CN111996284B - 一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用 - Google Patents

一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用，属于分子生物学及作物育种技术领域。水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。本发明还提供了用于扩增分子标记的引物。所述分子标记或所述引物在水稻育种、水稻种质资源鉴定、鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa1基因型中的应用。使用该分子标记引物对待测水稻进行PCR扩增，若PCR产物经电泳检测为472bp条带则判定为含有白叶枯病抗性基因Xa1。本发明采用上述鉴定方法具有操作简单、鉴定周期短、检测通量高和成本低的优点。

Description

一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学及作物育种技术领域，具体涉及一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，随着世界人口数量的逐步增长，人类对水稻产量的需求在逐步提高，因此维持水稻的稳定生产和供给平衡是粮食安全的重要保证。白叶枯病是水稻的三大主要病害之一，严重的影响水稻产量和稻米品质。由于携带抗性基因差异，不同水稻品种对白叶枯病抗性反应表现各不相同。迄今为止，科学家已经先后从水稻资源中鉴定了38个白叶枯病抗性基因，并克隆了白叶枯病抗性基因Xa1、Xa3、Xa4、Xa5、Xa10、Xa13、Xa21、Xa23、Xa25、Xa27。实践证明，利用水稻自生的抗性基因是控制水稻白叶枯病最为经济有效的方式。
Xa1是比较早克隆的水稻白叶枯病抗性基因，具有对日本小种1和其它生理小种的抗性，编码一个含有NBS-LRR结构域的抗性蛋白。研究表明，不同于其他抗性基因，Xa1是一个诱导性表达基因，因此有望在协同抗病与产量平衡过程中起到一定的作用，故具有较大的生产应用潜力。随着分子生物学的不断发展，越来越多的水稻基因被相继克隆，部分基因由于存在明显的自然变异而得以在水稻育种中广泛利用。分子标记是借助实验手段快速鉴定基因型的一种方法，可用于品种资源基因型鉴定和辅助选择育种。尽管水稻白叶枯病抗性基因Xa1已经报道，但目前仍没有可用于快速鉴定其抗性基因型的分子标记，因此，开发Xa1特异性分子标记对于充分利用该基因，提高其在水稻种质资源中的鉴定效率，促进水稻分子标记辅助选择育种具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用，提高其在水稻种质资源中的鉴定效率，辅助水稻育种。
本发明提供了一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
本发明提供了一种用于扩增水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
本发明提供了所述分子标记或所述引物在辅助水稻育种中的应用。
本发明提供了所述分子标记或所述引物在水稻种质资源鉴定中的应用。
本发明提供了所述分子标记或所述引物在鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa1基因型中的应用。
本发明提供了一种鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa1基因型的方法，包括以下步骤：
1)利用所述引物对待测水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图中扩增条带的大小判断水稻的抗性：
当检测到472bp条带，则所述待测水稻样品含有Xa1抗病等位基因，具有抗水稻白叶枯病的特性。
优选的，所述PCR扩增的反应程序为94℃预变性4min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。
优选的，所述PCR扩增的反应体系为10μL，具体如下：10×PCR反应缓冲液1μL、DNA模板1μL、2.5mmol/L dNTP 1μL、5.0μmol/L上游引物1μL、5.0μmol/L下游引物1μL、Taq DNA聚合酶0.25μL和ddH2O 4.75μL。
优选的，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。
本发明提供的水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记，能准确区别携带和不携带水稻白叶枯病抗性基因Xa1的水稻品种，应用于水稻资源的抗性鉴定以及Xa1基因型鉴定中，可省去白叶枯病接种鉴定工作，实现分子水平的高通量鉴定。同时使鉴定工作具有操作简单，鉴定周期短，成本低的优点。
附图说明
图1为不同水稻品种白叶枯病抗性基因Xa1序列多重比对结果；
图2为在已知序列的水稻品种中验证Xa1抗性基因分子标记的表达情况；其中M：100bp DNA Ladder；1:IRBB1(Xa1抗性基因供体)；2：93-11；3：珍汕97(ZS97)；4：日本晴(NPB)；5：明恢63(MH63)；6：蜀恢498(R498)；
图3在水稻种质资源中检测Xa1抗性基因携带情况；其中M：100bp DNA Ladder；1：特特普；2：谷梅4号；3：光粒籼；4：shin2；5：丽江新团黑谷；6：台北309；7：广陆矮4号；8：龙粳31；9：中花11；10：Kasalath；11：三黄占2号；12：玉针香；13：黄华占；14：秀水11；15：金谷子；16：02428；17：Pokkali。
