CN111826462A - 与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用 - Google Patents

与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用，在西伯利亚杏的6号染色体中存在与西伯利亚杏花期早晚相关7个SNP标记，设计与检测西伯利亚杏花期早晚的6对引物，通过6对引物进行PCR扩增，检测西伯利亚杏的6号染色体中与西伯利亚杏花期早晚相关的标记位点，并测序标记位点的基因型，从而判定西伯利亚杏花期早晚。通过对我国西伯利亚杏的全基因组关联分析发现位点与西伯利亚杏开花期早晚显著相关，并进一步针对该位点开发标记，提供检测西伯利亚杏开花期早晚的方法及专用引物，本发明提供的引物可以特异检测西伯利亚杏中位点的基因型,也可以作为不同花期育种中的标记辅助选择的新工具，具有非常重要的积极意义。

Description

与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域。具体地说是与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用。
背景技术
西伯利亚杏是一种多年生核果树种，其广泛分布于中国北部和西北部，蒙古的西部和西南部，西伯利亚的西部和俄罗斯的沿海等地。西伯利亚杏适应性强，是一种集生态价值和经济价值于一身的优良生态兼经济树种。西伯利亚果仁中脂肪、蛋白质及苦杏仁苷含量丰富，杏仁可以入药，也可以榨油或加工成食品与饮料，是中国传统的出口物资之一。但西伯利亚杏产量不稳定，多受天气状况的影响：早春的大风和低温影响蜜蜂的活动和授粉情况，霜冻也会减少花芽，花和幼果的数量。因此，晚花性状是西伯利亚杏的重要育种目标，鉴定晚花性状紧密相关的分子标记和基因，通过分子育种手段针对性选育晚花性状，开发一种早期检测西伯利亚杏花期的分子标记，可为西伯利亚杏在分子鉴定和辅助育种等方面提供有力的技术支持，具有重要的理论和应用价值。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可以特异检测西伯利亚杏中位点的基因型的与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，在西伯利亚杏的6号染色体中存在与西伯利亚杏花期早晚相关7个SNP标记，分别为
Ps-FT-SNP1：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18103769位点；
Ps-FT-SNP2：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18103787位点；
Ps-FT-SNP3：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18104140位点；
Ps-FT-SNP4：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18105050位点；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18106369位点；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18106638位点；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18107219位点。
上述与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，Ps-FT-SNP1：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18103769位点的突变基因为G/A；
Ps-FT-SNP2：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18103787位点的突变基因为G/A；
Ps-FT-SNP3：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18104140位点的突变基因为T/A；
Ps-FT-SNP4：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18105050位点的突变基因为T/G；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18106369位点的突变基因为G/A；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18106638位点的突变基因为T/C；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18107219位点的突变基因为C/T。
上述与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，
Ps-FT-SNP1：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18103605-18103831的自5'末端起的第165位碱基上，片段长度为227bp；
Ps-FT-SNP2：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18103605-18103831的自5'末端起的第183位碱基上，片段长度为227bp；
Ps-FT-SNP3：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18104056-18104213的自5'末端起的第85位碱基上，片段长度为158bp；
Ps-FT-SNP4：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18104977-18105174的自5'末端起的第74位碱基上，片段长度为198bp；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18106219-18106437的自5'末端起的第151位碱基上，片段长度为219bp；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18106550-18106789的自5'末端起的第89位碱基上，片段长度为240bp；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18107035-18107421的自5'末端起的第185位碱基上，片段长度为387bp。
上述与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，
Ps-FT-SNP1：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段 18103605-18103831的自5'末端起的第165位的碱基为G，则判定Ps-FT-SNP1 位点的基因型为GG；若第165位的碱基为G或A，则判定Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；
Ps-FT-SNP2：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段 18103605-18103831的自5'末端起的第183位的碱基为G，则判定Ps-FT-SNP2 位点的基因型为GG；若第183位的碱基为G或A，则判定Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA或AA；
