CN103103270A - 检测控制水稻耐盐等位基因的特异性pcr分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了检测水稻品种Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因SKC1的1个特异性PCR标记：Fir11466以及DST的3个特异性PCR标记：Th32637、Th32638和Th32639，特征在于其PCR引物。利用这4个标记对水稻苗期所提取的DNA进行鉴定，可以检测待测材料是否携带水稻品种Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因SKC1以及DST。整个检测过程操作简单且准确性高。

Description

检测控制水稻耐盐等位基因的特异性PCR分子标记

技术领域

本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，特别是检测耐盐籼稻品种Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因SKC1和DST的特异性PCR分子标记。

背景技术

土壤的盐渍化是限制农作物生长，造成作物减产最严重的非生物胁迫之一。水稻在盐渍地种植一般都会减产，严重时甚至不能完成生活史。通过遗传改良提高水稻的抗逆性是解决这一农业问题的最有效途径之一。

水稻耐盐性属于数量性状遗传，受多基因的控制。目前已有2个耐盐基因获得克隆，分别为SKC1和DST，其中SKC1耐盐等位基因来自耐盐籼稻品种Nona Bokra，DST耐盐等位基因来自中花11的EMS突变体dst，用于基因定位的另一个亲本越光和中花11则属于盐敏感粳稻品种。在已发表的定位研究中，虽然有发展的分子标记位于SKC1基因内部或临界，但这些标记属于扩增片段酶切长度多态性（CAPS）标记，需要在PCR之后再进行限制性内切酶酶切，整个过程较繁琐，另外的SSR标记则离基因有一定的距离。为了更方便、可靠地检测耐盐等位基因，以适用于水稻分子辅助育种，有必要发展操作更为简便、快速的特异分子标记。

本发明针对SKC1和DST基因，根据已公布的粳稻日本晴和籼稻9311全基因组测序结果，在基因及其5'上游和3'下游区域设计插入/缺失（InDel）标记，从中挑选出扩增效果好、且可特异性鉴定Nona Bokra等位基因的标记。本发明提供的分子标记对Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因SKC1和DST的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因SKC1和DST的转育研究中。

发明内容

本发明解决的技术问题是设计和开发4个检测耐盐籼稻品种Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因SKC1和DST的特异性分子标记。申请人将这4个分子标记分别命名为Fir11466、Th32637、Th32638和Th32639，所述片段如序列表SEQ ID NO:1-8所示。

具体地，本发明设计开发的4个分子标记的核苷酸序列如下：

Fir11466的的上游引物序列为5'- GCTTCCCAATAATTTCGACCT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示。

Fir11466的下游引物序列为5'- CCCACCAATACTAAAGATCCTG-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示。

Th32637的上游引物序列为5'- TCGTATAGTAGGCTTTCATGGC-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示。

Th32637的下游引物序列为5'- TTTCACAGGTGCGAGAGCTT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示。

Th32638的的上游引物序列为5'- AGAGAAGCCAAGAAATCGAC-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示。

Th32638的下游引物序列为5'- TCCAAGCTCCACCTACTCC-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:6所示。

Th32639的的上游引物序列为5'- CTATTTGGCTTCGCAAGGACA-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:7所示。

Th32639的下游引物序列为5'- CGCCCACTTTAATCATATTCCCT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:8所示。

本发明采用以下技术方案：根据已公布的粳稻品种日本晴和籼稻品种9311基因组序列，对SKC1和DST基因及其5'上游和3'下游区域进行序列比对，挑选具有InDel差异的基因组区域，应用Oligo 7.0软件，设计出21个InDel标记。将这21个InDel标记应用于日本晴和9311进行多态性验证，并进一步应用耐盐籼稻品种Nona Bokra和盐敏感粳稻品种越光、中花11以及盐敏感籼稻品种IR64、特青，筛选出4个扩增效果好、特异性高，且在水稻耐盐品种Nona Bokra中检测到特异片段的标记。这4个标记可用于鉴定待测材料是否在SKC1和DST座位上携带水稻耐盐品种Nona Bokra控制水稻耐盐等位基因，进而鉴定待测材料是否具有耐盐能力。

