGTGACTGATGGATCGACCTATCATAAGGTGAAAGATCTGGGATTGCCAGTTATAATACATGGCGAAGACCGCGTGGAGGGAACTATATACTGGGATGAACTTCTTGAGGCAGCTGACAAGGCCAGCGCTGATACTACTGATGATAAGGTGCAGCAAACTGATATATGCGCACTCCCCTTCTCATCAGGGACGACAGGTCTATCGAAGGGAGTGATGCTTACTCACCGGAACTTGGTGGCTAATCTCTGCTCCAGCCTCTTCAGCGTAGGCCCAGAATTGGTGGGACAAATCACTATACTGGGCTTGATACCGTTTTTCCACAAATACGGGCTGACTGGAATCTGCTGTGCCACCATCAGAAACAAGGGGAAAGTGGTGGTGATGCGTCGGTATGAACTCCGGGCATTTCTCAAAGCCCTGATCACTCACCAAGTCACATTTGCACCTATCGTCCCACCCATTGTATTAGGATTGGTCAAGAACCCGATAGTGGATGAATTTGATCTCAGCAAGCTGAGGCTGAGGTCCATCATGACTGCTGCAGCCCCCCTCGCCCCTGAAATTCTTAATGAGTTTGAGAAGAAGTTCCCTGGGGTTGAGGTCCAAGAGGCGTATGGAATGACTGAGCATAGCTGCATTACCCTGACTCATGGGGATCCAAACAAGGGACATGGGATTGCAAAGAAGAATTCAGTGGGATTTATCCTTCCAAATTTGGAGGTGAAGTTTGTCGATCCTGAGTCGGGTAAATCGCTTCCCAAGAACACTCCAGGAGAAATATGCGTCAGGAGCCAATGTGTGATGAAAGGATACTACAAGAATGAGCATGAGACGACCCTCACCATCGACAAAGATGGGTGGCTTCATACAGGCGACATTGGCTATATCGATGATGATGAAGATGTTTTCATCGTCGATCGAATCAAGGAGTTGATCAAATACAAAGGGTTCCAGGTTGCTCCAGCTGAATTAGAGGCAATCCTTCTAAGTCATCCTTCAGTTGAAGATGCAGCGGTTGTGGGGATACCTGACGACGAAGCAGGAGAGATACCAGCCGCATGTGTAGTGATGAACAACAAAGCAAAAGAAAGTGAAGAGGATATGATGGGCTATGTTTCATCTAATGTGGCCAGCTACAAAAGAGTGAGAGTACTGCAATTTGTTGATGCTATCCCAAAATCACCTTCGGGGAAGATTATGAGAAGGCTTATCAAAGAAAACATGGTGAAAACGCTCTAG。
所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1所对应的cDNA所编码Si4cll1突变蛋白，编码543个氨基酸；
MGTDAQNLKQEEIIFRSKYPPVQVPDDVTLPEFVLSNVELYQDKVAFVDSVTGKGCTYGEVSRDVKRFSRALRSLGLRKGRVVVVLLPNVPVYATIALGIMAAGGIFSGANPSAHASEIKKQAEAADAKLVVTDGSTYHKVKDLGLPVIIHGEDRVEGTIYWDELLEAADKASADTTDDKVQQTDICALPFSSGTTGLSKGVMLTHRNLVANLCSSLFSVGPELVGQITILGLIPFFHKYGLTGICCATIRNKGKVVVMRRYELRAFLKALITHQVTFAPIVPPIVLGLVKNPIVDEFDLSKLRLRSIMTAAAPLAPEILNEFEKKFPGVEVQEAYGMTEHSCITLTHGDPNKGHGIAKKNSVGFILPNLEVKFVDPESGKSLPKNTPGEICVRSQCVMKGYYKNEHETTLTIDKDGWLHTGDIGYIDDDEDVFIVDRIKELIKYKGFQVAPAELEAILLSHPSVEDAAVVGIPDDEAGEIPAACVVMNNKAKESEEDMMGYVSSNVASYKRVRVLQFVDAIPKSPSGKIMRRLIKENMVKTL。
PCR扩增获得所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1或其等位基因Si4CLL1的PCR扩增用引物对，具体为：
正向引物DWF1 Primer F：5'- GGGGTGGGGTGAAAGACAA -3'；
反向引物DWF1 Primer R：5'- TCGCCAACACAAATGACAGG -3'。
利用所述PCR引物对制备获得芝麻核雄性不育基因Si4cll1或其等位基因Si4CLL1的PCR扩增方法，包括如下步骤：
（1）提取核雄性不育型种质（例如ms1812）ms1812或育性正常芝麻样本的基因组DNA；
（2）以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，利用PCR扩增用引物对进行PCR扩增；
以核雄性不育型种质DNA为模板时，PCR扩增所得为芝麻核雄性不育基因Si4cll1；
以育性正常芝麻样本的基因组DNA为模板时，PCR扩增所得为基因Si4CLL1。
芝麻核雄性不育基因Si4cll1在芝麻育种中应用，用于构建雄性不育种质材料。
对芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其等位基因Si4CLL1的SNP标记检测用引物对，所述SNP标记命名为SiSNPms-3，所述引物对用于HRM PCR检测用，所述引物对具体设计为：
HS4cll1-F序列：5'-GAGTTCATACCGACGCATCACC-3'；
HS4cll1-R序列：5' –TAATCTCTGCTCCAGCCTCTTCA-3'；
扩增产物长度为160bp；具体扩增产物序列如下：
GAGTTCATACCGACGCATCACCACCACTTTCCCCTTGTTTCTGATGGTGGCACAGCAGATTCCAGTCAGCCCGTATATGTGGAAAAACGGTATCAAGCCCAGTATAGTGATTTGTCCCACCAATTCTGGGCCTACGCTGAAGAGGCTGGAGCAGAGATTA。
所述SNP标记检测用引物对在芝麻分子育种中应用，用于检测判定雄性不育种质材料。