具体实施方式
本发明提供了一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No:3(CGCAATCAGTGGTTA)所示。所述分子标记位于抗性基因Xa1内部，长度为15bp。相对于抗性基因Xa1的全长序列，所述分子标记具有序列短、碱基差异明显的优点。同时，与其他不抗白叶枯病水稻品种携带的Xal对应位置的序列(ATCTATTGTT，SEQ ID No:4和tgccttcgttaaact，SEQ ID No:5)相比，本发明提供的分子标记具有序列差异性，且所述分子标记特在表征水稻白叶枯病抗性方面具有特异性。
本发明提供了一种用于扩增水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记的引物，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1(CACATCACGGCCTCAAGTATCT)所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2(TCTCCATAACCACTGATTGCG)所示。本发明对所述引物的合成方法没有特殊限制，委托本领域常见的引物合成公司即可。
本发明提供了所述分子标记或所述引物在水稻育种中的应用。本发明通过采用所述引物特异性扩增目标水稻品种，得到的扩增产物进行电泳检测或测序检测，得到所述分子标记或其条带，表明该目标水稻品种具有抗稻白叶枯病的抗病性，适合作为水稻育种的材料进行水稻育种。
本发明提供了所述分子标记或所述引物在水稻种质资源鉴定中的应用。本发明通过采用所述引物特异性扩增目标水稻品种，得到的扩增产物进行电泳检测，得到所述PCR产物条带，表明该目标水稻品种具有Xa1抗病等位基因，属于优良水稻种质资源。
本发明提供了所述分子标记或所述引物在鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa1基因型中的应用。本发明通过采用所述引物特异性扩增目标水稻品种，得到的扩增产物进行电泳检测，得到所述PCR产物条带，表明该目标水稻品种含有Xa1抗病等位基因。
本发明提供了一种鉴定抗水稻白叶枯病水稻的方法，包括以下步骤：
1)利用所述引物对待测水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图中扩增条带的大小判断水稻的抗性：
当检测到472bp条带，则所述待测水稻样品含有Xa1抗病等位基因，具有抗水稻白叶枯病的特性。
在本发明中，所述待测水稻样品基因组DNA的提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的常见提取方法即可，例如CTAB法或采用商品试剂盒提取。
在本发明中，所述PCR扩增的反应程序优选为94℃预变性4min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。
在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为10μL，具体如下：10×PCR反应缓冲液1μL、DNA模板1μL、2.5mmol/L dNTP 1μL、5.0μmol/L上游引物1μL、5.0μmol/L下游引物1μL、Taq DNA聚合酶0.25μL、ddH2O 4.75μL。
在本发明中，所述琼脂糖凝胶的质量浓度优选为2％。本发明对所述琼脂糖凝胶电泳的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的琼脂糖凝胶电泳方案即可。
在本发明中，采用所述分子标记能有效鉴别水稻白叶枯病抗性，以常见的水稻品种作为测试材料，结果表明，在水稻品种特特普、三黄占2号和Pokkali中检测到Xa1抗性基因，表明上述三种水稻品种具有抗水稻白叶枯病的抗性，而在其他品种中未检测到该抗性基因的存在。
下面结合实施例对本发明提供的一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
水稻白叶枯病抗性基因Xa1特异性分子标记的开发
(1)水稻白叶枯病抗性基因Xa1的序列获取
从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载Xa1基因序列(AB506464.1)，利用下载的Xa1基因序列在CRIPSR-GE(http://skl.scau.edu.cn/seqdownload/)网站进行序列检索，获取水稻品种NPB、93-11、明恢63、ZS97、蜀恢498的Xa1基因序列。
(2)Xa1基因序列比对和特异性分子标记开发
将下载的标准序列整理至同一个文件中，使用多重序列比对程序MUSCLE进行序列比对，寻找Xa1基因特异性核苷酸位点。在Xa1编码区鉴定到一段水稻IRBB1特有的序列标记(图1中方框所示)，并据此设计一对只能与IRBB1序列匹配，不能与其他标准品种序列匹配的引物，其序列为：
SEQ ID NO：1 CACATCACGGCCTCAAGTATCT；
SEQ ID NO：2 TCTCCATAACCACTGATTGCG。
实施例2
水稻白叶枯病抗性基因Xa1分子标记的特异性验证
(1)供试水稻材料：IRBB1，93-11，珍汕97，日本晴，明恢63和蜀恢498。
