CN117737081A

CN117737081A - 小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用

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Publication number: CN117737081A
Application number: CN202311771031.2A
Authority: CN
Inventors: 张大乐; 张琳; 程瑞如; 邹梦雯; 高安礼; 李锁平
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2023-12-21
Filing date: 2023-12-21
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本申请属于小麦遗传育种技术领域，具体涉及一个小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用。该基因用于小麦穗形调整；所述小麦穗形为小穗数和穗长表型性状；应用时，含有小麦穗形相关基因TaSP1的小麦穗长变短、小穗数数量变少；所述小麦穗形相关基因TaSP1，其基因序列如SEQ ID No.1所示。本申请中，发明人基于前期利用EMS诱导的突变体库，结合相关遗传群体构建，获得了一个与小麦穗形调控关联的候选基因TaSP1。研究结果表明，TaSP1基因与小麦穗形调控紧密相关，并研究发现TaSP1基因的优异单倍型与小麦的小穗数和穗长呈显著正相关，可为小麦穗部性状改良、培育高产小麦新品种奠定一定技术基础。

Description

小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用

技术领域

本申请属于小麦遗传育种技术领域，具体涉及一个小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用。

背景技术

小麦（Triticum aestivumL.，2n = 6x = 42，AABBDD）作为全球主粮作物之一，其产量的稳步提升对于基本食物保障、以及相关食品工业的稳定发展具有十分重要的意义。

在耕种面积有限前提下，小麦单产的稳定提升是解决小麦产量的重要技术途径之一，而小麦单位产量作为一种复杂的农艺性状，主要决定于千粒重(TGW)、穗粒数(GNS)和亩穗数的农艺性状数据。其中千粒重(TGW)、穗粒数(GNS)、小穗数(SN)、穗长(SL)、每穗粒重(GWS)和籽粒大小(GS)等农艺性状均与小麦穗部性状发育相关。因此，对于小麦穗形相关基因的深入研究对小麦穗部性状遗传改良具有重要意义。

现有研究中，通过对相关的小麦穗发育相关基因的克隆和功能分析，以及通过对小麦花序发育调控网络的研究，已为小麦穗部性状遗传改良奠定了初步的技术理论基础。相关研究表明，根据小麦穗发育调控阶段差异，可将小麦穗发育调控相关基因分为三个阶段，包括：第一阶段的与穗分生组织起始和发育相关的必需基因如春化基因(Vernalization)、光周期基因、开花基因和驯化Q基因等；第二阶段的调控小穗分生组织发育的基因如AP2基因家族中的WFZ以及SPL基因家族中的TaSPL14、TaAGL6、WAPO1等；第三阶段的调控小花分生组织发育的基因如GNI1、SQUAMOSA、SVP等，这一阶段的调控基因主要与小麦生殖早期的末端小穗形成和茎长生长等相关。另外，部分与小麦穗部发育性状相关的新基因也在不断发现和深入研究当中。

总之，通过对与小麦穗部发育相关基因的深入研究，对于提升小麦单产，培育高产小麦新品种具有十分重要的技术意义。

发明内容

本申请目的在于提供一个与小麦穗形调控相关的基因TaSP1，从而可为小麦新品种培育、以及小麦单产的稳定提升奠定一定技术理论基础。

本申请所采取的技术方案简述如下。

小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用，用于小麦穗形调整；所述小麦穗形，具体为小穗数和穗长表型性状；含有所述小麦穗形相关基因TaSP1的小麦穗长变短、小穗数数量变少；

所述小麦穗形相关基因TaSP1，其基因序列如SEQ ID No.1所示，对应编码的蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

检测所述小麦穗形相关基因TaSP1用dCAPS标记MIS48109，所述dCAPS标记MIS48109为一对PCR扩增用引物对，具体引物对设计如下：

MIS48109-P1：5’-ACGGGAAGAACCTGGAGGACGCG-3’，

MIS48109-P2：5’-CAGCTCCGCCCGGAGCAT-3’；

利用所述dCAPS标记MIS48109进行PCR检测时（对扩增产物利用限制性内切酶MluI进行酶切），小麦穗形正常品种与小麦穗形畸形品种中对应的TaSP1基因间在1138bp位点处存在一个C/T突变；即：