利用所述SNP标记检测用引物对的芝麻核雄性育性检测判定方法，包括如下步骤：
（1）提取待测芝麻样本的基因组DNA；
（2）以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，利用SNP标记检测用引物对，采用HRMPCR扩增方法进行PCR扩增；
（3）根据HRM PCR峰值结果与对照比对，判定样本为核雄性不育型或者正常的雄性可育基因型（即花粉可育基因型）。
需要说明的是，根据HRM PCR技术原理，首先需要制备标准曲线，即：PCR反应液中，模板DNA为3种不同基因型基因组DNA分别与等量的纯合阳性对照（例如：豫芝11号）DNA混合物，然后进行HRM PCR扩增以获得标准结果。再通过待检样品的PCR结果与PCR标准结果的3条曲线位置比对，以判定样本基因型属于纯合型还是杂合型。
由于本申请所涉及的SNP标记位点属于T/A突变，基于待检样品的PCR扩增结果与正常可育表型对照的HRM PCR峰值差异实际比对时：
若样本出现T/A峰线，表明样本含有SNP等位位点T、A，判定为杂合可育型；
若样本出现TT线（与对照一致），则表明样本不含有SNP位点，判定为纯合可育型；
若样本出现AA线，而混合样出现T/A峰线，则表明样本含有SNP位点A，判定为纯合核雄性不育型。
本申请中，发明人以现有核雄性不育突变体ms1812材料为基础，为确定核雄性不育突变体型ms1812具体材料ms-3和野生型（MS型）的相关表型差异（花粉发育与否）的基因序列差异，发明人试图克隆获得其控制芝麻核雄性不育性状的基因。基于此目的，发明人利用已构建的ms1812 (ms-3) × MS1812 (MS-3) 的F2群体，参考芝麻杂交群体关联分析技术和高质量芝麻基因组精细图信息，最终成功克隆了芝麻核雄性不育基因Si4cll1。
基于该基因的克隆和进一步研究，可为下一步探明芝麻小孢子生长发育调控机理、选育杂交种、甚至可为其他作物新品种培育奠定坚实基础。总体上，本发明创新点主要体现在以下几个方面：
（1）本发明对芝麻核雄性不育突变体ms1812开展了核雄性不育基因定位，首次克隆并提供了一个芝麻核雄性不育基因Si4cll1，并开发了其SNP标记SiSNPms-3，同时提供了一种鉴定种质资源是否含有该基因及标记位点的HRM PCR鉴定方法，该方法可以较为便捷和快速地确定待测样本是否为ms-3型不育系或杂种后代，为新品种培育提供参考；
（2）本发明所涉及的核雄性不育性状和基因对研究芝麻小孢子发育及调控机理具有重要意义，并为推进芝麻杂种优势利用及优异杂交种选育提供了重要技术和理论基础；因此，开展该基因和SNP标记的开发必将加快芝麻分子辅助育种研究进程；
（3）本发明所提供的芝麻核雄性不育基因Si4cll1及SNP标记SiSNPms-3的检测方法，技术成熟，检测结果稳定性好，对提高芝麻育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水平具有重要意义。
总体上，为加快芝麻核雄性不育性状遗传机理研究进程和为芝麻杂交育种工作奠定良好理论基础，申请人以现有雄性不育突变体ms1812材料为基础，开展了雄性不育性状相关表型、组织学和遗传解析，确定该雄性不育系突变性状受隐性单基因控制。进一步地，研究团队研究并克隆了调控ms1812核雄性不育性状的目的基因Si4cll1，并开发了首个芝麻核雄性不育基因（SNP）标记。基于这些成果，可为芝麻等农作物核雄性不育性状调控发育机理研究奠定理论基础，同时也可为芝麻的分子辅助育种技术发展、芝麻杂交种新品种筛选及新品种培育提供材料基础，因此具有较好的科研价值和经济应用价值。
附图说明
图1为雄性不育突变体ms1812和野生型表型比较；其中：
a:ms1812 (右)与野生型（左）花朵；
b:ms1812 (右)与野生型（左）已开放花朵的花药；
c: ms1812 (右)与野生型（左）花蕾；
d: ms1812 (右)与野生型（左）花蕾的花药；
e:野生型MS1812花粉粒的Alexander染色结果；
f: 不育系ms1812的花药Alexander染色结果，没有看到花粉粒；
图a-d中标尺单位为1 cm，e、f标尺单位为50 μm；
图2为芝麻雄性不育基因关联分析结果；其中113,436个SNPs和InDels分布于13条染色体上，用于雄性不育性状关联分析；彩色视图下，红线为显著性豫芝（–log10 P值= 6），只有一个SNP（绿色点）位于阈值线以上，与表型紧密关联；
图3为雄性不育基因Si4cll1及等位基因Si4CLL1结构比较；彩色视图下，蓝框为基因外显子，黑色横线为基因内含子，红色标记的目标SNP位点A1292 由T1292突变而来，红色标记的氨基酸Lys239由Ile239突变而来；
图4为本发明的芝麻雄性不育基因SNP标记SiSNPms-3的引物对在不同基因型样本中的HRM PCR结果；彩色视图下，图中绿色线为杂合T/A型（可育）；蓝色线为纯合TT型（可育）；红色线为纯合AA型（可育）；
图5为本发明的芝麻雄性不育基因SNP标记SiSNPms-3的引物对在部分样本中的HRM PCR结果；图中包含20个样本，彩色视图下：
绿色带包括：20YX42、20YX60、20YX224、20YX10、20YX331和 20YX3656等6个杂合可育株样本（T/A，花粉可育）；
红色带包括：20YX161、20YX230、 20YX206、20YX220、20YX237、20YX39和20YX93等7个纯合可育株样本（TT，花粉可育）；
蓝色带包括：20YX163、20YX165、20YX186、20YX172、20YX12、20YX160、20YX176等7个纯合不育株样本（AA，花粉不育）。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
现有技术中，芝麻品种郑芝98N09是一种我国的芝麻推广品种和芝麻育种优异亲本材料（2004年通过中国国家审定）；本申请中所采用的芝麻核雄性不育突变体ms1812材料，是由河南省农业科学院芝麻研究中心2018年从郑芝98N09群体中偶然发现的突变体。其主要生理特征为：花粉败育，自交不能正常结实；每叶腋3花，单杆，蒴果四棱，白粒。
下述实施例中所涉及的芝麻资源ms86-1（主要特征为：花粉败育，每叶腋三花，单杆，姊妹交后代可结实，蒴果四棱，白粒），则来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库；