(2)基因组DNA提取：采用简化CTAB法进行供试材料基因组DNA抽提，具体步为：剪取水稻叶片2～5cm置于2.0mL离心管中，加入1粒钢珠和750mL CTAB提取液；使用植物研磨仪打碎叶片；65℃水浴30min；在通风橱中加入750mL氯仿：异戊醇(体积比为24:1)溶液，并上下翻转混匀；12000rpm离心8min；取500mL上清液转移至新的1.5mL离心管；加入等体积异丙醇溶液并混匀；放入冰箱冷冻沉淀20min；12000rpm离心6min；弃上清，使用70％乙醇洗涤DNA两次，真空浓缩仪抽干残留液体；加入200mL超纯水溶解DNA。
(3)PCR扩增：反应采用rTaq酶(Takara)10μL体系，具体过程为在冰上按顺序加入各组分：
Figure BDA0002699276630000061
瞬时离心收集液体于管底，加入10μL石蜡油并再次离心至管底，立即上机反应。PCR反应程序为：94℃预变性4min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存。
(4)琼脂糖凝胶电泳反应：制备2％琼脂糖凝胶，放入水平电泳槽中，加入0.5％TBE缓冲液。向PCR产物中加入2μL 10×GelRed荧光染料，低速离心混匀后取3μL产物上样电泳。使用凝胶成像系统进行凝胶图像采集并分析条带大小。
(5)对6个已知序列且抗水稻白叶枯病特性已知的标准品种进行Xa1分子标记扩增表明，仅IRBB1能够有效扩增472bp片段，所检测的所有实验材料中仅仅IRBB1品种具有水稻白叶枯病特性，由于水稻中抗水稻白叶枯病的表型由多个基因共同决定，因此说明本发明提供的分子标记可以有效鉴别水稻白叶枯病抗性基因Xa1等位基因(图2)。
实施例3
水稻种质资源中Xa1基因鉴定
供试材料：特特普、谷梅4号、光粒籼、shin2、丽江新团黑谷、台北309、广陆矮4号、龙粳31、中花11、Kasalath、三黄占2号、玉针香、黄华占、秀水11、金谷子、02428和Pokkali。
按照实施例1的方法使用Xa1分子标记引物对供试材料进行PCR扩增，通过凝胶电泳检测扩增片段大小。
结果表明，在水稻品种特特普、三黄占2号和Pokkali(该三个品种均具有抗水稻白叶枯病的表型)中检测到Xa1抗性基因，在其他品种中未检测到该抗性基因的存在(图3)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记、扩增引物及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacatcacgg cctcaagtat ct 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctccataac cactgattgc g 21
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcaatcagt ggtta 15
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atctattgtt 10
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccttcgtt aaact 15

Claims (9)

1.一种水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。
2.一种用于扩增水稻白叶枯病抗性基因Xa1的分子标记的引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。
3.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物在辅助水稻育种中的应用。
4.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物在水稻种质资源鉴定中的应用。
5.权利要求1所述分子标记或权利要求2所述引物在鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa1基因型中的应用。
6.一种鉴定水稻白叶枯病抗性基因Xa1基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)利用权利要求2所述引物对待测水稻样品基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；
2)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图中扩增条带的大小判断水稻的抗性：
当检测到472bp条带，则所述待测水稻样品含有Xa1抗病等位基因。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为94℃预变性4min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。
8.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为10μL，具体如下：10×PCR反应缓冲液1μL、DNA模板1μL、2.5mmol/L dNTP 1μL、5.0μmol/L上游引物1μL、5.0μmol/L下游引物1μL、Taq DNA聚合酶0.25μL和ddH2O 4.75μL。
9.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。
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