CN108103237A

CN108103237A - 与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记及其检测引物与应用

Info

Publication number: CN108103237A
Application number: CN201810154909.0A
Authority: CN
Inventors: 汪聪颖; 陈深; 冯爱卿; 苏菁; 汪文娟; 封金奇; 陈炳; 伍圣远; 张梅英; 杨健源; 曾列先; 朱小源
Original assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-02-23
Filing date: 2018-02-23
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2038-02-23
Also published as: CN108103237B

Abstract

本发明公开了一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记及其检测引物与应用。该InDel分子标记包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该InDel分子标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子，适用于鉴别水稻白叶枯病抗性品种。该InDel分子标记特异性高；条带差异很大，用琼脂糖凝胶电泳即可清晰区分。本发明还提供了该InDel分子标记的检测引物，其由如SEQ ID NO.3所示的引物和如SEQ ID NO.4所示的引物组成。本发明还提供了该InDel分子标记的检测试剂盒，其包含前述检测引物。使用该检测引物或检测试剂盒，能大大加快水稻广谱抗白叶枯病分子育种的进程。

Description

与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记及其检测引物与应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记及其检测引物与应用。

背景技术

白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)是我国以及世界稻米主产区东南亚水稻的主要病害之一，严重威胁稻米安全生产。白叶枯病菌侵染会危害水稻生长，一般发生时减产10％-30％，严重时可超过50％，甚至绝收[Mew,1987,Current Status and FutureProspects of Research on Bacterial Blight of Rice.Ann Rev Phytopathol,25:359-382.]。由于该病害是一种维管束型细菌病害，普通化学药剂的防治效果并不理想，利用寄主抗性是控制该病害的有效手段[伍尚忠,1982,水稻白叶枯病及其防治,上海科技出版社；Khush,1989,Breeding Rice for Bacterial Blight Resistance.Bacterial blight ofrice.International Rice Research Institute,pp207-218.]。然而，随着病菌致病性变异，品种抗性会逐步被克服。因此，新型抗病资源的发掘与储备，对有效控制病害有着重要意义。本专利检测的对象xa34(t)基因对水稻白叶枯病表现出优异的抗性，对中国已报道的白叶枯病菌9种致病型都表现高抗，尤其是高抗近年在广东发现的Ⅸ型菌[曾列先等,2005,广东水稻白叶枯病菌新致病型的发现及致病性测定,广东农业科学，02:58-59]。Ⅸ型菌对中国鉴别寄主体系(金刚30、Tetep、南粳15、Java14、IR26)的抗性表现为SSSSS的反应模式，能够克服目前生产上广泛应用的Xa3/Xa26、Xa4、xa13和Xa21等基因的抗性，为水稻生产安全埋下巨大的隐患。在广东，该致病型的出现频率自2005年首次发现时的5％，上升到现在的15％。其致病范围也扩展到海南和广西。一般认为，20％的流行频率是致病小种克服品种抗性，逐步流行爆发的临界值[Ogawa,1993，Method and Strategy for Monitoring RaceDistribution and Identification of Resistance Genes to Bacterial Leaf Blight(X.oryzae)in Rice.JARQ，27l:71-80]。所以，推进抗Ⅸ型菌的水稻白叶枯抗病基因xa34(t)的应用迫在眉睫。

传统的水稻抗病育种费时费力，需要经过多代回交和抗病表型筛选的过程。由于xa34(t)基因介导的水稻白叶枯病抗性表现为隐性基因的遗传规律，回交育种过程中需要每代自交筛选到纯合子才能确认隐性抗性的渗入。这些因素都增加了xa34(t)基因的抗性育种的周期和难度。分子辅助育种标记的开发和应用是隐性抗病基因高效利用的关键技术。