Ps-FT-SNP3：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段 18104056-18104213的自5'末端起的第85位碱基为T，则判定Ps-FT-SNP3 位点的基因型为TT；若第85位的碱基为T或A，则判定Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA；
Ps-FT-SNP4：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18104977-18105174的自5'末端起的第74位碱基为T，则判定Ps-FT-SNP4 位点的基因型为TT；若第74位的碱基为T或G，则判定Ps-FT-SNP4位点的基因型为TG或GG；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18106219-18106437 的自5'末端起的第151位碱基为G，则判定Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若第151位的碱基为G或A，则判定Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18106550-18106789 的自5'末端起的第89位碱基为T，则判定Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若第89位的碱基为T或C，则判定Ps-FT-SNP6位点的基因型为TC或CC；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18107035-18107421 的自5'末端起的第185位碱基上为C，则判定Ps-FT-SNP7位点的基因型为 CC；若第185位的碱基为C或T，则判定Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT 或TT。
与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测引物，包括6对引物，
Primer1的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:1和SQE ID NO:2；
Primer2的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:3和SQE ID NO:4；
Primer3的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:5和SQE ID NO:6；
Primer4的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:7和SQE ID NO:8；
Primer5的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:9和SQE ID NO:10；
Primer6的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:11和SQE ID NO:12。
与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，利用上述6对引物通过PCR 扩增，检测西伯利亚杏的6号染色体中是否有上述标记位点，并测序检测上述标记位点的基因型；具体包括如下步骤：
(1)提取基因组DNA：以西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组 DNA；
(2)进行PCR扩增：以提取的西伯利亚杏DNA为模板，利用引物对Primer1-Primer 6分别进行PCR产物扩增，得到扩增产物；
(3)PCR产物回收：使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收PCR产物；
(4)进行一代测序，判定西伯利亚杏开花期早晚。
上述与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，在步骤(2)中：
反应体系为25μL，包括：
12.5μL的2×Taq PCR Mix(kemix)，
0.5μl的待检测DNA，
权利要求5所述的6对引物中的任一一对引物：0.5μL的正向引物，浓度为10μmol/L；0.5μl的反向引物，浓度10μmol/L，
11μL的DNase/RNase-Free water(Solarbio)；
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存；
反应结束后瞬时离心，取2μL进行1.0％琼脂糖1×TAE电泳检测是否扩增出目的片段；
PCR产物的凝胶电泳图显示，获得含有与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记的片段，分别为：
若加入引物为Primer1，则得到长度为227bp的含Ps-FT-SNP1和 Ps-FT-SNP2标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18103605-18103831，
若加入引物为Primer2，则得到长度为158bp的含Ps-FT-SNP3标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18104056-18104213，
若加入引物为Primer3，则得到长度为198bp的含Ps-FT-SNP4标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18104977-18105174，
若加入引物为Primer4，则得到长度为219bp的含Ps-FT-SNP5标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18106219-18106437，
若加入引物为Primer5，则得到长度为240bp的含Ps-FT-SNP6标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18106550-18106789，
若加入引物为Primer6，则得到长度为387bp的含Ps-FT-SNP7标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18107035-18107421。
上述与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，在步骤(4)中：
若使用Primer1进行PCR扩增，Primer1检测得到的PCR产物的序列长度为227bp，若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；
若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA 或AA；
若使用Primer2进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，Primer2检测得到的PCR产物的序列长度为158bp，若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T或A，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA；