小麦穗形正常品种的精氨酸CGG突变为色氨酸密码子TGG后，对应的正常穗形表型突变为畸形穗形。

正常小麦穗形表型分型用特异性标记GB-2R，所述特异性标记GB-2R为一对PCR扩增用引物对，具体引物序列设计如下：

GB-2R-P1：5’-GCGCCGCTGCCGTCCGCCGTCGA-3’，

GB-2R-P2: 5’-ATGGGAACGTAGTAGTAAATGGAG-3’；

应用时，正常小麦穗形表型的小麦品种中Tasp1基因在1449bp处存在一个C/G差异，利用上述引物对进行PCR扩增后（对扩增产物进行SalI酶切），可检测区分CC单倍型和GG单倍型小麦品种；其中CC单倍型具有更短的穗长、更少的小穗数的表型性状；

所述正常小麦穗形表型的小麦品种中Tasp1基因，与SEQ ID No.1所示小麦穗形相关基因TaSP1相比，其1138bp位点处为C。

本申请中，发明人基于前期利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导的突变体库（具体为EMS诱导周麦32获得的穗形突变体），结合相关遗传群体构建（周麦32穗形突变体与百农207进行杂交），利用目标性状混合群体的全基因组重测序技术、以及通过对目标性状基因的定位，图位克隆获得了一个与小麦穗形调控关联的候选基因TaSP1。

进一步对TaSP1基因在小麦中的组织特异性分析和时空表达分析，结果表明，TaSP1基因与小麦穗形调控紧密相关，并且基于该基因的特异性标记开发，发现了TaSP1基因的优异单倍型，该单倍型与小麦的小穗数和穗长呈显著正相关，利用该基因的优异单倍型可为小麦穗部性状改良、培育高产小麦新品种奠定一定技术基础。

附图说明

图1为正常穗形、畸形穗形突变体ZM1160及杂交后代典型穗形表型对比图；图中：AA为纯合基因型的正常穗形，aa为纯合基因型的畸形穗形，Aa为杂合基因型的正常穗形；

图2为基于SNP阵列分析的与目标性状相关联的多态性SNP的分布区域结果；

图3为遗传作图时初步将目标基因Tasp1位在分子标记YZU0852和MIS46239之间示意图；

图4为小麦穗形相关基因Tasp1的精细定位过程示意图；

图5为TaSP1基因在小麦不同组织中的相对表达量；

图6为TaSP1基因在小麦不同发育时期（不同穗长）中的相对表达量情况；

图7为TaSP1基因的结构分析示意图；

图8为周麦32和突变体ZM1160中Tasp1基因的DNA序列比对（圆点代表相同碱基，方框为突变碱基）；

图9为利用标记MIS48109在部分F2单株中的验证结果；图中：P1：畸形突变体亲本，基因型为aa；P2：正常穗形亲本，基因型为AA；

1-7：基因型为AA型，穗形为正常类型；8-15：基因型为Aa型，穗形为正常类型；16-23：基因型为aa型，穗形为畸形类型；

图10为部分小麦品种中Tasp1基因序列比对分析结果；

图11为新乡和开封实验基地的两个单倍型群体的穗长和小穗数性状统计学结果；其中，a、c为穗长性状统计结果；b、d为小穗数性状统计结果；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

小麦材料：

周麦32，现有技术和农业栽培中常见和常用的小麦栽培品种，前期研究工作中，发明人对其进行了EMS诱导处理（0.8%的EMS对其种子进行浸泡诱变处理20小时后，田间播种，经自交2代筛选），筛选获得了一个：穗长缩短、穗轴弯曲、小穗紧缩的突变体并将其命名为：ZM1160；

利用穗形突变体ZM1160，发明人进一步将其与小麦品种百农207进行了杂交，构建了F2作图群体，同时随机挑选小麦育成品种共412份和259份分别种植在新乡和开封市小麦育种场实验田内；

下述实施例中所涉及的新乡的412个小麦品种和开封的259份小麦品种，均为现有技术中可从公开渠道（例如种质库）获得的小麦种质资源，不再赘述其来源情况；

下述实施例中所涉及的相关引物合成及测序工作，委托河南尚亚生物技术有限公司提供完成；

主要实验试剂：

反转录试剂盒FastKing RT kit 、RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant PlusKit、PCR扩增用试剂盒，TIANGEN公司产品；