本课题组前期完成了xa34(t)基因的定位工作，将其界定于1号染色体RM10927和BGID25标记之间，遗传距离0.4cM，物理距离204kb[Chen et al.,2011,Genetic Analysisand Molecular Mapping of a Novel Recessive Gene xa34(t)for Resistance AgainstXanthomonas oryzae pv.Oryzae.Theor Appl Genet,122(7):1331-1338]。同时，前期研究还开发了两个与xa34(t)基因共分离的SSR分子标记BGID36和BGID34。由于SSR分子标记的片段差异很小，需要用PAGE垂直胶来检测。该检测方法需要使用丙烯酰胺、甲醛等有毒有害化学试剂，银染显色所需的试剂也较昂贵。而且该检测方法存在耗时长，通量低的缺陷。以上问题成为制约xa34(t)基因在水稻抗病分子育种领域广泛应用的瓶颈。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，推进xa34(t)基因在水稻抗病育种中的广泛应用，本发明的首要目的在于提供一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记。该InDel分子标记基于基因序列插入/缺失突变(Insert/Delete,InDel)的差异而开发的，可以提高该基因在分子标记辅助选择育种等应用领域中的利用效率。

本发明的另一目的在于提供上述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测引物及检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的制备方法与应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记，包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的制备方法，可通过化学合成方法得到；或是通过上述检测引物，以水稻白叶枯抗病品种的基因组为模板，扩增得到。

所述的水稻白叶枯抗病品种优选为水稻品种BG1222。

所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记在鉴别水稻白叶枯抗性品种中的应用，特别适合用于分子标记辅助选择育种或基因聚合育种。

一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测引物，由如SEQ ID NO.3所示的上游引物xa34-nv7InDel Fw和如SEQ ID NO.4所示的下游引物xa34-nv7InDel Rv组成；

xa34-nv7InDel Fw：5’-GTCTTGGGTGGAAGTCTGACCTC-3’；

xa34-nv7InDel Rv：5’-GGGTAGGTCTGTTTGCAAGAGTTG-3’。

所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测引物在鉴别水稻白叶枯抗性品种中的应用，包括如下步骤：

(1)利用所述的检测引物对待检测的水稻品种的基因组总DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；

(2)对步骤(1)的PCR产物进行电泳分析；

(3)若电泳条带只出现长度为411bp的DNA片段，则判断水稻样品为携带水稻白叶枯病抗性基因xa34(t)的纯合型；若电泳条带只出现长度为209bp的DNA片段，则判断水稻样品为不携带水稻白叶枯病抗性基因xa34(t)的纯合型；若电泳条带同时出现长度为209bp与411bp的DNA片段，则判断水稻样品为携带水稻白叶枯病抗性基因xa34(t)的杂合型。

步骤(1)中所述的PCR的条件优选为：94℃3分钟；94℃20秒、60℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

步骤(2)中所述的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳；优选为琼脂糖凝胶电泳。

所述的琼脂糖凝胶的浓度优选为质量百分比1％。

一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测试剂盒，包括上述检测引物。

所述的与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测试剂盒，还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。

本发明的原理：本发明在水稻广谱抗白叶枯病xa34(t)基因精细定位的研究基础上，在xa34(t)基因的定位区间(1号染色体RM10927和BGID25标记之间)，通过候选基因nv7的测序获得SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。其中SEQ ID NO.1的序列来源于抗病亲本品种BG1222，SEQ ID NO.2的序列来源于感病亲本品种金刚30。SEQ ID NO.1所示的DNA序列与SEQ ID NO.2所示的DNA序列两者之间相比，SEQ ID NO.1包含了一段从133bp位点至383bp位点长度为250bp的特异序列。这段特异序列又包含了一段长度为202bp的插入/缺失突变。两序列比对结果如图1所示。根据此插入/缺失突变，可以设计开发出多个诸如xa34-nv7InDel与xa34(t)抗病基因共分离的共显性InDel分子标记。xa34-nv7InDel标记在水稻染色体上的位置关系如图2所示。本标记与SSR分子标记BGID36之间的物理距离只有10kb。BGID36是与xa34(t)基因共分离的分子标记，因此，xa34-nv7InDel标记与xa34(t)基因也是共分离的。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的InDel分子标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子。由于xa34(t)基因是个隐性抗病基因，需要在纯合子条件下才表现抗病表型，利用本标记在水稻苗期就可以鉴定植株的基因型，省去回交渗入过程中每代自交的步骤。