若使用Primer3进行PCR扩增，Primer3检测得到的PCR产物的序列长度为198bp，若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第 74位碱基为T或G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为 TG或GG
若使用Primer4进行PCR扩增，Primer4检测得到的PCR产物的序列长度为219bp，若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA；
若使用Primer5进行PCR扩增，Primer5检测得到的PCR产物的序列长度为240bp，若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第 89位碱基为T或C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为 TC或CC；
若使用Primer6进行PCR扩增，Primer6检测得到的PCR产物的序列长度为387bp，若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CC；若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C或T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT或TT。
上述与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，将步骤(4)得到的测序结果，与参考序列进行比对，判定西伯利亚杏的花期：
若Ps-FT-SNP1的基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP1的基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP2基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP2基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP3的基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP3的基因型为TA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP4基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP4基因型为TG或GG，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP5基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP5基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP6基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP6基因型为TC或CC，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP7基因型为CC，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP7基因型为CT或TT，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
西伯利亚杏开花期早晚相关的标记的应用，利用西伯利亚杏开花期早晚相关的标记判定待测西伯利亚杏开花期早晚。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
通过对我国西伯利亚杏的全基因组关联分析发现位点与西伯利亚杏开花期早晚显著相关，并进一步针对该位点开发标记，提供了一种检测西伯利亚杏开花期早晚的方法及专用引物，经实验证明，本发明提供的引物可以特异检测西伯利亚杏中位点的基因型,也可以作为不同花期育种中的标记辅助选择的新工具，具有非常重要的积极意义。
具体实施方式
第一部分、与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记的确定
以西伯利亚杏(Prunus sibirica L.)编号F106基因组数据为模板，采用 66份西伯利亚杏，包括23份早花，43份晚花为材料，做全基因组关联分析，根据样品的早晚花性状与SNP位点的基因型，获得SNP位点的基因分型与性状的表型变异解释率，筛选出分型较好的变异解释率在88％-94％的位于6 号染色体与西伯利亚杏花期早晚相关的7个SNP标记。具体材料及基因型见表1，SNP位点的表型变异解释率见表2。
表1：
Figure BDA0002644504760000091
Figure BDA0002644504760000101
表2：
SNP 表型变异解释率
Ps-FT-SNP1 0.94％
Ps-FT-SNP2 0.94％
Ps-FT-SNP3 0.92％
Ps-FT-SNP4 0.88％
Ps-FT-SNP5 0.94％
Ps-FT-SNP6 0.94％
Ps-FT-SNP7 0.94％
第二部分、检测引物的确定
用Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3)在线预测引物对1-6；引物对 1-6的PCR产物预计长度为seq1：227bp，seq2：158bp，seq3：198bp，seq4： 219bp，seq5：240bp，seq6：387bp。
得到6对引物对，分别为：
Primer1:
F:TTTCACCGTACAAGCTCTGC
R:AAATGGCATCAGAACCGACG
Primer2:
F:AACAGACATGCATGCAGACA
R:CTGCAGCAGGATTTTGGAGT
Primer3:
F:CGCACACTCTCTCCAAAACA
R:GCACCATTAGTCCCTACGGT
Primer4:
F:GTGTTGGTGGTGTAGGCTTG
R:TGAGAGGTCAGAGTGTTGCC
Primer5:
F:GGCTTGGCATCCGATACATG
R:AAAACAACCCACCACAACGT
Primer6:
F:CCAAATTGGCATGTGTCGGA
R:CAAAGACATGCGATTCGGGA
上述引物对Primer1-Primer6的设计基于与西伯利亚杏花期早晚相关7个单核苷酸多态性的分子标记(SNP)。其基本位置及碱基突变情况见表3，引物检测情况见表4。
表3：
Figure BDA0002644504760000111
Figure BDA0002644504760000121
表4：
Figure BDA0002644504760000122
可利用上述6对引物通过简单的PCR，检测西伯利亚杏在6号染色体上是否含有上述SNP位点，并测序检测这些SNP位点的基因型。
第三部分、检测方法
(1)提取基因组DNA：西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组DNA。
(2)PCR扩增：以提取的西伯利亚杏DNA为模板，利用引物对1-6 分别进行PCR产物扩增，得到扩增产物。
上述PCR扩增的反应体系25μL(含有引物对的PCR体系)，在一0.2mL 的Eppendorf管中加入以下各种成分建立PCR反应体系(按25μl计算)： 12.5μL的2×Taq PCR Mix(kemix)，