QPCR扩增用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，Vazyme公司产品（南京）；

主要仪器：

T100™热循环器，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA。

实施例1

针对“穗形突变体ZM1160”，为明确其对应穗形突变表型的调控基因，发明人对于该调控基因进行了精细定位，相关实验情况简介如下。

（一）田间表型调查统计

将穗形突变体ZM1160 × 百农207的F2代及亲本（穗形突变体ZM1160、百农207）种子种植于开封市小麦育种场内，F2：3家系，每个家系种30-35粒，温室培养（24℃、光照18h，20℃、黑暗6h），观察并统计各材料小麦穗形表型情况。

典型的正常小麦穗形的表型与突变后畸形穗形表型对比如图1所示。实验结果表明，穗形突变体ZM1160 × 百农207的F1杂交种的穗形与百农207的穗形表型一致，均为正常表型。

基于192株的F2群体的每个单株的穗形统计结果表明：147株和43株分别与百农207和ZM1160的穗形一致，拟合比例为3:1 (χ²= 0.327，P>0.05)；

根据对应的每个F2:3家系的表型统计结果表明：纯合正常型57个，杂合分离型90个，纯合畸形型43个，分离比符合1:2:1 (χ²= 1.179, P＜0.05)。

这一统计结果表明：穗形突变体ZM1160的穗形畸形表型应当是由一个隐性基因控制的，其对应的畸形穗性表型属于一种隐性性状，为便于描述，将该隐性基因命名为：Tasp1基因。

（二）Tasp1基因的定位

在上述初步明确Tasp1为一隐性基因基础上，利用Axiom®wheat 660K SNP阵列(Thermo)和重测序技术，发明人对该基因进行初步定位研究，相关情况简介如下。

、基于SNP阵列的初定位

首先，针对穗形突变体ZM1160、百农207这两个亲本和“穗形突变体ZM1160 × 百农207”的F2群体（栽培过程中，发明人事先采集并冷冻保存其叶片作为样品），采用CTAB法提取对应样品的基因组DNA，并制备BSA池（畸形和正常穗形个体各采用30个样品的基因组，建立2个BSA池）；

随后，采用Axiom®wheat 660K SNP阵列(Thermo)进行对2个BSA池和2个亲本检测和分型（委托中国金标(北京)生物技术有限公司进行分型）；进一步地，设定合理阈值并进行数据筛选，获得高质量的基因分型数据；

最后，基于上述检测和分型数据结果，结合现有技术中的“中国春”参考基因组（RefSeq v1.0版本），分析结果表明：共鉴定出391个多态性SNP，其中343个SNP聚集在染色体7DS上15.85 Mb的基因组区域(1.03-16.88 Mb)，相关结果见如图2所示。

基于上述结果，进一步地，在小麦的7DS上15.85 Mb的区间设计筛选获得了6个多态性的dCAPS（cleaved amplified polymorphic sequences）标记（相关情况参见下表1），并利用这6个多态性分子标记对192个F2群体进行了连锁分析，进一步结合利用F2：3家系获得的F2单株的基因型，基于遗传作图原理，利用IciMappingv4. 0作图软件，将Tasp1基因初步定位在分子标记YZU0852 和 MIS46239之间，对应的物理距离为0.42Mb（示意图如图3所示）。

表1，目标性状初定位所涉及的dCAPS标记

。

、基于重测序的精细定位

在目标基因初定位基础上，对上述的2个BSA池和隐性亲本ZM1160进行重测序，以期在0.42Mb的目标区间发现更多的SNP位点。具体测序分析过程参考如下。

首先，在每个BSA池中取样（1 μg的DNA），超声破碎（以使每个DNA片段的平均大小约为300~400bp）；

随后，采用BGISEQ-500平台对上述处理后的片段文库进行测序（对端读取长度为150 bp）；基于测序结果，使用SOAPnuke对原始数据进行过滤，以获得每次加入的测序深度大于30 ×的干净读取；

