CN100584958C - 用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记方法，包括以下步骤：1)在“三系”杂交稻中收集8～10种保持度在99.9%以上的作为优良保持系，收集另一组的8～10种保持度为60～80%的育种中间材料作为参照；2)分别对上述优良保持系和参照进行基因组DNA的提取；3)采用常规AFLP分子标记方法进行AFLP分子标记；寻找与所有优良保持系具有紧密连锁性的DNA扩增条带，称为DNA特异条带；4)克隆上述DNA特异条带，并进行序列测定；5)根据上述序列测定结果，设计能扩增该DNA特异条带的PCR引物。采用本发明方法所获得的分子标记与保持系的高保持性状密切连锁。
Description
技术领域
本发明涉及一种获取杂交稻的分子标记的技术，特别是一种获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记的方法。
背景技术
普通“三系”杂交稻是有由不育系、保持系和恢复系配套而成。其中，对于不育系的繁殖是利用位于不育系细胞质内的不育基因与位于保持系细胞核内的特异保持基因的互作，使雄性不育性性状得到保持，所以对保持系要求十分严格。但是，在育种实践中对保持系的改良显得十分困难和无策，且时间周期长、效率极低。就其原因，表面上好像是由于微效恢复基因(对不育性状有一定的恢复作用的遗传因子)的存在和干扰，实质上是由于保持系中保持基因的保持性存在问题。无论怎样，育种家们急待希望找到一种在改良初期就能有效地鉴定育种材料保持性的方法。
专家学者一致认为DNA分子标记技术是实现作物快速、高效育种的手段。它不受环境因素变化的影响，结果可靠，其技术的核心是获得与育种目标性状紧密连锁的分子标记。目前，在DNA分子标记方面，对于不育基因的分子标记已做了不少研究，取得了很大进展。然而，对于保持系的高保持性性状几乎没有专门的研究。因此，迫切希望有一种能够获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记方法，其特征是包括以下步骤：
1)、收集8～10种保持度在99.9％以上的优良保持系，收集另一组的8～10种保持度为60～80％的育种中间材料作为参照；
2)、分别对上述优良保持系和参照进行基因组DNA的提取；
3)、采用常规AFLP分子标记方法进行AFLP分子标记；寻找与所有优良保持系具有紧密连锁性的DNA扩增条带，称为DNA特异条带；
4)、克隆上述DNA特异条带，并进行序列测定；
5)、根据上述序列测定结果，设计能扩增该DNA特异条带的PCR引物。
本发明还同时提供了根据上述方法获得的分子标记，该标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，正向：CTTCACTTATGAGCTCAAGG，反向：CGACTGAAGTCTTCAACTGAC。
本发明的一种获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记方法，采用多个优良保持系和多个保持度在60-80％的育种中间材料为参照，因此能有效地筛选出与优良保持系性状特异连锁的分子标记。
本发明的获取分子标记的方法，步骤3)具体为：严格按照PROMAGA化学试剂公司提供的AFLP试剂盒和方法，应用E-2或E-3分别与M-3的64～128对引物组合，进行PCR扩增反应；再用8～10％聚丙烯酰铵凝胶，300～350V电泳2小时后，用0.1～0.2％硝酸银染色法染色，记录结果。根据记录结果，寻找所有优良保持系与参照(即育种中间材料)之间存在一致的多态性的DNA片段，即目标片段。步骤4)具体为：采用常规T载体克隆方法，对特异片段进行克隆；再将上述片段克隆、转化到大肠杆菌中，并完成序列测定。步骤5)具体为：利用常用的PCR引物设计程序“DNASIS”，在上述序列的特异性片段范围内，设计引物长度为19～25bp，GC控制在35～50％之间，退火温度57～62℃，设计出一对正向和反向引物。
本发明的获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记方法，具有如下优点：1)、因为采用不同遗传背景，又有相同目标性状的多个材料为研究对象，所以研究结果(即所获得的分子标记)更有较广泛的代表性。2)、因为选取大面积生产应用的品种为研究对象，所以其研究结果具有更大的实用性。3)、因为利用了另一组8～10个保持率表现为60～80％的育种中间材料为有效参照；因此能将一些具有一定保持能力、但达不到要求的保持基因与优良的保持基因区分开来，满足生产应用要求。4)、本发明所获得的分子标记与保持系的高保持性状密切连锁。
具体实施方式
一种获取用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的分子标记的方法，依次进行以下步骤：
1、研究材料：
