CN106957916A - 水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物及其应用。水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记，所述的分子标记的上游引物为Xa27‑F：SEQ ID NO.1，下游引物为Xa27‑R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为155bp。通过本发明提供的水稻白叶枯病抗性基因Xa27的分子标记检测方法可以检测水稻品种资源中是否含有Xa27基因，可预测其对白叶枯病的抗性水平，大大提高水稻抗白叶枯病材料的选择效率，加快抗病育种进程。

Description

水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物及其应用
技术领域
本发明属于农作物分子遗传育种学领域，涉及水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物及其应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全和国民经济增长具有重要意义。白叶枯病是水稻生产上最重要的细菌性病害，由于高产、不抗病品种的大范围推广导致抗源稀缺，白叶枯病在我国快速扩展蔓延，造成严重危害(章琦.水稻白叶枯病抗性的遗传及改良[M].北京：科学出版社，2007：116-118.)。进一步发掘和利用我国抗白叶枯病基因资源，采用以选育和种植抗病品种为主的综合防治技术可以有效地控制这种病害的发生。
迄今，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个。其中，已定位的白叶枯病抗性基因有29个，有10个白叶枯抗性基因被克隆。这些抗病基因可以引入或聚合到现代品种，选育出高抗、广谱的品种。但传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于抗病基因多为显性、基因间往往存在上位性互作，抗病基因聚合更为困难。通过分子标记辅助育种可以有效解决这一问题。
我国幅员辽阔，水稻种植区众多，蕴藏有丰富的稻种资源，但各稻区品种的抗性基因组成不同。从我国种质资源中鉴定抗白叶枯病基因以便能够掌握种植品种的抗病基因组成，及时增加抗病品种、丰富抗源多样性，合理布局品种，对提高我国水稻抗白叶枯病育种水平有重大意义。
发明内容
本发明的目的是：提供水稻品种抗白叶枯病基因Xa27的分子标记。
本发明的另一目的是提供该分子标记的引物。
本发明的又一目的是提供一种快速鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27存在与否的方法，通过检测抗病基因Xa27及其等位基因扩增片段的大小，可以确定有无抗病基因Xa27，并预测水稻植株的白叶枯病抗性，加快抗白叶枯病水稻新品种的选育进度。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记，所述的分子标记的上游引物为Xa27-F：SEQID NO.1，下游引物为Xa27-R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为155bp。
本发明所述的水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物，所述的分子标记的上游引物为Xa27-F：SEQ ID NO.1，下游引物为Xa27-R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为155bp。
本发明所述的分子标记在鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27中的应用。
本发明所述的分子标记引物在鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27中的应用。
本发明所述的分子标记引物在鉴别抗白叶枯病水稻中的应用。
一种快速鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27存在与否的方法，包含如下操作步骤：
(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；
(2)Xa27的编码序列在感病品种IR24和抗病品种IRBB27中完全一样，与IRBB27相比，IR24中的Xa27启动子在ATG上游1.4kb左右多出一段10bp的序列，另外在TA框前多出25bp的序列，这造成基因表达的差异。我们针对TA框前25bp的差异设计InDel标记，在差异上下游设计特异性引物Xa27-F/R。含有Xa27品种的扩增产物长度155bp，含有Xa27等位基因品种的扩增产物长度为180bp。
引物名称 引物序列(5’—3’)
Xa27-F GCGTATTAGCTTTCATTT
Xa27-R AGTCGTAGTCAACCACAA
(3)利用表1中的分子标记引物对所述的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离检测。其中，所述的PCR反应体系为：2×Phanta MaxBuffer 25μL，4pmol/μl的表1中所述的分子标记引物对2.0μl，10mM dNTP Mix 1.0μL，1U/μL DNA Polymerase 1.0μL，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA1.0μl，加水至50μl；反应程序为：DNA 95℃预变性3分钟后；95℃变性15秒，48℃退火15秒，72℃延伸展30秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟。
有益效果
本发明所提供的水稻抗白叶枯病基因的分子标记方法，具有以下优点：
(1)通过本发明分子标记定位的基因鉴定方便。由于这些标记可以特异性扩增Xa27及其等位基因，通过检测扩增片段的结果，可以确定抗白叶枯病基因Xa27的存在与否，预测水稻植株的白叶枯病抗性，从而加快抗病育种进程。
(2)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统抗病育种方法中，对育种材料的白叶枯病抗性进行表型鉴定，一般在苗期或抽穗期，受接种环境影响较大，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗白叶枯病基因Xa27，可以在苗期取样，提取DNA，利用上述标记就可鉴定出抗白叶枯病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本、控制育种群体规模，而且大大提高抗白叶枯病个体的选择效率。
附图说明
图1.水稻抗白叶枯病基因Xa27PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。
其中：1号泳道为Marker，8号泳道为IRBB27抗性基因对照，9号泳道为IR24抗性等位基因对照，2-7号泳道为主栽品种。
具体实施方式
实施例1
(一)材料与方法：
1.含有Xa27基因的IRBB27及Xa27等位基因的IR24；部分生产上的主栽品种
2.DNA提取方法：用CTAB法提取各品种(系)的DNA。
3.PCR反应体系：体积为50μl，其中2×Phanta Max Buffer 25μL，4pmol/μl的表1中所述的分子标记引物对2.0μl，10mM dNTP Mix 1.0μL，1U/μL DNA Polymerase 1.0μL，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA 1.0μl，加水至50μl；反应程序为：DNA 95℃预变性3分钟后；95℃变性15秒，48℃退火15秒，72℃延伸展30秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，取6μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离检测，如果扩增出155bp的片段，证明Xa27的存在，如果扩增出180bp的片段，证明不含有Xa27基因。
(二)结果与分析：
研究结果发现，IRBB27和两优8106(2号泳道)基因组DNA可以扩增出155bo的条带，其他品种基因组DNA扩增出180bp的条带。证明出只有IRBB27和两优8106含有Xa27基因。
<110> 南京农业大学
<120> 水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 水稻白叶枯病抗性基因Xa27的分子标记检测方法引物Xa27-F
<400> 1
gcgtattagc tttcattt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>水稻白叶枯病抗性基因Xa27的分子标记检测方法引物Xa27-R
<400> 2
agtcgtagtc aaccacaa 18