实施例中所涉及的郑芝98N09、豫芝11等其他种质资源，也均来自于河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库。
上述种质材料均可从河南省农业科学院芝麻研究中心种质资源库这一公开渠道或者其他种质资源库等渠道公开获得。
实施例
如前所述，在获得核雄性不育突变体ms1812材料基础上，基于其特定表型差异（其中核雄性不育突变体ms1812和花粉正常型MS1812 (MS-3)的表型性状对比如图1所示），为确定其对应的芝麻核雄性不育性状控制基因，发明人对该基因进行了详细的定位分析，具体过程简要介绍如下。
一、核雄性不育性状遗传背景分析
2018-2019年，发明人首先选用核雄性不育突变体ms1812（ms-3）（ms-3为具体材料编号，不具有特殊含义）与MS1812 (MS-3)、豫芝11号(MS)等花粉可育正常型的单株进行组合配置杂交（配置情况如下表1），并对F1后代进行花粉育性性状调查统计。
具体统计结果如下表1所示。
表1，芝麻种质材料配置组合情况及雄性不育性状表型统计结果
χ2 (0.05, 1) = 3.84。
对上表结果进行分析，可以看出：
ms1812 (ms-3) 与豫芝11号(MS)的 F1均表现为花粉可育；
ms1812 (ms-3)与 MS1812 (MS-3)姊妹交，全部F1 单株均为可育，且F2 群体出现了3 (可育，wt):1 (不育，ms-3)的比例（P> 0.05）；
同时，ms1812 (ms-3) 与Ms1812 (Ms-3)姊妹交，F1 中可育与不育的比例为1: 1。
上述结果表明：突变型与野生型性状的分离比均符合预期，表明该突变性状受1对隐性核基因控制。
二、芝麻雄性不育型与正常型亲本的F2测序群体
基于上述结果，发明人进一步开展了雄性不育突变体ms1812 (不育，ms-3) 和MS1812 (可育，MS-3)的F2群体的构建。
最终，所构建F2群体的数量＞1900个株系。
取上述F2群体单株幼嫩叶片保存备用，并收获其F2-3种子，进一步采用营养钵点播，种植于三亚基地，以用于表型调查。
三、芝麻雄性不育相关基因Si4cll1定位
（1）在上述工作基础上，发明人在盛花期，从F2群体中随机选取100个单株编号，对其F2-3株系及2个亲本进行花粉育性调查和统计，并结合育性类型，判定F2单株基因型差异类型。
（2）从上述鉴定样本中，随机挑选纯合不育和纯合可育的F2单株，共43株。进一步从超低温冰箱中将提前采集的所对应的43个F2单株和2个亲本单株的幼嫩叶片取出，参照魏利斌等（芝麻DNA和RNA同步提取方法，分子植物育种，2008）中的改良CTAB法，提取各植株DNA，采用Illumina测序方法对45份材料进行基因组重测序，测序覆盖度≥30×。
（3）参考豫芝11号基因组数据（Zhang et al. Ultra-dense SNP genetic mapconstruction and identification of SiDt gene controlling the determinategrowth habit in Sesamum indicum L，2016，Science Reports；Zhao et al.Identification of sesame (Sesamum indicum L.) chromosomes using the BAC‐FISHsystem, 2018, Plant Biology），选用BWA（Burrows- Wheeler Aligner）软件将各株系的测序数据进行比对拼接。
结合上述F2群体亲本及43个F2单株基因组重测序数据，采用Tassele 5.0软件，确定与芝麻雄性不育性状紧密关联的变体P值，结果参见图2。
结果显示，与目标性状紧密连锁的最小P值变体位点位于第3染色体。
进一步对该最小P值变体位点上下游200kb的变体进行统计分析。分析发现：此区间内只有一个SNP位点C3_1050564058（图2中彩色视图下的绿点）的P值<1E-6，对表型解释率R2>5。具体结果如下表2所示。
表2 ，与雄性不育性状显著关联的变体位点信息统计（P<1E-6）
。
基于上述结果，随后用ms1812 (ms-3) ×MS1812 (MS-3)群体样本对上述SNP位点继续进行验证，结果显示，C3_1050564058位点与雄性不育性状紧密连锁。
实施例2
在实施例1定位基础上，发明人进一步对所定位的芝麻雄性不育基因进行了克隆和测序分析，具体过程简要介绍如下。
根据上述实施例1中获得的变体位点，利用豫芝11号基因组数据，分析确定了C3_10505640位点为目标SNP位点，将其所对应基因Sindi_0676800确定为目的基因。初步序列分析发现，该基因在芝麻基因组（豫芝11号）被注释为Si4CLL1基因。
随后，根据已有基因组数据，利用Primer premier 5.0软件设计了PCR扩增用引物对，以便扩增获得该核雄性不育基因Si4cll1或其等位基因Si4CLL1。
所设计的引物具体序列为：
正向引物DWF1 Primer F：5'- GGGGTGGGGTGAAAGACAA -3'；
反向引物DWF1 Primer R：5'- TCGCCAACACAAATGACAGG -3'。
利用上述所设计PCR引物进行PCR扩增，以制备获得芝麻核雄性不育基因Si4cll1或其等位基因Si4CLL1，具体操作参考如下。
首先，提取雄性不育型种质ms1812或育性正常芝麻样本的DNA，以此为模板（提取方式参考实施例1）
随后，PCR反应体系参考设计如下：
DNA，1µL；
dNTP Mix，(10mM each)0.4 µL；
2×Phanta Max Buffer，10µL；
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，0.4µL；
EvaGreen，1µL；
F-primer，0.4µL；
R-primer，0.4µL；
ddH2O，6.4µL；
在PTC-100 (MJ research公司产品)热循环仪上进行PCR扩增，反应程序参考设计为：94℃预变性3分钟；之后94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸1分钟，循环30次；最后72℃延伸5分钟；扩增产物4℃保存备用，或者直接进行电泳检测。
最后，对PCR扩增产物进行电泳检测和回收、纯化后，进行测序（委托天津基因芯片生物公司完成相关测序工作）。
结果显示，花粉可育正常表型的Si4CLL1基因序列全长序列为2331bp，共包含7个外显子和6个内含子，序列如SEQ ID No. 2所示；