附图说明

图1为 7个水稻品种分子标记Fir11466的检测结果图。

图2为 7个水稻品种分子标记Th32638的检测结果图。

图3为 7个水稻品种分子标记Th32637的检测结果图。

图4为 7个水稻品种分子标记Th32639的检测结果图。

其中，M：DNA分子量标准；1：水；2：Nona Bokra；3：越光；4：中花11；5：日本晴；6:9311；7：IR64；8：特青。

具体实施方式

根据已公布的日本晴和9311的基因组序列，对位于第1染色体的SKC1基因及其5'上游和3'下游区域以及位于第3染色体的DST基因及其5'上游和3'下游区域进行比对，挑选具有InDel差异、PCR产物长度大约在100-500 bp的片段进行分子标记开发，引物设计软件为Oligo 7.0（Lasergene公司）。设计了21个InDel标记。应用下述步骤检测日本晴和9311以及已报道的耐盐籼稻品种Nona Bokra和盐敏感粳稻品种越光、中花11和盐敏感籼稻品种IR64、特青，筛选出在Nona Bokra检测到特异片段的分子标记4个。

1. DNA微量提取

（1）剪取水稻幼苗叶片2～3 cm，剪成0.5 cm长的碎片，放入2.0 mL离心管中。

（2）加入450 μL DNA提取液和一颗钢珠，应用组织研磨仪进行研磨。

（3）加入450 μL氯仿萃取液，盖紧盖子，上下颠倒混匀。

（4）11,000 rpm离心2分钟至清晰分相。吸取上清液400 μL，转入新的1.5 ml离心管中，弃枪头。

（5）加入800 μL预冷的无水乙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀。-20℃放置30分钟。

（6）11,000 rpm离心3分钟至沉淀附于离心管底部，弃上清液。

（7）用70％乙醇洗涤沉淀2遍，将1.5 ml离心管倒置于纸上，自然干燥。

（8）加入50 μL的1/10×TE缓冲液溶解沉淀。

（9）取1μL进行PCR扩增。

2. PCR扩增

反应体系如下：Tris-HCL（pH 8.8）33.5 mM，(NH₄)₂SO₄ 8.0 mM，MgCl₂ 1.5 mM， TWEEN-20 0.05%， dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各3.3 ng/μL， Taq DNA聚合酶0.5单位；1μL DNA，总体积10μl。

扩增条件如下：94℃ 2分钟；94℃ 45秒，50℃（或55℃） 45秒，72℃ 1分钟，30循环；72℃ 8分钟；10℃ 10分钟。其中，Fir11466和Th32639的退火温度为50℃，其余的退火温度为55℃。

3. PCR产物检测

扩增产物中加入加样缓冲液，标记Fir11466、Th32637和Th32638的样品取2 μl上样于6%非变性聚丙烯酰胺胶；接通电极，在120V恒定电压下电泳4-5小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色。标记Th32639的样品取4 μl上样于1.5%的琼脂糖凝胶，在100V恒定电压下电泳1.5小时，进行染色和凝胶成像。

如图1所示，所筛选出的4个InDel标记能将Nona Bokra和其他材料区别开：Nona Bokra呈现特异带型，其余6个水稻品种则呈现不同的带型。

<110> 中国水稻研究所

<120>检测控制水稻耐盐等位基因的特异性PCR分子标记

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 1

gcttcccaat aatttcgacc t                                                21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 2

cccaccaata ctaaagatcc tg                                               22

 

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 3

tcgtatagta ggctttcatg gc                                               22

　

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 4

tttcacaggt gcgagagctt                                                  20

 

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 5

agagaagcca agaaatcgac                                                  20

 

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 6

tccaagctcc acctactcc                                                   19

　

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 7

ctatttggct tcgcaaggac a                                                21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativaL.）

<400> 8

cgcccacttt aatcatattc cct                                              23

 

 

Claims (2)

1.检测水稻品种控制水稻耐盐等位基因的特异性PCR分子标记，包含1个特异性标记Fir11466的引物各一对，

Fir11466的的上游引物序列为5'- GCTTCCCAATAATTTCGACCT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:1所示；

Fir11466的下游引物序列为5'- CCCACCAATACTAAAGATCCTG-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:2所示。

2.检测水稻品种控制水稻耐盐等位基因的特异性PCR分子标记，包含3个特异性标记Th32637、Th32638和Th32639的引物各一对，

Th32637的上游引物序列为5'- TCGTATAGTAGGCTTTCATGGC-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:3所示；

Th32637的下游引物序列为5'- TTTCACAGGTGCGAGAGCTT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:4所示；

Th32638的的上游引物序列为5'- AGAGAAGCCAAGAAATCGAC-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:5所示；

Th32638的下游引物序列为5'- TCCAAGCTCCACCTACTCC-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:6所示；

Th32639的的上游引物序列为5'- CTATTTGGCTTCGCAAGGACA-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:7所示；

Th32639的下游引物序列为5'- CGCCCACTTTAATCATATTCCCT-3'，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID No:8所示。

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