CN107828781A - 一种简单快速的水稻dna提取方法 - Google Patents

一种简单快速的水稻dna提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107828781A
CN107828781A CN201711169494.6A CN201711169494A CN107828781A CN 107828781 A CN107828781 A CN 107828781A CN 201711169494 A CN201711169494 A CN 201711169494A CN 107828781 A CN107828781 A CN 107828781A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
quick
30min
extracting method
supernatant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711169494.6A
Other languages
English (en)
Inventor
何弯弯
王健康
丁成伟
郭荣良
吴玉玲
徐家安
王友霜
胡婷婷
赵轶鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGSU XUHUAI REGION XUZHOU AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY INSTITUTE (JIANGSU XUZHOU SWEET POTATO RESEARCH CENTER)
Original Assignee
JIANGSU XUHUAI REGION XUZHOU AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY INSTITUTE (JIANGSU XUZHOU SWEET POTATO RESEARCH CENTER)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGSU XUHUAI REGION XUZHOU AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY INSTITUTE (JIANGSU XUZHOU SWEET POTATO RESEARCH CENTER) filed Critical JIANGSU XUHUAI REGION XUZHOU AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY INSTITUTE (JIANGSU XUZHOU SWEET POTATO RESEARCH CENTER)
Priority to CN201711169494.6A priority Critical patent/CN107828781A/zh
Publication of CN107828781A publication Critical patent/CN107828781A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种水稻DNA提取方法，包括：将水稻叶片剪碎置于2ml离心管中，加入提取液，在65℃烘箱中处理30min左右，离心后将上清液置于盛有异丙醇的96孔板中，静置30min左右，离心后所得白色固体即为DNA。与传统DNA提取技术相比，本发明操作简单、快捷，所用试剂少，成本低，无需酚、氯仿抽提，环境比较友好，不需要液氮或者冷冻样品。本发明提取的DNA具有产率高、质量好，PCR扩增成功率高、成本低、通用性好、分子稳定性强等特点。