(2)本发明提供的InDel标记特异性高：如SEQ ID NO.3所示的上游引物xa34-nv7InDel Fw和如SEQ ID NO.4所示的下游引物xa34-nv7InDel Rv，其序列分别经blast比对，在明恢63、珍籼97、日本晴和9311等水稻参考基因组上的位置都是唯一的。

(3)本发明提供的InDel标记的条带差异很大，用普通琼脂糖凝胶电泳即可清晰地区分。本研究组之前开发的共分离标记BGID36和BGID34属于SSR分子标记，条带差异很小，需要用到高分辨率的聚丙烯酰胺垂直胶电泳来检测。该技术单次检测的样品量少，检测耗时长，制胶和显影需要使用到对人体有害的丙烯酰胺和甲醛等化学试剂，污染环境。而本发明开发的InDel标记由于条带差异大，可以用普通琼脂糖凝胶电泳快速简便地进行鉴定，便于实现高通量检测筛选，还免除使用有毒有害化学试剂，减少了对环境的污染。

(4)本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。经过在22个不同遗传背景的常规稻、杂交稻保持系和杂交稻恢复系中检测，这个标记都能显现出多态性，其适用性很广。

因此，本发明提供的一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高广谱抗病基因资源在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种中的应用效率，大大加快水稻广谱抗白叶枯病分子育种的进程。

附图说明

图1是分别来自于抗源亲本品种BG1222和感病对照亲本金刚30中的xa34-nv7InDel序列通过SCAN2软件进行序列比对的结果图。

图2是xa34-nv7InDel分子标记在水稻第1号染色体上的遗传位置以及该标记与SSR分子标记BGID36的物理位置图。

图3是xa34-nv7InDel分子标记在华南地区主栽水稻品种和水稻白叶枯病主要抗病资源品种中的验证结果图，其中：泳道M为Marker DL2000，泳道1～23对应的水稻品种分别为：1.BG1222，2.金刚30，3.IR24，4.特青2号，5.黄华占，6.粤晶丝苗2号，7.粤香占，8.玉香油占，9.美香占，10.五山丝苗，11.华占，12.蜀恢527，13.五丰B，14.Ⅱ-32B，15.博ⅡB，16.五优308，17.IRBB3，18.IRBB4，19.IRBB5，20.IRBB7，21.IRBB10，22.IRBB21，23.CBB23。

图4是利用金刚30/BG1222杂交F₂群体对xa34-nv7InDel分子标记进行遗传与抗病表型验证结果图；其中，图A为xa34-nv7InDel分子标记检测结果图，图B为BGID36SSR分子标记检测结果图；泳道M为Marker，泳道P1为BG1222，泳道P2为金刚30，泳道4～29为F₂代个体1～25号样品。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：与xa34(t)基因共分离的InDel分子标记开发与该标记在华南地区主栽水稻品种和水稻白叶枯病主要抗病资源品种中的验证。

(1)在xa34(t)基因精细定位研究结果的基础上，在1号染色体RM10927和BGID25标记之间的范围内，分别对xa34(t)基因的抗源品种BG1222和感病对照品种金刚30进行候选基因测序分析：RM10927和BGID25标记对应于籼稻品种明恢63的参考基因组物理位置为Chr01:14750992..14920510，区间169.5kb，包含注释基因34个。优先选择该区域内共分离标记BGID36和BGID34附近的候选基因进行测序分析。

(2)利用步骤(1)获得的候选基因序列，通过序列比对软件工具SCAN2进行核苷酸序列比对，筛查抗/感品种间存在差异大于100bp的InDel序列位点，筛选到了xa34-nv7InDel，序列比对结果如图1所示：抗源亲本品种BG1222的DNA序列(如SEQ ID NO.1所示)与感病对照亲本金刚30(JG30)的DNA序列(如SEQ ID NO.2所示)的两者之间存在一个长度为202bp的插入/缺失突变。