再后，使用Burrows-Wheeler比对工具将所得的高质量干净读取数据定位到“中国春”参考基因组，并使用基因组分析工具包进行标记和删除重复读取；

最后，使用GATK HaplotypeCaller模块对相关SNP位点进行鉴定，并根据“中国春”基因组信息确定对应SNP位点的位置。

基于筛选所得SNP位点，发明人进一步开发了对应的dCAPS标记，以对相关多态性位点进行进一步筛选和鉴定。具体过程参考为：

首先，参考现有“中国春”基因组信息（初步定位目标区间对应的0.42Mb参考序列）以及前述目标区域内筛选的SNP位点，设计获得了7个PCR扩增用检测多态性的dCAPS多态性标记引物序列（如下表2所示）；

随后，对由杂合F2植株衍生的F3群体中1599个单株进行重组体筛选和基因型分析，并最终在前述的YZU0852和MIS46239的两翼标记间共鉴定出13种基因型的15个重组个体(如下表3所示)；

最后，进一步通过对重组体基因型和表型间的相关性分析，Tasp1被定位在MIS46203和MIS46234之间，物理距离为0.198 Mb。

表2，对目标性状基因精细定位时所涉及的dCAPS标记

表3，精细定位过程中涉及衍生F3群体（1599个单株）筛选所得重组体及基因型

。

基于上述结果，更进一步，根据在0.198Mb目标区域的SNP位点，设计并筛选多态性的dCAPS标记（如下表4所示），对另一个由杂合F2植株衍生的F3群体中1903个单株进行重组体筛选和基因型分析，在MIS46203和MIS46234的两翼标记间共鉴定出10个重组个体、 6种基因型(如下表5所示)。此时，对重组体基因型和表型间的相关性分析，目标基因Tasp1最终被定位到标记MIS48123和MIS48104之间22.9 Kb的区间(如图4所示)。

上述结果基础上，参考现有“中国春”基因组的相关基因注释信息，该区域只有一个高置信度基因，此基因即应当为目标基因Tasp1的候选基因。

表4，在0.198Mb目标区域精细定位时所涉及的dCAPS标记

表5，进一步精细定位过程中涉及衍生F3群体（1903个单株）筛选所得重组体及基因型

。

实施例2

在实施例1对Tasp1基因进行了精细定位基础上，为进一步研究和明确该基因功能，发明人对该基因进行了进一步克隆，相关试验情况简介如下。

（一）TaSP1基因的克隆

首先，参考试剂盒（RNAprep Pure Plant Plus Kit）说明书，以穗形突变体ZM1160叶片为样品，提取总RNA，并进一步反转录为cDNA备用；