Description

一种简单快速的水稻DNA提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于PCR的简单快速提取水稻DNA的方法。
背景技术
水稻是世界上最主要的三大粮食作物之一，有着丰富和深入的基因组研究基础，其中DNA的制备是深入进行分子生物学研究的基础。基于PCR分子标记技术已经广泛应用于基因定位、基因克隆、转基因植株检测及分子标记辅助育种等方面，这些研究都需要进行大量DNA提取工作。然而，DNA提取是一项耗费人力、物力的繁琐工作。因此，建立适合PCR分析的简便、高效、低成本的DNA提取方法是非常必要的。
前人已就植物基因组DNA的提取总结了一系列的方法，如SDS法和CTAB法，虽然这些方法抽提的DNA质量较好，但过程费力且繁琐，需要使用氯仿、异戊醇等有毒化学试剂，难以适用于大量植物叶片基因组DNA提取的需要。相应地，一些生物公司也开了一些基因组DNA提取试剂盒，但试剂盒往往成本较高，也不适用于大量样品DNA的提取。
发明内容
为了解决上述问题，实现高通量提取水稻DNA，满足各种PCR分子标记技术的要求，本发明提供了一种简单、快速的提取植物DNA的方法。
本发明提供了一种简单快速的水稻DNA提取方法，按如下步骤进行：
步骤1）取5-10mg水稻叶片，将其尽量剪碎，长度小于1cm，置于2ml离心管中；
步骤2）向离心管中加入200-500µl提取液，在烘箱中65℃处理30min，在此期间每隔10-20min轻摇一次；
步骤3）再将上述离心管在10000rpm条件下，离心5min，并将上清液转入装有异丙醇的96孔板中，转移至-20℃冰箱或室温静置30min-1h；
步骤4）在6000rpm离心3min，弃上清液；用排枪加入70％的无水乙醇200µl清洗，吹干；
步骤5）加入灭菌的双蒸水或TE溶液溶解，即可提取DNA；
所述提取液为：12.114g三羟甲基氨基甲烷，3.722g乙二胺四乙酸二钠，74.55g氯化钾，加水定容至1L，pH=8.0。
与现有技术相比较，本发明提供的水稻DNA提取方法具有如下优点：
（1）简单：本发明提供的DNA提取方法操作简单，不需要用液氮磨样，不需要使用氯仿、异戊醇等有毒化学试剂，也不需要反复抽提。
（2）经济：本发明所用的试剂少，成本低。
（3）保存长久：本发明提取的DNA保存时间长，不容易降解。
（4）质量高：本发明提供的DNA提取方法无论是扩增基因（1000bp）还是SSR分子标记，PCR扩增效率高，条带清晰。
（5）适用广：本发明提供的水稻DNA提取方法，除了适用于水稻叶片，水稻的根和种子也适用，同时也可用于其他作物。
附图说明
图1是利用引物Pi-hk1-P15扩增水稻叶片DNA经PCR扩增后实施的效果图。
图2是利用引物RM24097扩增水稻叶片DNA经PCR扩增后实施的效果图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施案例并非本发明的实施例全部，而仅仅是一部分。实施例1-2所用到的引物序列见表1。
实施例1：利用引物Pi-hk1-P15扩增水稻叶片DNA
2017年5月17日在秧田育苗，6月15日进行移栽至大田，1月后进行取样，将叶片剪碎放入2ml离心管中，加入500µl提取液， 65℃处理30min，10000rpm离心5min，将上清液移至盛有100µl异丙醇的96孔板中，静置30min，离心后去上清，用排枪加入70％的无水乙醇200 µl清洗，吹干，加100-200µl灭菌后的ddH2O或TE溶液溶解。本实施例中提取液为：12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），3.722g乙二胺四乙酸二钠（EDTA），74.55g氯化钾（KCl），加水定容至1L，pH=8.0。
以本方法提取的DNA为模板，利用基因引物Pi-hk1-P15（序列见表1）进行PCR扩增，所采用的20 µl PCR体系为：1µl DNA模板，2µl10╳PCR buffer（含MgCl2），1µldNTP（2.5mM），1µl特异性引物，1µlTaq enzyme（5U/µl），14µl ddH2O补至20µl体系。PCR反应程序以95℃预变性5min，95℃变性40sec，56℃复性40sec，72℃延伸1-2min循环32次，以72℃延伸10min结束。
PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中的结果如图1所示，从图中可看出，PCR扩增的目的条带为1328bp，条带清晰。
实施例2：利用SSR引物RM24097扩增水稻叶片DNA
2017年5月17日在秧田育苗，6月15日进行移栽至大田，1月后进行取样，将叶片剪碎放入2ml离心管中，加入500µl提取液， 65℃处理30min，10000r.min-1离心10min，将上清液移至装有100µl异丙醇的96孔板中，静置30min，离心后去上清，用排枪加入70％的无水乙醇200µl清洗，吹干，加100-200µl灭菌后的ddH2O溶解。本实施例中提取液为：12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），3.722g乙二酸四乙酸二钠（EDTA），74.55g氯化钾（KCl），加水定容至1L，Ph=8.0。
以本方法提取的DNA为模板，利用基因引物RM7654（序列见表1）进行PCR扩增,RM24097位于9号染色体。采用10µl的扩增反应体系：1 µl DNA模板，1.6 µl 10╳PCRbuffer（含MgCl2），0.2µldNTP（2.5mM），1µl特异性引物，0.1µlTaq enzyme（5U/µl），6.1µlddH2O补至10µl体系。PCR反应程序以95℃预变性5min，95℃变性40sec，56℃复性40sec，72℃延伸40sec，循环32次，以72℃延伸10min结束。
利用基因引物RM24097经PCR扩增产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中的结果见图2所示；
从图中可看出，PCR扩增的目的条带为82bp，条带清晰。
表1
引物名称 引物序列 扩增长度 退火温度 碱基数目
Pi-hk1-P15-F GGAAGACAGTGAGGTGGAAAAC 1328 56 22
Pi-hk1-P15-R ATCAAAGTCGAATGAAGGGAAA 22
RM24097-F GTCCTTCGTCCACGGCAACTACG 82 55 23
RM24097-R TACGCCGAGGTACAGGTCGAAC 23
根据吴等人（Wu et al. 2013）定位的Pi-hk1基因结果，存在16个候选基因，对P15基因在黑壳子粳和苏玉糯中进行比对，在两个品种差异处设置引物，命名为Pi-hk1-P15引物，显示序列为P15在黑壳子粳中的序列，如下所示：
GGAAGACAGTGAGGTGGAAAACGCAAGTGAGGGTGAGCTCCGTGCAGGACGTCGGACCCCTTGACGACGGCTACAGCTGGAGGAGGTACGGGCTGAAGGACATCCTCGGCGCCAAGTACCCAAGGTCAGTGGCATTGCATTGCACCTGAAACGTACTGACTAACACTGGCTGGCTACGAAAGGGCATGTAGCTTAGTGGTTACAGTGACCTAAGTAGTACCCCAAGGTCCTGAGTTTAAATCTTCTATGGAGCGAATTTTAGATTGGATTGTTCACGGGGCTAAGTTCCCTATTTCAATTGCCGTATATATCCAGTTGGATATAGAGGCCGGGTAAAAAATACTCTTCTCTTAAAAAAACAACTGGCTGGCTGGCTGCATACATGTTCATGAGACGACCAACCTTTATAGGCAGGCTGATTGATGTGATCCCAGCTTTGCTAATTACACCCTCATTCCATATTTATCATCACATAATTAAAAATGAGATATCCTAAATTCATCATCATATATTCCATATTTATCATACATCTATGCATGAAAATTAAGTCTGCATTCATGCATGCAGGCATTGGGATAAGCTCTTACACTTACATATACATTTACATCAGCTATAGAGATAAGCTCTTGTTTCATATACATTTTATTTTGGAGCAGCTATAGAGATAAGCTCTTACACTTACATCAGAACTAGTGCTCTCTTGTTTTTTATGTCTTCTTCCCTTTTTCACACAAGTTTATAGTTAACTTATAAATTACTACTCCCTCCGTTCCATGTTATAAGTTGTTTGACTAAGTTTATAGAAAAATATAGTAGTATTTTCAATATATTTAATGTTAGATTTGAT。