Claims (7)

1.水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记，其特征在于所述的分子标记的上游引物为Xa27-F：SEQ ID NO.1，下游引物为Xa27-R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为155bp。
2.权利要求1所述的水稻白叶枯抗性基因Xa27的分子标记引物，其特征在于所述的分子标记的上游引物为Xa27-F：SEQ ID NO.1，下游引物为Xa27-R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为155bp。
3.权利要求1所述的分子标记在鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27中的应用。
4.权利要求2所述的分子标记引物在鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27中的应用。
5.权利要求2所述的分子标记引物在鉴别抗白叶枯病水稻中的应用。
6.一种快速鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27存在与否的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组DNA；
(2)利用权利要求2所述的分子标记引物，对所述的水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出155bp的片段，证明Xa27的存在，如果扩增出180bp的片段，证明不含有Xa27基因。
7.根据权利要求6所述的快速鉴别水稻白叶枯抗性基因Xa27存在与否的方法，其特征在于PCR扩增的反应体系为：体积为50μl，其中10×含Mg2+的缓冲液5.0μl，4pmol/μl的所述的分子标记引物对2.0μl，10mM dNTP Mix 1.0μL，1U/μL DNA Polymerase 1.0μL，10ng/μl的水稻样品基因组模板DNA 1.0μl，加水至50μl；反应程序为：DNA 95℃预变性3分钟后；95℃变性15秒，48℃退火15秒，72℃延伸展30秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，取6μL扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离检测，如果扩增出155bp的片段，证明Xa27的存在，如果扩增出180bp的片段，证明不含有Xa27基因。
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