而核雄性不育的突变材料中突变后等位基因Si4cll1基因在1292位碱基处发生了突变，由正常的T突变为A，具体序列如SEQ ID No.1所示。
将雄性不育基因Si4cll1及其正常表型的等位基因Si4CLL1进行序列比对，示意图如图3所示。对比分析可以看出：
在雄性不育型和正常型种质基因组中，Si4cll1和等位基因Si4CLL1序列的差异仅在于基因序列第1292位碱基是否发生了T/A突变；当第1292位的碱基T突变为了碱基A，最终导致编码蛋白的第239个氨基酸序列由异亮氨酸Ile (I)突变为了赖氨酸Lys(T) ，最终导致花粉育性类型则由正常可育型突变为不育型。
实施例3
为进一步确认Si4cll1基因即是调控芝麻核雄性不育表型的基因，基于实施例2序列比对结果，将所对应的SNP标记命名为SiSNPms-3，进一步基于HRM PCR技术，发明人设计了检测用引物对，并结合3种基因型样本和后代株系表型数据对相关结果进行了验证。具体过程简要介绍如下。
首先，基于序列差异位点，针对SNP标记SiSNPms-3所设计的检测用引物对具体如下：
HS4cll1-F序列：5' GAGTTCATACCGACGCATCACC 3'；
HS4cll1-R序列：5' TAATCTCTGCTCCAGCCTCTTCA 3'。
基于HRM PCR技术原理，具体检测并判定芝麻核雄性发育表型时，具体操作参考如下：
（1）提取待测芝麻样本的基因组DNA（参考实施例1，采用改良CTAB法）；
（2）以步骤（1）中所提取的基因组DNA为模板，采用HRM PCR扩增方法进行PCR扩增。
PCR扩增时，20 µL反应体系参考设置如下：
模板DNA (50ng/µL)，1.0µL；
2×Phanta Max Buffer，10µL；
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，0.4µL；
dNTP Mix，0.4µL；
Forward Primer (10µM)，0.4µL；
Reverse Primer (10µM)，0.4µL；
EvaGreen 1μL
加入超纯水至20µL。
HRM PCR反应在Roche 480 PCR热循环仪（罗氏，德国）上进行。普通PCR反应程序为：95°C，5min ；95°C、10s， 63°C、10s，72°C、10s，40个循环。HRM的反应程序为：95°C、1min，40°C 、1min，65°C 、1s。需要说明的是，本发明的SNP标记位点属于T/A突变。根据HRM PCR设计原理，首先需要制备标准曲线，即：PCR反应液中，模板DNA为3种不同基因型基因组DNA（采用F2单株的不同基因型基因组DNA）分别与等量的纯合阳性对照（豫芝11号）DNA混合物，然后进行HRM PCR扩增以获得标准结果。
标准结果如图4所示。
（3）根据待测样本与标准对照结果的HRM PCR峰值差异与否，判定样本的SiSNPms- 3标记位点属于纯合型还是杂合型；即，通过与PCR标准结果的3条曲线位置比对，以判定样本基因型：
若样本出现T/A峰线，则含有SNP等位位点T、A，判定为杂合可育型；
若样本出现TT线（与对照一致），则不含有SNP位点，判定为纯合可育型；
若样本PCR出现AA线，则含有SNP位点A，判定为纯合核雄性不育型。
具体验证时，从ms1812 (不育)与MS1812 (可育)的F2群体中随机挑选20株F2单株，采集上述单株的幼嫩叶片，基因组DNA提取（参考实施例1，采用改良CTAB法提取）。
进一步地，收获20株F2单株种子。适时条件下，将20个单株的种子按株行种植。盛花期进行花粉育性调查，每个株行调查20个单株。
根据F2-3表型调查结果，分别选择纯合可育、纯合不育、杂合可育的F2单株作为样本进行标记可靠度检测。
最终结果显示：1份杂合可育株样本表现为绿色T/A峰带（即，同时含有SNP等位位点T/A），属于杂合型；1份纯合可育株和1份纯合不育株样本分别表现为蓝色和红色带（即，含有纯合位点）。样本PCR鉴定结果与表型鉴定结果一致率为100%。表明该标记和检测方法准确可靠。
实施例4
在实施例3基础上，以鉴定未知样本是否为雄性不育型不育系材料为例，发明人进行了进一步的实验验证。具体过程简要介绍如下。
为快速鉴定出待鉴定材料是否为芝麻雄性不育型材料或其或杂种后代材料，首先从ms1812与豫芝11号的杂交F2后代中随机挑选样本100份种植，采集幼嫩叶片，低温保存。
收获F2种子后，适时播种，将F2单株的种子按株行种植，盛花期进行花粉育性调查，每个株行调查20个单株。
同时，从种质资源库中随机选取纯化后的种质样本100份，按行种植。采集幼嫩叶片，低温保存。盛花期进行花粉育性调查，每份种质调查20个单株。
对上述100个F2单株和100份芝麻种质代表株分别提取基因组DNA，利用实施例3中所设计的SNP引物对进行HRM PCR检测，从而评价SNP标记的可靠性。部分PCR结果如图5示。
图5中包含20个样本。结果表明（相关编号属于实验记录编号，并不具有特殊技术意义）：
绿色带包括：20YX42、20YX60、20YX224、20YX10、20YX331和 20YX3656等6个杂合可育株样本（T/A，花粉可育）；
红色带包括：20YX161、20YX230、 20YX206、20YX220、20YX237、20YX39和20YX93等7个纯合可育株样本（TT，花粉可育）；
蓝色带包括：20YX163、20YX165、20YX186、20YX172、20YX12、20YX160、20YX176等7个纯合不育株样本（AA，花粉不育）。
在检测的100份芝麻种质资源中，全部样本均出现绿色条带（TT型）。表型鉴定结果均为可育。因此，可以判定全部检测种质的基因型均为纯合可育型。
在检测的100个F2单株中，有52份样本为杂合可育型，26份样本出现TT条带，22份样本为AA条带。因此，可以判定F2单株中，纯合可育型、纯合不育型及杂合可育型的样本数量分别为26、22和52。表型调查结果显示，该实例标记检测的准确率为100%。结果进一步证实，本发明标记和检测方法准确可靠。
综上，我们可以认为该SiSNPms-3标记即为芝麻核雄性不育基因SNP位点标记，可以用于预测芝麻样本的育性类型及来源，用于芝麻分子标记辅助育种和芝麻杂交种新品种的选育。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院芝麻研究中心
<120> 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2331