收集生产应用的保持度均在99.9％以上“珍汕97B”、“II-32B”、“优一B”、“枝B”、“博B”、“冈46B”、“马协B”、“协青早B”、“D297B”和“D汕B”这10种“三系”杂交稻作为优良保持系。收集另一组的保持度均为60～80％的10个“三系”杂交稻的育种中间材料作为参照，并相应的分别编号为“AB-147”、“AB-117”、“AB-039”、“AB-272”、“AB-232”、“AB-180”、“AB-194”、“SG-101”、“SG-161”、“SG-094”和“SG-520”。
然后按照常规方法对这10种优良保持系和10种参照分别进行浸种、播种、移栽种植，作为材料。
2、DNA样品制备：
在移栽后18日，每份材料取幼叶5.0克，放入液态氮中冰冻、研磨成粉状，转入12ml 65℃预热的提取液中保温20分钟(提取液：50Mm pH8.0Tri s，500Mm NaCl，10Mm EDTA，1％SDS，0.1％β-mercaptal ethanol)，再加入等体积的氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1)混匀；在常温下，低速振荡15分钟后，以12000转/分速度离心15分钟，取上清液，加入2/3体积的异丙醇沉淀DNA；取出絮状DNA，用70％乙醇清洗二次，让其自然干燥后，加入500μl pH 8.0TE缓冲液溶解、定量，待用。
3、AFLP分子标记：
严格按照PROMAGA化学试剂公司提供的试剂盒和方法，应用E-2或E-3和M-3的64对全部引物组合，进行PCR扩增反应；再用10％聚丙烯酰铵凝胶，300V电泳2小时后，用0.2％硝酸银染色法染色。结果获得DNA多态性条带732条，其中由E-CCA和M-CTT引物所扩增的多态性条带中，分子量约为920bp位置的一条多态性片段显示，所有10个优良保持系样品中均表现为阳性(有该片段出现)，而参照的10个样品呈现阴性(无该片段)，这说明该条带与优良保持系的保持性性状存在紧密的连锁关系。
4、连锁片段克隆：
采用常规T载体克隆方法，对特异片段进行克隆。具体方法是，用pT7blue为T载体，将上述片段克隆、转化到大肠杆菌中。
5、测序与引物设计：
为了获得该特异性DNA片段的分子标记，对该片段进行碱基序列测定，该项工作可委托INVITROGEN公司完成；根据INVITROGEN公司提供的测序结果，采用“DNASIS”计算机分析程序设计出一对引物：(1)正向引物是5’CTTCACTTATGAGCTCAAGG 3’其特征为长度20bp，GC含量45％，退火温度58.6℃；(2)反向引物是5’CGACTGAAGTCTTCAACTGAC 3’其特征为长度21bp，GC含量47％，退火温度61.0℃；并委托SONGON公司合成设计引物。
为了证明本发明的优点，发明人对所得的引物特异性进行了如下的检测：
PCR扩增：用步骤2所得的20份DNA样品，每份5.0μl(20ng/μl)与15.0μl PCR反应液(2.0μl 10x缓冲液，1.6μl 25mM dNTP，2.0μl 25mM MgCl2，和0.3μl设计的引物(1)，0.3μl设计的引物(2)，0.2μl 5U/μlTaq DNA聚合酶，8.6μl双蒸水)混合，进行PCR反应：第一步94℃预变性保温3分钟；第二步94℃保温45秒，56℃保温60秒，72℃保温80秒，并依次循环36次；第三步72℃延伸保温5分钟，结束反应。
凝胶电泳：配制1.0％葡聚糖凝胶，将20μl PCR反应后的样品放入凝胶孔中，6伏特/厘米的电压进行稳压电泳45分钟；取出凝胶，放入1.0μg/ml溴化乙锭溶液中，染色10分钟；放在254nm紫外灯下，对PCR扩增产物经凝胶电泳，优良保持系的10个样品均出现1.5KB明显的扩增条带，而参照没有。
此结果显示：正向：5’CTTCACTTATGAGCTCAAGG 3’和反向5’CGACTGAAGTCTTCAACTGAC 3’的设计引物，对优良保持系具有特异性。
实施例2、利用本发明所得的分子标记，进行鉴定“三系”杂交稻是否为优良品种。
1、选择已知的优良保持系“金23B、KB、中9B、064B和地谷B”作为待鉴定的品种。然后按照常规方法对其进行浸种、播种、移栽种植，作为材料。
2、DNA样品制备：
等同于实施例1。
3、引物特异性检测：
PCR扩增：等同于实施例1；
凝胶电泳：等同于实施例1，结果显示出现1.5KB明显的扩增条带。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO；1
cttcacttat gagctcaagg 20
SEQ ID NO：2
cgactgaagt cttcaactga c 21
Claims (1)
1、一种用于鉴定“三系”杂交稻保持系性状的引物，其特征是：该引物为下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，
正向：CTTCACTTATGAGCTCAAGG
反向：CGACTGAAGTCTTCAACTGAC 。
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| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100127 Termination date: 20100531 |