Claims (1)

1.一种简单快速的水稻DNA提取方法，其特征在于：按如下步骤进行
步骤1）取5-10mg水稻叶片，将其尽量剪碎，长度小于1cm，置于2ml离心管中；
步骤2）向离心管中加入200-500µl提取液，在烘箱中65℃处理30min，在此期间每隔10-20min轻摇一次；
步骤3）再将上述离心管在10000rpm条件下，离心5min，并将上清液转入装有异丙醇的96孔板中，转移至-20℃冰箱或室温静置30min-1h；
步骤4）在6000rpm离心3min，弃上清液；用排枪加入70％的无水乙醇200µl清洗，吹干；
步骤5）加入灭菌的双蒸水或TE溶液溶解，即可提取DNA；
所述提取液为：12.114g三羟甲基氨基甲烷，3.722g乙二胺四乙酸二钠，74.55g氯化钾，加水定容至1L，pH=8.0。
CN201711169494.6A 2018-01-12 2018-01-12 一种简单快速的水稻dna提取方法 Pending CN107828781A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711169494.6A CN107828781A (zh) 2018-01-12 2018-01-12 一种简单快速的水稻dna提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711169494.6A CN107828781A (zh) 2018-01-12 2018-01-12 一种简单快速的水稻dna提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107828781A true CN107828781A (zh) 2018-03-23