<212> DNA
<213> Sesamum indicum
<400> 1
ctagagcgtt ttcaccatgt tttctttgat aagccttctc ataatcttcc ccgaaggtga 60
ttttgggata gcatcaacaa attgcagtac tctcactctt ttgtagctgg ccacattaga 120
tgaaacatag cccatcatat cctcttcact ttcttttgct ttgttgttca tcactacaca 180
tgcggctggt atctctcctg cttcgtcgtc aggtatcctg caaatagttg tcctctttcc 240
agttactatc ccttcattat atactcattc cctactccta gtagttaata taaagaagta 300
tatagatatt accccacaac cgctgcatct tcaactgaag gatgacttag aaggattgcc 360
tctaattcag ctggagcaac ctgtcacggt acttataaat atcaacctgt catgttcttt 420
ggacaatatt atttatattt atacaatgca aatataagtg tgctacagcg aatagcacct 480
ggaacccttt gtatttgatc aactccttga ttcgatcgac gatgaaaaca tcttcatcat 540
catcgatata gccaatgtcg cctgtatgaa gccacccatc tttgtcgatg gtgagggtcg 600
tctcatgctc attcttgtag tatcctgaat gttcttgcat taatatacaa aaagtgcaca 660
tgaacatcac taatatagaa acaaaagaaa aatgtgcatc attcttcgtt atcaaggcca 720
acttcacctt tcatcacaca ttggctcctg acgcatattt ctcctggagt gttcttggga 780
agcgatttac ccgactcagg atcgacaaac ttcacctcca aatttggaag gataaatccc 840
actgaattct tctttgcaat cccatgtccc ttgtttggat ccccatgagt cagggtaatg 900
cagctatgct cagtcattcc atacgcctag aagcatgagt atatatatta gagaaaagct 960
tcaaatattt ctgggactaa ctttagaaag atcgttgtga atcacctctt ggacctcaac 1020
cccagggaac ttcttctcaa actcattaag aatttcaggg gcgagggggg ctgcagcagt 1080
catgatggac ctcagcctca gcttgctgag atcaaattca tccactatcg ggttcttgac 1140
caatcctaat acaatgggtg ggacgatagg tgcaaatgtg acttggtgag tgatcagggc 1200
tttgagaaat gcccggagtt cataccgacg catcaccacc actttcccct tgtttctgat 1260
ggtggcacag cagattccag tcagcccgta tatgtggaaa aacggtatca agcccagtat 1320
agtgatttgt cccaccaatt ctgggcctac gctgaagagg ctggagcaga gattagccac 1380
caagttccgg tgagtaagca tcactccctt cgatagacct gtcgtccctg atgtaaagta 1440
tcacaacccg aatatgacac catctttgat acagtaaaag atcacaaatt cctataattt 1500
aaatatcttg atgttacata ttgaacttga ctccctaata gcattcacag tatattttct 1560
ctaccctata aataagtctt catgctactg catatgttct atatattttt gtttaaattt 1620
gatcacctga tgagaagggg agtgcgcata tatcagtttg ctgcacctta tcatcagtag 1680
tatcagcgct ggccttgtca gctgcctcaa gaagttcatc ccagtatata gttccctcca 1740
cgcggtcttc gccatgtatt ataactggca atcccagatc tttcacctgg tggaaaatca 1800
ccaaatcaat actatgtaag aacaattatt cagatgagaa ataaccaaac tgttggcata 1860
gaaaggaact gaaattgcac atttcgctta tatagttaac taatgtttta ccttatgata 1920
ggtcgatcca tcagtcacaa cgagcttggc atcagcagcc tcagcttgct tcttgatttc 1980
tgatgcatga gcactcgggt ttgcaccaga gaaaattcct ccggctgcca tgattccaag 2040
ggcaatggtg gcgtaaacag gcacatttgg aaggagcacc acaacgaccc ggcctttcct 2100
tagcccaagt gacctcaagg ccctggaaaa tctcttcaca tctctgctca cttccccata 2160
agtacaccct tttccggtga ctgaatccac aaacgctacc ttgtcctgat acaactccac 2220
gttggaaagc acaaattccg gcagcgttac atcatcagga acctgaactg gtggatattt 2280
actgcggaaa ataatctctt cctgcttcaa gttttgagcg tcggttccca t 2331