0.5μl的DNA，0.5μl的F引物(10μmol/L)，0.5μl的R引物(10μmol/L)， 11μL的DNase/RNase-Free water(Solarbio)。
上述反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存。
结束后瞬时离心，取2μl进行1.0％琼脂糖1×TAE电泳检测是否扩增出目的片段。
PCR产物的凝胶电泳图显示，获得片段长度分别为227bp，158bp，198bp， 219bp，240bp，387bp的产物。
(3)PCR产物回收使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(天根生化科技(北京)有限公司)回收PCR产物。进行一代测序。
测序的结果如下：
使用引物对1进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，Primer1检测得到的PCR产物的序列长度为227bp，若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；若位于该序列自5’端起的第183 位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA或AA。
Length＝227bp
n为G或A
TTTCACCGTACAAGCTCTGCCTGGGCGCCATGTGTCGACATCTGATACTT GTCTCTGGGAAAAGGCTAGACTATGCTAGTTGATGATGAATAAAAAAGG GATGCTTGGGCACACGAGTGGTGTCTGGGGTGGAACACAACATCGTGC GTGGCTATTGTCCCTATnGGAGACACACAGGCCAGnGCCTATGTGTTTCTCCATCGGACACGTCGGTTCTGATGCCATTT
使用引物对2进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，Primer2检测得到的PCR产物的序列长度为158bp，若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T或A，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA。
Length＝158bp
n为T或A
AACAGACATGCATGCAGACATTGTTAAGAAAGAAAGACAATAAAAGCAT AGATTTAGGCGAAGAACACGGAATCACTTTTGGATnGAGAAAAGGGTTT CTTTATACTTGGATTTTTGTTCTGTTTCAGAGCATCTCTAACTCCAAAATC CTGCTGCAG
使用引物对3进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，Primer3检测得到的PCR产物的序列长度为198bp，若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T或G，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP4位点的基因型为TG或GG。
Length＝198bp
n为T或G
CGCACACTCTCTCCAAAACACAAAACAATGGGAGAAATCTGAAAACTG GTTAAGCATTCCATGGTATGTGTTTnAAAAAACTTAAAGTATTGAGAGAG CAATTGACTATAAGACATTAATTCAGCCCCCATTTTGGTGTTTTAGTGAA ACTCCCTTATTTTCTTGGGTTATTTTCTTGACCGTAGGGACTAATGGTGC
使用引物对4进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，Primer4检测得到的PCR产物的序列长度为219bp，若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA。
Length＝219bp
n为G或A
GTGTTGGTGGTGTAGGCTTGGAGTTTACTGGTGGTTGGCTTCTACGAGTT CTTGGCTTAAATGGATATGTTGCTTTCTAGGACCCTTGGTGTTGGGCATG ATTTTCAATGGATAGGGTTGTTGGTTGCAATCTATGTTCCCATCTCTCCAn GTAATTTTGTGGTGGGGATTTGACATTTAGGTGGTGTTAGAGCCTTCGGGCAACACTCTGACCTCTCA
使用引物对5进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，Primer5检测得到的PCR产物的序列长度为240bp，若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T或C，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP6位点的基因型为TC或CC。
Length＝240bp
n为T或C
GGCTTGGCATCCGATACATGTTCATACTATGATGCCCTTCCATTAGAAGTT CGTCACGCTAAGAGGCCAATATGGATCCCCCATGGCCnGTCGAGTAAGG GTCTAGATTAAGATTCATGGAGTTGGTATTGGTACTTATGCTGGATATGCT TTGACACTCATAACACATTGTTATGTACATCGAACTATCCATGCATAGGAG TTTTTCTTTGACAGTCTTACGTTGTGGTGGGTTGTTT
使用引物对6进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，Primer6检测得到的PCR产物的序列长度为387bp，若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CC；若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C或T，则判定待测西伯利亚杏的 Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT或TT。
Length＝387bp
n为C或T
CCAAATTGGCATGTGTCGGACTCTCTTGTTAGTCCAAGACATGTGTTGTA TTCTTTCCTACCATGGGGTTTGTCCCATGTGATTTTCCTATAAAGGTTTTA ATAAGGCCGTTGTTTCGTGCCCGTCTTTGTATGTCTCTTTGGATTATGAAT GAAATCCTTTTCTAAAACTATCATTGACATTAnGTGCCCATTAAAACTATC AATTACTTTAGCCTTTCTAGTATAAAGAGTAGCTCAAAATATGCACTTGTA GTCATTTTAATATTATTAATGAGTAATGGAAAAGACAAATCAGCAATTAGT CTAATGTTACTTCTCTTCTTAACATTCCGTATCCTATTGGCAAACATAAGTTATAAGCTTAATCCCGAATCGCATGTCTTTG
第五部分、测序结果的应用
若Ps-FT-SNP1的基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP1的基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花.
若Ps-FT-SNP2基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP2基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
若Ps-FT-SNP3的基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP3的基因型为TA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
若Ps-FT-SNP4基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP4基因型为TG或GG，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
若Ps-FT-SNP5基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP5基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
若Ps-FT-SNP6基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP6基因型为TC或CC，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
若Ps-FT-SNP7基因型为CC，则判定待测西伯利亚杏为早花，若 Ps-FT-SNP7基因型为CT或TT，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
第六部分验证Ps-FT-SNP1-Ps-FT-SNP7标记位点基因型的可靠性
为了验证标记Ps-FT-SNP1-Ps-FT-SNP7，18103769，18103787，18104140，18105050，18106369，18106638，18107219位点的基因型与西伯利亚杏花期早晚的相关性的可靠性。
对12份西伯利亚杏品种进行开花时间的调查，如图表5所示，田间试验于2018年在中国林科院经济林研究开发中心原阳试验基地，仁用杏国家种质资源库进行，西伯利亚杏树龄6年。
表5：
样品 位置 2017年花期
万家沟15 11行-第4号 3月22日
巴林右旗24 31行-第13号 3月22日
科右45 32行-第12号 3月22日
科左33 27行-第5号 3月22日
克什克腾22 24行-第12号 3月22日
万家沟17 23行-第10号 3月19日
山杏3号 32行-第9号 3月13日
科左38 26行-第14号 3月14日
敖汉旗03 13行-第14号 3月15日
扎鲁特08 26行-第11号 3月15日
乌拉山08 23行-第12号 3月13日
克什克腾05 21行-第9号 3月15日
利用引物对Primer1-Primer6检测表5中的12份西伯利亚杏 Ps-FT-SNP1-7位点的基因型结果如表6。
表6：
Figure BDA0002644504760000161
Figure BDA0002644504760000171
表6结果说明，12个西伯利亚杏样品中，只有样品“敖汉旗03”的 Ps-FT-SNP4位点基因型与表型不相符，说明引物对1-6对检测西伯利亚杏的早晚花性状准确可用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
序列表
<110> 国家林业和草原局泡桐研究开发中心
<120> 与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记及其检测引物、方法与应用
<141> 2020-08-21
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttcaccgta caagctctgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatggcatc agaaccgacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacagacatg catgcagaca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcagcagg attttggagt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgcacactct ctccaaaaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaccattag tccctacggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgttggtgg tgtaggcttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgagaggtca gagtgttgcc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcttggcat ccgatacatg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaaacaaccc accacaacgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccaaattggc atgtgtcgga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaagacatg cgattcggga 20

Claims (10)

1.与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，其特征在于，在西伯利亚杏的6号染色体中存在与西伯利亚杏花期早晚相关7个SNP标记，分别为
Ps-FT-SNP1：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18103769位点；
Ps-FT-SNP2：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18103787位点；
Ps-FT-SNP3：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18104140位点；
Ps-FT-SNP4：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18105050位点；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18106369位点；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18106638位点；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18107219位点。
2.根据权利要求1所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，其特征在于，Ps-FT-SNP1：位于西伯利亚杏的6号染色体上的第18103769位点的突变基因为G/A；
Ps-FT-SNP2：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18103787位点的突变基因为G/A；
Ps-FT-SNP3：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18104140位点的突变基因为T/A；
Ps-FT-SNP4：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18105050位点的突变基因为T/G；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18106369位点的突变基因为G/A；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18106638位点的突变基因为T/C；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体的上第18107219位点的突变基因为C/T。
3.根据权利要求1所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，其特征在于，
Ps-FT-SNP1：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18103605-18103831的自5'末端起的第165位碱基上，片段长度为227bp；
Ps-FT-SNP2：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18103605-18103831的自5'末端起的第183位碱基上，片段长度为227bp；
Ps-FT-SNP3：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18104056-18104213的自5'末端起的第85位碱基上，片段长度为158bp；
Ps-FT-SNP4：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18104977-18105174的自5'末端起的第74位碱基上，片段长度为198bp；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18106219-18106437的自5'末端起的第151位碱基上，片段长度为219bp；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18106550-18106789的自5'末端起的第89位碱基上，片段长度为240bp；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体片段18107035-18107421的自5'末端起的第185位碱基上，片段长度为387bp。
4.根据权利要求3所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记，其特征在于，
Ps-FT-SNP1：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18103605-18103831的自5'末端起的第165位的碱基为G，则判定Ps-FT-SNP1位点的基因型为GG；若第165位的碱基为G或A，则判定Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；
Ps-FT-SNP2：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18103605-18103831的自5'末端起的第183位的碱基为G，则判定Ps-FT-SNP2位点的基因型为GG；若第183位的碱基为G或A，则判定Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA或AA；
Ps-FT-SNP3：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18104056-18104213的自5'末端起的第85位碱基为T，则判定Ps-FT-SNP3位点的基因型为TT；若第85位的碱基为T或A，则判定Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA；
Ps-FT-SNP4：若位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18104977-18105174的自5'末端起的第74位碱基为T，则判定Ps-FT-SNP4位点的基因型为TT；若第74位的碱基为T或G，则判定Ps-FT-SNP4位点的基因型为TG或GG；
Ps-FT-SNP5：位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18106219-18106437的自5'末端起的第151位碱基为G，则判定Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若第151位的碱基为G或A，则判定Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA；
Ps-FT-SNP6：位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18106550-18106789的自5'末端起的第89位碱基为T，则判定Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若第89位的碱基为T或C，则判定Ps-FT-SNP6位点的基因型为TC或CC；
Ps-FT-SNP7：位于西伯利亚杏的6号染色体的片段18107035-18107421的自5'末端起的第185位碱基上为C，则判定Ps-FT-SNP7位点的基因型为CC；若第185位的碱基为C或T，则判定Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT或TT。
5.与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测引物，其特征在于，包括6对引物，Primer1的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:1和SQE ID NO:2；Primer2的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:3和SQE ID NO:4；Primer3的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:5和SQE ID NO:6；Primer4的正向引物和反向引物的序列分别为SQE IDNO:7和SQE ID NO:8；Primer5的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:9和SQE IDNO:10；Primer6的正向引物和反向引物的序列分别为SQE ID NO:11和SQE ID NO:12。
6.与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，其特征在于，利用权利要求5所述的6对引物通过PCR扩增，检测西伯利亚杏的6号染色体中是否有权利要求1和3所述的标记位点，并测序检测权利要求2和4所述的标记位点的基因型；具体包括如下步骤：
(1)提取基因组DNA：以西伯利亚杏材料为检测样品，提取基因组DNA；
(2)进行PCR扩增：以提取的西伯利亚杏DNA为模板，利用引物对Primer1-Primer 6分别进行PCR产物扩增，得到扩增产物；
(3)PCR产物回收：使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收PCR产物；
(4)进行一代测序，判定西伯利亚杏开花期早晚。
7.根据权利要求6所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关检测方法，其特征在于，在步骤(2)中：
反应体系为25μL，包括：
12.5μL的2×Taq PCR Mix(kemix)，
0.5μl的待检测DNA，
权利要求5所述的6对引物中的任一一对引物：0.5μL的正向引物，浓度为10μmol/L；0.5μl的反向引物，浓度10μmol/L，
11μL的DNase/RNase-Free water(Solarbio)；
反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃总延伸6min；最后于4℃保存；
反应结束后瞬时离心，取2μL进行1.0％琼脂糖1×TAE电泳检测是否扩增出目的片段；
PCR产物的凝胶电泳图显示，获得含有与西伯利亚杏开花期早晚相关的标记的片段，分别为：
若加入引物为Primer1，则得到长度为227bp的含Ps-FT-SNP1和Ps-FT-SNP2标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18103605-18103831，
若加入引物为Primer2，则得到长度为158bp的含Ps-FT-SNP3标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18104056-18104213，
若加入引物为Primer3，则得到长度为198bp的含Ps-FT-SNP4标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18104977-18105174，
若加入引物为Primer4，则得到长度为219bp的含Ps-FT-SNP5标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18106219-18106437，
若加入引物为Primer5，则得到长度为240bp的含Ps-FT-SNP6标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18106550-18106789，
若加入引物为Primer6，则得到长度为387bp的含Ps-FT-SNP7标记的西伯利亚杏的6号染色体的片段18107035-18107421。
8.根据权利要求7所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，其特征在于，在步骤(4)中：
若使用Primer1进行PCR扩增，Primer1检测得到的PCR产物的序列长度为227bp，若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第165位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP1位点的基因型为GA或AA；
若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第183位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP2位点的基因型为GA或AA；
若使用Primer2进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，Primer2检测得到的PCR产物的序列长度为158bp，若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第85位碱基为T或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP3位点的基因型为TA或AA；
若使用Primer3进行PCR扩增，Primer3检测得到的PCR产物的序列长度为198bp，若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第74位碱基为T或G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP4位点的基因型为TG或GG
若使用Primer4进行PCR扩增，Primer4检测得到的PCR产物的序列长度为219bp，若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GG；若位于该序列自5’端起的第151位碱基为G或A，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP5位点的基因型为GA或AA；
若使用Primer5进行PCR扩增，Primer5检测得到的PCR产物的序列长度为240bp，若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TT；若位于该序列自5’端起的第89位碱基为T或C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP6位点的基因型为TC或CC；
若使用Primer6进行PCR扩增，Primer6检测得到的PCR产物的序列长度为387bp，若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CC；若位于该序列自5’端起的第185位碱基为C或T，则判定待测西伯利亚杏的Ps-FT-SNP7位点的基因型为CT或TT。
9.根据权利要求8所述的与西伯利亚杏开花期早晚相关的检测方法，其特征在于，将步骤(4)得到的测序结果，与参考序列进行比对，判定西伯利亚杏的花期：
若Ps-FT-SNP1的基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP1的基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP2基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP2基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP3的基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP3的基因型为TA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP4基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP4基因型为TG或GG，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP5基因型为GG，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP5基因型为GA或AA，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP6基因型为TT，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP6基因型为TC或CC，则判定待测西伯利亚杏为晚花；
若Ps-FT-SNP7基因型为CC，则判定待测西伯利亚杏为早花，若Ps-FT-SNP7基因型为CT或TT，则判定待测西伯利亚杏为晚花。
10.西伯利亚杏开花期早晚相关的标记的应用，其特征在于，利用西伯利亚杏开花期早晚相关的标记判定待测西伯利亚杏开花期早晚。
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