Family

ID=61653261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711169494.6A Pending CN107828781A (zh) 2018-01-12 2018-01-12 一种简单快速的水稻dna提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107828781A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108642051A (zh) * 2018-06-28 2018-10-12 江西省农业科学院水稻研究所 一种水稻dna的简易提取方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102432679A (zh) * 2011-12-12 2012-05-02 华南农业大学 水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用
CN102732551A (zh) * 2011-04-07 2012-10-17 中国科学院上海生命科学研究院 一种植物叶倾角调控基因及其用途
CN102839167A (zh) * 2011-06-23 2012-12-26 匡贤彦 一种简易快速高通量提取植物基因组dna的方法
CN102994635A (zh) * 2012-06-21 2013-03-27 浙江省农业科学院 检测水稻粒型的分子标记方法、试剂盒和引物
CN103045555A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 浙江大学 水稻不定根控制基因arlr1及其应用
CN103382470A (zh) * 2013-07-01 2013-11-06 湖北惠民农业科技有限公司 一种提取棉花干种子基因组dna的方法
CN105385678A (zh) * 2015-12-11 2016-03-09 广东省农业科学院水稻研究所 一种稻米dna的提取方法
CN105462991A (zh) * 2015-12-30 2016-04-06 浙江省农业科学院 疣粒野生稻bZIP1基因
CN107365764A (zh) * 2017-07-04 2017-11-21 华智水稻生物技术有限公司 一种高通量水稻叶片dna提取的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102732551A (zh) * 2011-04-07 2012-10-17 中国科学院上海生命科学研究院 一种植物叶倾角调控基因及其用途
CN102839167A (zh) * 2011-06-23 2012-12-26 匡贤彦 一种简易快速高通量提取植物基因组dna的方法
CN102432679A (zh) * 2011-12-12 2012-05-02 华南农业大学 水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用
CN102994635A (zh) * 2012-06-21 2013-03-27 浙江省农业科学院 检测水稻粒型的分子标记方法、试剂盒和引物
CN103045555A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 浙江大学 水稻不定根控制基因arlr1及其应用
CN103382470A (zh) * 2013-07-01 2013-11-06 湖北惠民农业科技有限公司 一种提取棉花干种子基因组dna的方法
CN105385678A (zh) * 2015-12-11 2016-03-09 广东省农业科学院水稻研究所 一种稻米dna的提取方法
CN105462991A (zh) * 2015-12-30 2016-04-06 浙江省农业科学院 疣粒野生稻bZIP1基因
CN107365764A (zh) * 2017-07-04 2017-11-21 华智水稻生物技术有限公司 一种高通量水稻叶片dna提取的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108642051A (zh) * 2018-06-28 2018-10-12 江西省农业科学院水稻研究所 一种水稻dna的简易提取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114410818B (zh) 一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物及其应用
CN107974510B (zh) 杏黄兜兰est-ssr标记引物、其开发方法及其应用
CN103013986B (zh) 利用est序列的冗余性开发辣椒ssr标记及其方法
CN110205329B (zh) 甘蔗属割手密特异序列及其鉴定方法
CN106521021B (zh) 一种用于鉴定水稻粒宽和粒重gs5基因的单倍体型的基因标记及应用
CN109735648B (zh) 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒
CN107201363A (zh) 一种植物dna的简便、快速提取方法
CN102304587A (zh) 一种快速鉴定水稻直立穗的方法
CN112695125B (zh) 一种卡特兰属ssr分子标记引物组合物及其应用
CN106243208A (zh) 一种水稻类病斑基因及其编码的蛋白质
CN107828781A (zh) 一种简单快速的水稻dna提取方法
CN105950729B (zh) 一种与橡胶树茎围相关的snp标记及其应用
CN112301142B (zh) 拟斯卑尔脱山羊草抗白粉病基因Pm12分子标记及其应用
CN110331222B (zh) 一种棉花育性恢复相关的分子标记及其应用
CN104805081A (zh) 一种小麦粒重分子标记及其应用
CN105838809B (zh) 一种与橡胶树乳管数量相关的snp标记及其应用
CN107164367A (zh) 一种高通量桃叶片基因组dna的提取方法
CN105112557B (zh) 快速鉴定兰属植物的方法
CN107502675B (zh) 用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用
CN108018339B (zh) 高度降解样本中植物性dna的检测引物
CN107119141B (zh) 小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系的选育方法及分子标记
CN108517373A (zh) 一个用于区分五个辣椒栽培种的InDel标记引物对及其应用
CN100584958C (zh) 用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记
CN109797239B (zh) 一种大麦穗分枝基因特异性标记及其应用
CN109837352B (zh) 鉴别绵羊FecB基因SNP基因型的引物及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180323