<210> 2
<211> 2331
<212> DNA
<213> Sesamum indicum
<400> 2
ctagagcgtt ttcaccatgt tttctttgat aagccttctc ataatcttcc ccgaaggtga 60
ttttgggata gcatcaacaa attgcagtac tctcactctt ttgtagctgg ccacattaga 120
tgaaacatag cccatcatat cctcttcact ttcttttgct ttgttgttca tcactacaca 180
tgcggctggt atctctcctg cttcgtcgtc aggtatcctg caaatagttg tcctctttcc 240
agttactatc ccttcattat atactcattc cctactccta gtagttaata taaagaagta 300
tatagatatt accccacaac cgctgcatct tcaactgaag gatgacttag aaggattgcc 360
tctaattcag ctggagcaac ctgtcacggt acttataaat atcaacctgt catgttcttt 420
ggacaatatt atttatattt atacaatgca aatataagtg tgctacagcg aatagcacct 480
ggaacccttt gtatttgatc aactccttga ttcgatcgac gatgaaaaca tcttcatcat 540
catcgatata gccaatgtcg cctgtatgaa gccacccatc tttgtcgatg gtgagggtcg 600
tctcatgctc attcttgtag tatcctgaat gttcttgcat taatatacaa aaagtgcaca 660
tgaacatcac taatatagaa acaaaagaaa aatgtgcatc attcttcgtt atcaaggcca 720
acttcacctt tcatcacaca ttggctcctg acgcatattt ctcctggagt gttcttggga 780
agcgatttac ccgactcagg atcgacaaac ttcacctcca aatttggaag gataaatccc 840
actgaattct tctttgcaat cccatgtccc ttgtttggat ccccatgagt cagggtaatg 900
cagctatgct cagtcattcc atacgcctag aagcatgagt atatatatta gagaaaagct 960
tcaaatattt ctgggactaa ctttagaaag atcgttgtga atcacctctt ggacctcaac 1020
cccagggaac ttcttctcaa actcattaag aatttcaggg gcgagggggg ctgcagcagt 1080
catgatggac ctcagcctca gcttgctgag atcaaattca tccactatcg ggttcttgac 1140
caatcctaat acaatgggtg ggacgatagg tgcaaatgtg acttggtgag tgatcagggc 1200
tttgagaaat gcccggagtt cataccgacg catcaccacc actttcccct tgtttctgat 1260
ggtggcacag cagattccag tcagcccgta tttgtggaaa aacggtatca agcccagtat 1320
agtgatttgt cccaccaatt ctgggcctac gctgaagagg ctggagcaga gattagccac 1380
caagttccgg tgagtaagca tcactccctt cgatagacct gtcgtccctg atgtaaagta 1440
tcacaacccg aatatgacac catctttgat acagtaaaag atcacaaatt cctataattt 1500
aaatatcttg atgttacata ttgaacttga ctccctaata gcattcacag tatattttct 1560
ctaccctata aataagtctt catgctactg catatgttct atatattttt gtttaaattt 1620
gatcacctga tgagaagggg agtgcgcata tatcagtttg ctgcacctta tcatcagtag 1680
tatcagcgct ggccttgtca gctgcctcaa gaagttcatc ccagtatata gttccctcca 1740
cgcggtcttc gccatgtatt ataactggca atcccagatc tttcacctgg tggaaaatca 1800
ccaaatcaat actatgtaag aacaattatt cagatgagaa ataaccaaac tgttggcata 1860
gaaaggaact gaaattgcac atttcgctta tatagttaac taatgtttta ccttatgata 1920
ggtcgatcca tcagtcacaa cgagcttggc atcagcagcc tcagcttgct tcttgatttc 1980
tgatgcatga gcactcgggt ttgcaccaga gaaaattcct ccggctgcca tgattccaag 2040
ggcaatggtg gcgtaaacag gcacatttgg aaggagcacc acaacgaccc ggcctttcct 2100
tagcccaagt gacctcaagg ccctggaaaa tctcttcaca tctctgctca cttccccata 2160
agtacaccct tttccggtga ctgaatccac aaacgctacc ttgtcctgat acaactccac 2220
gttggaaagc acaaattccg gcagcgttac atcatcagga acctgaactg gtggatattt 2280
actgcggaaa ataatctctt cctgcttcaa gttttgagcg tcggttccca t 2331