随后，参考现有“中国春”基因组信息，设计PCR扩增用引物对如下：

P1：5’-TTGCCAGCTAGGTTAGGGTA-3’，

P2：5’-TGGGTGGTAAGGGTGAGATT-3’；

以上述引物对进行PCR扩增，50μl扩增体系参考设计如下：

2 × Taq PCR master Mix II，25 μl；

上游引物P1，1.25 μl(10 μM)；

下游引物P2，1.25 μl(10 μM)；

cDNA，5 μl (200 ng)；

ddH₂O，17.5 μl；

PCR反应程序参考如下：94℃、3min；94℃、30s，58℃、50s，72℃、60s，循环35次；72℃、10min；

对扩增产物进行电泳检测、并进行测序后，获得如SEQ ID No.1所示的TaSP1基因序列（1575bp，该基因没有内含子），具体如下：

ATGGCGTTCAACGACGACGAGAAGCCTCCTGCTTCTAACGCAGGTAACACCAAGGGTCTGGTGACCATCACCGAGCCCAAGTTCAGCAAGGACGAGGCGGCCCTGTCGGCGGACGAGGTGACGGCGGTGGTAGAGCTCAAAGCCACGTCGTCGACGGCCGTCCGGGAAGGGCTGGACCTGGTGGCGGTGCTGGACGTGAGCGGCAGCATGCAGGGCGACAAGCTCCAGAGCATGAAGATGGCGATGCAGTTCGTCATCATGAAGCTCACCCCCGTCGACCGCCTCTCCGTCGTCTCCTTCTCCGGCTCCGCCACCAGGCACTGCCCACTCCGCTCCGTCACGCAGCAAGCGCAGGCCGACCTCAAGGCCATCGTCGACGGCCTTGTCGCCAACGGCGGGACCAACATCAAGGCCGGCCTGGACACCGCCCTGGCCATCGTCGCCGGCCGCGCCACCACCAAAGCCCGCACGCCCAATGTCTTCCTCATGTCCGACGGCCAGCAGAGCGACGGCGACGCCAGGCAAGTCGATCCCGGGAACGTGGCGGTCTACACGTTCGGCTTCGGCAAGGACGCCGACCACGCCTTGCTCAGCGACGTCGCCAGGAAGTCCCCCGGCGGCACGTTCAACTCGGTGCCGGACGGCGGCAACGTGACCGCGCCCTTCTCGCAGCTCCTCGGCGGGCTCCTCACCATCGTCGCGCAGGACGTGCAGCTCACGCTGACGCCCAAGGCGGAAGATCCCAGCGCCCCGGACCTGGACACCATGACCGTGGCGCCAGGGACCGACTACACGCAGACCACCGACGGCGGCACGGGCGTCATCACCATCAAGTTCGGCACCCTCTTCAGCGGCGAGACCCGCAAGGTGGCCATCAACTTCAAGCTCCTGGAGAGCACCTTGACGACGCCGTACGACGGGTTGGTGGCGGAGGCCCAGCACAGCTACAACGTGCAGGGTAGCCCGCAGGGCCAGACCCCGCAGGACGTCGTGATACCCCGCTCCCCGGACGCGCCCGGCGAGGAAGCCGTGAGCGTCAAGGCGCGGGGGGTGCTGGCGGAGATGGCGCGTCGGCAGCACGCCGGCGCGATCGGCGAGGCGAGGCAGATGGCCGACGGGAAGAACCTGGAGGAGGCGTGGTACAAGCTGGCGGACGCGCAGAACGCGCTGGAGGACATCGTGCTGAACGACGGGGAGAAGCTGGTGGGCATGCTCCGGGCGGAGCTGCAGCAGCTGCTGGACCTGATGGAGACGCAGGAGCTGTACGAGGCGGAGGGGCGGCCGTACGCGCTGGCCTCCGAGACGTCGCACGGCCGGCAGCGGTACGCGGCGAGGGGTGGCGACATGGACGCCGTGCGGCTGTTCGCCACCCCGCGCATGGACACGTACCTGGAGCAGGCCAAGAAGTTCGAGGAGGACCCGACGGCGCCGCTGCCGTCCGCCGACGACGACGCCAAGGAGGAGATGGCCGCCAACCCGCTGGCCGCCATCTCGGCGCCCATCGCCTTCTACATCAAGGTGGCCATCCAGGCGCTGCAGGAGATCGAGAAGCTCGTCGCCCCGCCCACCAAATAA；

对应的，其所编码蛋白序列（524AA）如SEQ ID No.2所示，具体如下：

MAFNDDEKPPASNAGNTKGLVTITEPKFSKDEAALSADEVTAVVELKATSSTAVREGLDLVAVLDVSGSMQGDKLQSMKMAMQFVIMKLTPVDRLSVVSFSGSATRHCPLRSVTQQAQADLKAIVDGLVANGGTNIKAGLDTALAIVAGRATTKARTPNVFLMSDGQQSDGDARQVDPGNVAVYTFGFGKDADHALLSDVARKSPGGTFNSVPDGGNVTAPFSQLLGGLLTIVAQDVQLTLTPKAEDPSAPDLDTMTVAPGTDYTQTTDGGTGVITIKFGTLFSGETRKVAINFKLLESTLTTPYDGLVAEAQHSYNVQGSPQGQTPQDVVIPRSPDAPGEEAVSVKARGVLAEMARRQHAGAIGEARQMADGKNLEEAWYKLADAQNALEDIVLNDGEKLVGMLRAELQQLLDLMETQELYEAEGRPYALASETSHGRQRYAARGGDMDAVRLFATPRMDTYLEQAKKFEEDPTAPLPSADDDAKEEMAANPLAAISAPIAFYIKVAIQALQEIEKLVAPPTK。

（二）TaSP1基因的表达模式

结合前述测序结果，采用qRT-PCR技术，发明人进一步对该基因的表达模式（即组织特异性表达模式和时空表达模式）进行了检测分析，相关情况简介如下。

、组织表达模式

以周麦32的不同生长部位为材料，包括：小麦植株的根、茎、旗叶和幼穗（长度2厘米），提取总RNA并进一步反转录为cDNA备用；以TaGAPDH基因为内参基因，进行QRT-PCR扩增；最后，采用2^-ΔΔCt方法计算基因相对表达量情况。

QRT-PCR扩增过程中，相关引物信息设计如下

。

相关结果如何图5所示。可以看出：周麦32中，Tasp1基因主要在穗中表达，并且在幼穗的表达量约为茎的90倍。

、时空表达模式

以周麦32发育过程中不同发育时间的穗子（穗长约为2、3、4、5、6、9 cm）为样品材料，参考前述操作，进行QRT-PCR扩增分析。

结果如何图6所示。分析可以看出，Tasp1基因表达量伴随穗长发育时间（发育长度）不同呈现出不同差别，即：该基因伴随小麦穗的发育呈现先高后低的表达模式，表明该基因参与了小麦穗的整个发育过程。

（三）Tasp1等位基因的功能分析

基于前述测序结果，利用现有基因分析网站及分析软件，发明人对Tasp1基因结构进行了初步分析，结果如何图7所示。可以看出：Tasp1基因含有一个vWA结构域，可能通过形成泛素-蛋白酶体系统，用于细胞内蛋白质降解，从而调控小麦穗形。

进一步将突变体ZM1160、周麦32的ORF序列进行对比，可以发现：周麦32和突变体ZM1160之间存在一个位于1138bp处的SNP (C/T) (序列对比图如图8所示)，基于此结果，可以初步认定：

由于周麦32与ZM1160突变体之间对应SNP位点发生了错义突变(C/T)，最终导致了穗形畸形突变发生；即：当周麦32的精氨酸密码子(CGG)突变为突变体ZM1160色氨酸密码子(TGG)后，对应的正常穗形表型突变为畸形穗形。

（四）检测验证

基于上述分析结果，为进一步确认该突变位点是否与畸形穗形相关，根据该突变位点(C/T)设计了一个dCAPS标记MIS48109，具体引物对设计如下：

MIS48109-P1：5’-ACGGGAAGAACCTGGAGGACGCG-3’，

MIS48109-P2：5’-CAGCTCCGCCCGGAGCAT-3’；

10μl的PCR反应体系参考设计如下：

2 × Taq PCR master Mix II，5 μl；

上游引物P1，0.25 μl(10 μM)；

下游引物P2，0.25 μl(10 μM)；

cDNA，2 μl (200 ng)；

ddH₂O，2.5 μl；

PCR反应程序参考如下：94℃、3min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，循环35次；72℃、10min。

以实施例1中的192株F2植株样品进行验证（对扩增产物进行MluI酶切）。结果如图9所示。分析可以看出：该标记MIS48109与控制穗形表型的Tasp1基因是共分离的，即F2群体中的个体基因型为AA型和Aa型的穗形为正常类型，个体基因型为aa型的穗形为畸形类型。换言之，利用标记MIS48109的引物对可有效检测或区分AA、aa基因型或其对应的表型。

实施例3

在实施例2对Tasp1基因进行克隆和序列分析的基础上，为进一步分析该基因在不同小麦品种间基因差异情况，发明人随机挑选了9个小麦品种对该基因进行了克隆，经序列比对，发现该基因在不同小麦品种中的等位基因存在一定差异，进一步根据该等位基因位点设计检测用了dCAPS标记，并检测了中国主要小麦品种412份，发现存在两种等位基因类型，即两种单倍型。相关试验情况简介如下。

（一）Tasp1基因的等位基因类型

随机挑选了9个小麦品种：周麦18、周麦28、百农207、矮抗58、郑麦7698、郑麦366、中国春、新麦26和周麦32，参考前述操作及现有技术，对这9个小麦品种中的Tasp1基因进行了克隆测序并进行了序列比对。

结果如图10所示。分析可以看出：它们的Tasp1基因仅在1449bp处存在一个SNP(C/G)位点，即Tasp1基因在9个小麦品种中存在两种单倍型：Haplotype I (CC)和Haplotype II (GG)。