(3)根据步骤(2)筛选到的抗/感品种间存在差异大于100bp的InDel序列位点信息，通过引物设计软件Primer Premier5在该InDel位点上游100～200bp处设计基因特异性上游引物，在该InDel位点下游100～200bp处设计基因特异性下游引物，组成PCR扩增引物对，引物对碱基序列如下：

xa34-nv7InDel Fw:5’-GTCTTGGGTGGAAGTCTGACCTC-3’；

xa34-nv7InDel Rv:5’-GGGTAGGTCTGTTTGCAAGAGTTG-3’。

(4)选择代表性水稻品种并提取基因组DNA：

水稻品种BG1222是xa34(t)基因的抗源品种，作为标记验证的阳性对照(在文献“Chen et al.,2011.Genetic analysis and molecular mapping of a novel recessivegene xa34(t)for resistance against Xanthomonas oryzae pv.Oryzae.Theor ApplGenet,122:1331-1338.”中公开)。

水稻品种金刚30是对水稻白叶枯病的普感品种，作为标记验证的阴性对照(在文献“伍尚忠等,1985.华南及菲律宾稻白叶枯病病原菌株致病性比较研究,15(2):65-72.”中公开)。

水稻品种IR24在文献“Ogawa et al.1991.Breeding of Near-Isogenic Linesof Rice with Single Genes for Resistance to Bacterial Blight Pathogen(Xanthomonas campestris pv.Oryzae).Japan J Breed.41:523-529.”中公开。

水稻品种特青2号在文献“周汉钦等,1999,水稻优异种质超高产品种特青2号在育种中的应用,广东农业科学,4:5-7.”中公开。

水稻品种黄华占在文献“周少川等,2009,优质稻核心种质黄华占及其衍生系统理想模式研究,中国水稻科学,23(2):153-159.”中公开。

水稻品种粤晶丝苗2号在文献“廖耀平等,2008,优质高产抗病水稻品种粤晶丝苗2号的特征特性及栽培技术要点,中国稻米,2:44-48.”中公开。

水稻品种粤香占在文献“廖耀平等,2001,高收获指数型水稻品种粤香占库、源、流特性的研究,中国水稻科学,15(1):73-76.”中公开。

水稻品种玉香油占在文献“江奕君等,2009,大穗广适型超级稻新品种玉香油占的选育,广东农业科学,3:9-10.”中公开。

水稻品种美香占在文献“周少川等,2008,水稻优良食味核心种质美香占2号及其衍生系统理想模式研究,中国农业科技导报,10(8):60-67.”中公开。

水稻品种五山丝苗在文献“黄道强等,2011,优质稻新品种五山丝苗的选育及利用,广东农业科学,9:15-16.”中公开。

水稻品种华占在文献“禹盛苗等,209,杂交水稻新组合天优华占的特征特性及高产栽培技术,杂交水稻,24(6):42-44.”中公开。

水稻品种蜀恢527在文献“王玉平等,2004,高配合力优质水稻恢复系蜀恢527的选育与利用,杂交水稻,19(4):12-14.”中公开。

水稻品种五丰B在文献“李曙光等,2009,优质籼型不育系五丰A的特征特性及高产优质繁殖技术,广东农业科学,8:29-30.”中公开。

水稻品种Ⅱ-32B在文献“曾应和等,1999,Ⅱ-32A特征特性及其组合制种技术,杂交水稻,14(4):13-14.”中公开。

水稻品种博ⅡB在文献“陈平等,2002,籼稻不育系博ⅡA的选育,杂交水稻,17(3):9-10.”中公开。

水稻品种五优308在文献“黄慧君等,2010,优质超级杂交稻新组合五优308,杂交水稻,25(2):82-84.”中公开。

水稻品种IRBB3，IRBB4，IRBB5，IRBB7和IRBB10在文献“Ogawa etal.1991.Breeding of Near-Isogenic Lines of Rice with Single Genes forResistance to Bacterial Blight Pathogen(Xanthomonas campestris pv.Oryzae).Japan J Breed.41:523-529.”中公开。

水稻品种IRBB21在文献“Wang et al.2004,Isolation and characterizationof rice mutants compromised in Xa21-mediated resistance to X.oryzaepv.Oryzae,Theor Appl Genet,108(3):379-384.”中公开。

水稻品种CBB23在文献“章琦等,2002,携有抗白叶枯病新基因Xa23水稻近等基因系的构建及应用,中国水稻科学,16(3):206-210.”中公开。

以上水稻基因组总DNA的提取采用植物微量DNA快速提取法，步骤如下：

(I).取检测水稻叶片少许，置于1.5mL离心管，加入液氮，用小研锤快速磨碎，迅速加入400μl于80℃预热的DNA微量提取缓冲液(200mM Tris-HCl，250mM NaCl，0.5％SDS，25mM EDTA)。

(II).70℃干热浴14min，冰浴2min进行冷却。

(III).12000r/min离心1min，取300μl上清，加等量异丙醇，翻转几次混匀，室温静置5min。

(IV).12000r/min离心5min，弃尽上清(可用无水乙醇洗1次)。

(V).DNA沉淀风干后溶于80μl TE，吸取1μl用作PCR扩增模板，其余DNA溶液保存于-20℃。

(5)PCR扩增与电泳检测

利用上述引物对xa34-nv7InDel Fw和xa34-nv7InDel Rv，以上述水稻品种的基因组总DNA为模板，进行常规PCR扩增，扩增反应体系如下：

10×PCR buffer(Mg2+Plus)：2μl

dNTPs(2.5mM each)：1.6μl

引物Fw(10μM)：1μl

引物Rv(10μM)：1μl

TaKaRa Taq^TM(5U/μl)：0.1μl

DNA模板(20-50ng/μl)：1μl

ddH₂O：补足至20μl。

PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃20秒、60℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

取5μl PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为120V，20分钟。

检测结果如图3所示：携带xa34(t)基因的品种PCR反应产物为单一的411bp片段，电泳检测条带以高带(图3的第1泳道)呈现；不携带xa34(t)基因的品种PCR反应产物为单一的209bp片段，电泳检测条带以低带(图3的第2-22泳道)呈现。结果表明xa34-nv7InDel标记具有很高的特异性和辨识度以及很广的适用性。可见，xa34-nv7InDel分子标记能清晰地将抗源品种BG1222与其它非携带xa34(t)基因的水稻品种区别开，具有很高的特异性和辨识度。

实施例2：利用金刚30/BG1222杂交F₂群体对xa34-nv7InDel分子标记进行遗传与抗病表型验证

(1)F₂分离群体构建：以感病亲本品种金刚30为母本，抗源BG1222为父本进行花粉杂交得到F₁代；F₁代自花授粉繁育得到F₂代分离群体。

(2)F₂代约100株于水田单株栽培，孕穗期以“剪叶法”接种水稻白叶枯菌V型菌(菌株编号为5226，公开报道文献为：“Chen et al.,2011.Genetic analysis and molecularmapping of a novel recessive gene xa34(t)for resistance against Xanthomonasoryzae pv.Oryzae.Theor Appl Genet,122:1331-1338.”)进行抗病表型鉴定。于接菌后21天进行抗病表型调查，参照国际水稻所INGER的方法调查评价抗性(可参考文献“INGERGenetic Resources Center,1996,Standard Evaluation System for rice(4thedition)[M].Philippines:International Rice Research Institute Press,p20-21.”)。

(3)F₂代单株挂牌编号取样，参照实施例1的步骤(4)进行基因组DNA提取。F₂代个体基因组DNA参照实施例1的步骤(5)进行xa34-nv7InDel和BGID36SSR分子标记(扩增引物如下：引物BGID36SSR Fw:5’-CGAGCACATCCTCCTCATTGCG-3’；引物BGID36SSR Rv:5’-GTAGGTGGCTACGGCGAT-3’)PCR扩增。其中，xa34-nv7InDel标记的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照检测；BGID36SSR标记用8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，2-3小时，电泳结束后进行0.1％AgNO₃银染15分钟，再用2％NaOH、0.4％甲醛、0.04％Na₂CO₃显色，显色结束后在灯箱上拍照分析。

结果如图4所示，在F₂代个体中与BG1222有一致带型的单株表现为抗病(R)，与金刚30有一致带型的植株为感病(S)，杂合带型的植株也表现为感病(S)。xa34-nv7InDel标记的检测结果与共分离SSR标记BGID36的检测结果是完全一致的。图4只展示1～25号样品检测结果，其余26～100号样品检测结果均导向相同的结论。本实施案例证明，xa34-nv7InDel标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子；此标记与xa34(t)基因介导的抗性共分离。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院植物保护研究所

<120> 与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记及其检测引物与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 411

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<223> 由BG1222扩增得到的xa34-nv7InDel片段

<400> 2

gtcttgggtg gaagtctgac ctcggcgccc gttgctacgc tgctttagcc cgttccgctt 60

tttgtttttt tttttgttct ttttttttct ctcgtaactg aaacagttga acaggttttt 120

atttttgtca taattgtacg agttacaagt agggtttcca aaccgccggg gccggggtta 180

ccgggccccg gcggtaagca cggttaccgc gcggtaaccg tgaaaaaccg tacaaaacca 240

tgtaaaattg atcaaaaatt caaattattt ttaaaattta tttgaattta aggaggttac 300

cgcggtattt atattaccgt acctccccgg taagctcggt aactgcggta accgcgcggt 360

taccggcggt aaaaaaaacc ctggttacaa ctcttgcaaa cagacctacc c 411

<210> 2

<211> 209

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa JG30)

<220>

<223> 由金刚30扩增得到的xa34-nv7InDel片段

<400> 2

gtcttcggtg gaagtctgac ctcggcgccc gttgctacgc tgctttagcc cgttccgctt 60

tttgtttttt ttgttctttt tttctctctc tcgtagctga aacagttgaa caggctttta 120

tttttgtcat agctgaaaca gtttgattat gtttttaact tcagggatat atagagctgg 180

agttacaact cttgcaaaca gacctaccc 209

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物xa34-nv7InDel Fw

<400> 3

gtcttgggtg gaagtctgac ctc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物xa34-nv7InDel Rv

<400> 4

gggtaggtct gtttgcaaga gttg 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物BGID36 SSR Fw

<400> 5

cgagcacatc ctcctcattg cg 22

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物BGID36 SSR Rv

<400> 6

gtaggtggct acggcgat 18

Claims

1.一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记，其特征在于包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的制备方法，其特征在于：所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记通过化学合成方法得到；或是通过上述检测引物，以水稻白叶枯抗病品种的基因组为模板，扩增得到。

3.根据权利要求2所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的制备方法，其特征在于：所述的水稻白叶枯抗病品种为水稻品种BG1222。

4.权利要求1所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记在鉴别水稻白叶枯抗性品种中的应用。

5.根据权利要求4所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记在鉴别水稻白叶枯抗性品种中的应用，其特征在于：所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记用于分子标记辅助选择育种或基因聚合育种。

6.一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测引物，其特征在于由如SEQ ID NO.3所示的上游引物xa34-nv7InDel Fw和如SEQ ID NO.4所示的下游引物xa34-nv7InDel Rv组成；

xa34-nv7InDel Fw：5’-GTCTTGGGTGGAAGTCTGACCTC-3’；

xa34-nv7InDel Rv：5’-GGGTAGGTCTGTTTGCAAGAGTTG-3’。

7.权利要求6所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测引物在鉴别水稻白叶枯抗性品种中的应用，其特征在于包括如下步骤：

(2)对步骤(1)的PCR产物进行电泳分析；

8.根据权利要求7所述与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测引物在鉴别水稻白叶枯抗性品种中的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的PCR的条件为：94℃3分钟；94℃20秒、60℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃5分钟；

步骤(2)中所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。

9.一种与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求7所述的检测引物。

10.根据权利要求9所述的与水稻白叶枯抗病基因xa34(t)共分离的InDel分子标记的检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。