Claims (7)

1.芝麻核雄性不育基因Si4cll1，其特征在于，该基因位于芝麻第3条染色体上，长度为2331bp；该基因属于隐性控制基因，控制表型为花粉败育型；其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1的可育等位基因Si4CLL1，其特征在于，该基因所对应植株表型为正常花粉可育型，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1所编码Si4cll1突变蛋白，其特征在于，编码543个氨基酸；
MGTDAQNLKQEEIIFRSKYPPVQVPDDVTLPEFVLSNVELYQDKVAFVDSVTGKGCTYGEVSRDVKRFSRALRSLGLRKGRVVVVLLPNVPVYATIALGIMAAGGIFSGANPSAHASEIKKQAEAADAKLVVTDGSTYHKVKDLGLPVIIHGEDRVEGTIYWDELLEAADKASADTTDDKVQQTDICALPFSSGTTGLSKGVMLTHRNLVANLCSSLFSVGPELVGQITILGLIPFFHKYGLTGICCATIRNKGKVVVMRRYELRAFLKALITHQVTFAPIVPPIVLGLVKNPIVDEFDLSKLRLRSIMTAAAPLAPEILNEFEKKFPGVEVQEAYGMTEHSCITLTHGDPNKGHGIAKKNSVGFILPNLEVKFVDPESGKSLPKNTPGEICVRSQCVMKGYYKNEHETTLTIDKDGWLHTGDIGYIDDDEDVFIVDRIKELIKYKGFQVAPAELEAILLSHPSVEDAAVVGIPDDEAGEIPAACVVMNNKAKESEEDMMGYVSSNVASYKRVRVLQFVDAIPKSPSGKIMRRLIKENMVKTL。
4.权利要求2所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1的等位基因Si4CLL1所编码Si4CLL1蛋白，其特征在于，编码543个氨基酸；
MGTDAQNLKQEEIIFRSKYPPVQVPDDVTLPEFVLSNVELYQDKVAFVDSVTGKGCTYGEVSRDVKRFSRALRSLGLRKGRVVVVLLPNVPVYATIALGIMAAGGIFSGANPSAHASEIKKQAEAADAKLVVTDGSTYHKVKDLGLPVIIHGEDRVEGTIYWDELLEAADKASADTTDDKVQQTDICALPFSSGTTGLSKGVMLTHRNLVANLCSSLFSVGPELVGQITILGLIPFFHIYGLTGICCATIRNKGKVVVMRRYELRAFLKALITHQVTFAPIVPPIVLGLVKNPIVDEFDLSKLRLRSIMTAAAPLAPEILNEFEKKFPGVEVQEAYGMTEHSCITLTHGDPNKGHGIAKKNSVGFILPNLEVKFVDPESGKSLPKNTPGEICVRSQCVMKGYYKNEHETTLTIDKDGWLHTGDIGYIDDDEDVFIVDRIKELIKYKGFQVAPAELEAILLSHPSVEDAAVVGIPDDEAGEIPAACVVMNNKAKESEEDMMGYVSSNVASYKRVRVLQFVDAIPKSPSGKIMRRLIKENMVKTL。
5.权利要求1所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1在芝麻育种中应用，其特征在于，用于构建芝麻雄性不育种质材料。
6.对权利要求1或2所述芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其可育等位基因Si4CLL1的SNP标记检测用引物对，其特征在于，所述SNP标记命名为SiSNPms-3，所述引物对用于HRM PCR检测用，所述引物对具体设计为：
HS4cll1-F序列：5'-GAGTTCATACCGACGCATCACC-3'；
HS4cll1-R序列：5' –TAATCTCTGCTCCAGCCTCTTCA-3'。
7.权利要求6所述检测用引物对在芝麻分子育种中应用，其特征在于，用于检测判定雄性不育种质材料。
CN202210394917.9A 2022-04-15 2022-04-15 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记 Active CN114591973B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210394917.9A CN114591973B (zh) 2022-04-15 2022-04-15 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210394917.9A CN114591973B (zh) 2022-04-15 2022-04-15 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114591973A CN114591973A (zh) 2022-06-07
CN114591973B true CN114591973B (zh) 2024-02-09

Family

ID=81811764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210394917.9A Active CN114591973B (zh) 2022-04-15 2022-04-15 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114591973B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103993011A (zh) * 2014-03-24 2014-08-20 中国农业科学院油料作物研究所 芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用
CN105695454A (zh) * 2016-01-13 2016-06-22 河南省农业科学院芝麻研究中心 一种鉴定芝麻细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法