（二）Tasp1基因的单倍型分析

在上述分析结果基础上，发明人进一步基于上述Tasp1基因1449bp处的SNP (C/G)（即，基于Haplotype I和Haplotype II之间的SNP位点差异），设计了一个特异性标记GB-2R，具体引物序列设计如下：

GB-2R-P1：5’-GCGCCGCTGCCGTCCGCCGTCGA-3’，

GB-2R-P2: 5’-ATGGGAACGTAGTAGTAAATGGAG-3’；

基于上述引物对，参考前述操作及现有技术，发明人对655个中国常见小麦品种的基因型进行了检测分析（对扩增产物进行SalI酶切）。655个中国常见小麦品种中TaSP1基因的单倍型分布情况如下表6所示。分析结果表明：单倍型I (CC)有566个小麦品种，而单倍型II (GG)仅有89个小麦品种。这一结果表明，利用所设计的GB-2R可以有效区分不同的单倍型类型。

在明确上述所设计的dCAPS标记具有可行性同时，2022~2023年份期间，发明人进一步于新乡市和开封市小麦育种场分别种植了403个和252个现有技术中常见和主流的普通小麦品种（种植时，种植小区分为两行（每行1.5 m，行距0.25 m），每行15粒种子，常规管理，成熟时，每个品种随机选择5株进行小麦穗形表型评价），并在收获期对小麦穗长(SL)、小穗数(SN)性状进行了测定统计（数据统计时，取平均值）。结果汇总如下表6所示及图11所示。种植在新乡实验基地的403个中国常见小麦品种中单倍型I (CC)有358个小麦品种，而单倍型II (GG)仅有45个小麦品种。种植在开封实验基地的252个中国常见小麦品种中单倍型I (CC)有208个小麦品种，而单倍型II(GG)仅有44个小麦品种。

结果分析可以看出：单倍型a和单倍型b（a：CC单倍型，b：GG单倍型）的小麦穗形(SL、SN)在新乡实验基地和开封实验基地均出现显著的统计学差异，其中SL呈显著性差异，SN呈极显著性差异。换言之，从统计结果而言，单倍型a（CC单倍型）具有更短的穗长、更少的小穗数的表型性状。

上述结果表明，TaSP1基因与小麦穗形发育有显著的相关性，而利用候选基因特异性标记可以对相关小麦品种进行有效区分，进而可为后续小麦高产品种培育提供一定指导。

表6，655个中国常见小麦品种表型及单倍型

续上表

/>

续上表：

注a：CC单倍型，b：GG单倍型。

Claims

1.小麦穗形相关基因TaSP1在育种中的应用，其特征在于，利用小麦穗形相关基因TaSP1用于小麦穗形调整；所述小麦穗形，为小穗数和穗长表型性状；应用时，含有所述小麦穗形相关基因TaSP1的小麦穗长变短、小穗数数量变少；

2.检测小麦穗形相关基因TaSP1用dCAPS标记MIS48109，其特征在于，所述dCAPS标记MIS48109为一对PCR扩增用引物对，具体引物对设计如下：

MIS48109-P1：5’-ACGGGAAGAACCTGGAGGACGCG-3’，

MIS48109-P2：5’-CAGCTCCGCCCGGAGCAT-3’；

利用所述dCAPS标记MIS48109进行PCR检测时，小麦穗形正常品种与小麦穗形畸形品种中对应的TaSP1基因间在1138bp位点处存在一个C/T突变；即：

小麦穗形正常品种的精氨酸CGG突变为色氨酸密码子TGG后，对应的正常穗形表型突变为畸形穗形；

3.正常小麦穗形表型分型用特异性标记GB-2R，其特征在于，所述特异性标记GB-2R为一对PCR扩增用引物对，具体引物序列设计如下：

GB-2R-P1：5’-GCGCCGCTGCCGTCCGCCGTCGA-3’，

GB-2R-P2: 5’-ATGGGAACGTAGTAGTAAATGGAG-3’；

应用时，正常小麦穗形表型的小麦品种中Tasp1基因在1449bp处存在一个C/G差异，利用上述引物对进行PCR扩增后可检测区分CC单倍型和GG 单倍型小麦品种；