WO2017092110A1 (zh) * 2015-12-03 2017-06-08 河南省农业科学院芝麻研究中心 芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP标记
CN110117598A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 中国农业科学院油料作物研究所 芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用
CN113584207A (zh) * 2021-08-05 2021-11-02 河南省农业科学院芝麻研究中心 芝麻育性分子标记、引物、试剂盒、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103993011A (zh) * 2014-03-24 2014-08-20 中国农业科学院油料作物研究所 芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用
WO2017092110A1 (zh) * 2015-12-03 2017-06-08 河南省农业科学院芝麻研究中心 芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP标记
CN105695454A (zh) * 2016-01-13 2016-06-22 河南省农业科学院芝麻研究中心 一种鉴定芝麻细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法
CN110117598A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 中国农业科学院油料作物研究所 芝麻SiKAS1基因在植物雄性不育中的应用
CN113584207A (zh) * 2021-08-05 2021-11-02 河南省农业科学院芝麻研究中心 芝麻育性分子标记、引物、试剂盒、应用、高木酚素芝麻新品种选育方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cytological characterization and molecular mapping of a novel recessive genic male sterility in sesame (Sesamum indicum L.)";Hongyan Liu et al.;《Plos One》;第13卷(第9期);第1-13页 *
"芝麻隐性核不育保持系选育与基因型分析";汪强等;《中国油料作物学报》;第38卷(第1期);第34-39页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114591973A (zh) 2022-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10301687B2 (en) Sidt 1 gene controlling determinate growth habit in sesame and SNP molecular marker thereof
US20210095308A1 (en) A method for creating male sterile line of tomato through genome editing and application thereof
WO2024141119A1 (zh) 芝麻高油酸基因SiFAD2-1及其SNP标记
CN113005221B (zh) 甜瓜抗落蒂基因CmAL3紧密连锁的分子标记SNP-392及其应用
CN113736910A (zh) 花生单株荚果数主效QTL位点qPN7的连锁分子标记及其应用
WO2024139283A1 (zh) 辣椒细胞质雄性不育育性恢复分子标记、分型引物及其应用
CN111088258B (zh) 一种水稻光温敏核雄性不育基因tms3650及其分子标记和应用
JP4892648B1 (ja) 新品種、植物品種の鑑別方法、及びイネ個体を早生化する方法
CN114591973B (zh) 芝麻核雄性不育基因Si4cll1及其SNP标记
CN110004248B (zh) 芝麻节间长度基因Sidwf1及其SNP标记
CN111100869B (zh) 一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用
KR101961855B1 (ko) 식물의 화분 발달에 관여하는 phd 유전자 및 이를 이용한 유전자적 웅성불임성의 판별방법
CN117778616B (zh) 小麦粒重相关基因TaSINA101分子标记及应用
CN116904638B (zh) 与藜麦早雌性状连锁的kasp标记及应用
CN113897455B (zh) 与番茄雄性不育突变位点ms-24及其等位突变位点共分离的分子标记及其应用
CN117004616A (zh) 抗枯萎病基因ScaDIR40及其应用
CN115976055B (zh) 一种玉米矮秆基因及其分子标记
WO2024198707A1 (zh) 一个调控芝麻株型性状的基因SiPT1及其检测引物对
US11519041B2 (en) Sidwf1 gene controlling internode length in sesame
CN107466844B (zh) 一种提高萝卜杂交结实率的方法
Lee et al. High-resolution bin maps provide insights for QTL mapping of yield-related traits with Milyang23/Gihobyeo recombinant inbred lines
CN117737081A (zh) 小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用
CN117004617A (zh) 芝麻落粒性状调控基因Sihec3及其应用
CN116356066A (zh) 一种检测小麦TaPpd-2D基因启动子区多态性的引物、方法及应用
CN118755877A (zh) 一种花生种子大小相关分子标记AhARF2-2SV及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant