CN102839167A - 一种简易快速高通量提取植物基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种简易快速高通量提取植物基因组DNA的方法。涉及技术领域为植物全基因DNA提取方法。本发明要解决传统和目前(2011年)市场上流行的提取植物基因组DNA方法中存在的成本高、操作复杂、低通量、耗时长、纯度低、易污染等技术问题。本发明采用自配试剂配方，不使用酶试剂，成本低。无需液氮研磨，操作简单。一次处理384个样品，高通量。提取过程仅需2.5小时，耗时短。所提DNA仅需0.5微升为PCR模板，纯度高。Parafilm膜封口，密封防渗漏，清洁无污染。本发明提取的植物全基因组DNA，可应用于植物群体遗传学、系统进化、分子标记辅助育种和深度测序等研究，适于产业化生产和普通生物实验室科学研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种DNA提取方法，特别是涉及到一种植物全基因DNA提取方法。
背景技术
植物细胞内不仅具有很高的核酸酶活性，而且其细胞壁含有大量的多糖，且其组成因物种不同而各异。这些多糖对植物基因组DNA的提取过程中的共沉淀步骤造成了影响，降低了核酸的纯度。常规使用的CTAB法、尿素提取法和SDS/酚/氯仿提取基因组DNA的方法，不仅操作复杂、耗时长，而且使用了大量挥发性有机物，产生大量的有毒废液。
目前(2011年)市场上的Qiagen Puregene Accessories包括Cell Lysis Solution(1000ml)、Protein Precipitation Solution(350ml)和DNA Hydration Solution(500ml)试剂盒质量和效果因生产批次不同而不稳定，且提纯过程较长(5小时)、成本高(3000美金，约1美金/DNA样本)，其烦琐昂贵的缺陷非常不利于群体遗传学、系统进化、分子标记辅助育种和深度测序等研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经济、简便、易行、快速、高通量的方法，从少量新鲜、4摄氏度保存(一周内)或者室温长期保存的干燥的植物叶片中提取高质量的全基因组植物DNA。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)用打孔器在植物叶片上打1片直径为0.6厘米的圆型新鲜叶片，叶片可4摄氏度保存备用(1周内提取)，或者室温长期保存的干燥叶片。
注意事项：叶片组织不宜过多或者过少，否则会降低DNA提取效率。不能-20摄氏度保存，否则会破坏植物组织，导致DNA降解，影响DNA提取质量。
2)在96孔板小管内放入叶片、1粒直径为0.4厘米的钢珠和200微升提取液。
注意事项：不能超过1粒，否则在后面振荡步骤中会将盖子振松，导致组织液和提取液渗漏。钢珠直径不能大于0.3厘米，否则钢珠球体表面积过大，导致研磨效率不高，叶片组织会残留在球体表面，影响DNA提取效率。200毫升是最佳提取液剂量，否则提取DNA浓度不高。
3)在96孔板上放置一层Parafilm封口膜，再按紧96孔板的盖子，并用硬物的平面(直径约1厘米)顶端将96个小管顶端一一按紧，以防提取液和组织液渗漏。
注意事项：Parafilm增加盖子和管子封口的摩擦力，防止振荡步骤中盖子松动，避免组织液和提取液的渗漏。用硬物按紧盖子，确保盖子封口紧密，处于一个水平面，有利于振荡。钢珠在振荡步骤中会撞击盖子，若盖子不紧，会导致组织液和提取液的渗漏。
4)将96孔板放置在振荡器上，设置频率为30次/秒，振荡30秒，并将96孔板旋转180度后，重新放置在振荡器上，以相同频率再振荡30秒。
注意事项：30次/秒是最适合的频率。若过低，会导致振荡研磨不彻底，降低DNA的提取效率。若过高，会导致细胞内抑制PCR反应的成分的释放，并且降低DNA的稳定性。将96孔板旋转180度是为了确保96孔板研磨均匀，否则会导致不同位置的小管提取的DNA浓度差异很大，影响PCR结果。
5)将振荡后的96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心1分钟。
注意事项：确保组织液和提取液在小管底部，否则在后续的加热中受热不均匀，降低DNA提取的效率。
6)离心后的96孔板75度水浴20分钟。
注意事项：加热时间不宜过短，加热温度不宜过低，否则提取液不能有效破坏植物细胞，降低DNA提取效率。加热时间不宜过长，加热温度不宜过高，否则会导致影响DNA降解的成分释放，降低提取DNA的稳定性。
7)将水浴后的96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心15分钟。
注意事项：确保细胞成分杂质有效沉淀于管底部，否则杂质会混合在DNA上清液中，降低DNA提取效率，降低提取DNA纯度。
8)将离心后的上清液转移至新的96孔平板中。
注意事项：有利于DNA和细胞杂质的分离，否则会降低DNA的提取纯度。
9)加入等体积的100％异丙醇，缓慢来回反转4次。
注意事项：使DNA和异丙醇充分混合。次数过少，导致DNA和异丙醇混合不均，降低DNA提取效率。次数过多，会造成DNA降解，降低DNA提取效率。
10)将96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心15分钟。
注意事项：确保DNA在管底部充分沉淀，否则会降低DNA提取浓度。
11)将96孔板倒置，弃去上清液，再在96孔板中加入150毫升冰浴的70％乙醇润洗。
注意事项：乙醇过多会使沉淀在小管底部的DNA漂浮，易和乙醇一并丢失，并有过多乙醇残留，延长DNA干燥时间，降低DNA提取效率。乙醇过少不能充分洗脱DNA中的细胞杂质，降低DNA提取的纯度。乙醇应保持低温，温度过高会降解DNA，降低DNA提取的稳定性。乙醇浓度70％是最适宜的洗脱浓度，否则会影响洗脱效果，降低DNA提取纯度。
12)将96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心5分钟后，将96孔板倒置，倒掉乙醇，并将96孔板放置在干净的吸水纸上30秒，再换新的吸水纸再吸干30秒。小管底部乳白色团状物即为植物基因组DNA。
注意事项：5000rpm，离心5分钟，确保被乙醇悬浮起来的DNA团装物沉入管底，而不残留在管壁上面，否则会降低DNA提取的浓度。用吸水纸吸干，去除残留乙醇，否则会延长后续DNA干燥时间，降低DNA提取效率。
13)将96孔板正面朝上放置在通风橱内干燥1小时。
注意事项：通风干燥1小时，确保残留乙醇挥发完全，否则会造成乙醇残留，降低DNA纯度，影响PCR反应。
14)加入40微升去离子水，并存储在-20摄氏度冰箱内。
注意事项：40微升去离子水稀释后的DNA浓度区间为200-600纳克/微升(ng/ul)，是直接进行PCR反应的DNA模板的最适合浓度。过多的水会降低DNA浓度，加速DNA降解。-20摄氏度长期保存DNA，温度过高会加速DNA降解。
15)取0.5-1微升DNA溶液直接用于PCR模板。
注意事项：直接作为PCR反应的底物最适合的体积。
本发明植物全基因组DNA提纯方法区别于传统方法和目前流行的Qiagen Purgene，有以下优点：
1.简易快速(2.5小时)；(其他方法均超过5小时)
2.高通量(384份/次)提取DNA；(其他方法1份/次)
3.成本低廉(溶液自配，未使用昂贵酶试剂和液氮)；(其他方法使用液氮或者成本昂贵)
4.所需植物组织少(1个叶片，直径为0.6厘米)；(其他方法均使用超过4个叶片)
5.DNA纯度和浓度高(可直接用于PCR反应)；(其他方法纯度和浓度偏低)
6.DNA稳定性好(可-20摄氏度保存12个月)；(其他方法稳定性差)
7.适用于多种植物(适用于玉米、水稻、高粱、大豆、小麦、拟南芥等)；(其他方法适用领域局限)
所得的高质量基因组DNA可广泛应用于植物群体遗传学、系统进化、分子标记育种等各项研究。
具体实施方式
下面详细说明本发明实施例：
实施例一：用打孔器在新鲜玉米叶片上打1片直径为0.6厘米的圆型叶片。叶片可4摄氏度保存备用，1周内提取，或室温长期保存的干燥叶片。在96孔板小管内放入叶片、1粒直径为0.4厘米的钢珠和200微升提取液。在96孔板上放置一层Parafilm封口膜，再按紧96孔板的盖子，并用硬物的平面(直径约1厘米)顶端将96个小管顶端一一按紧，以防提取液和组织液渗漏。将96孔板放置在振荡器上，设置频率为30次/秒，振荡30秒，并将96板旋转180度后，重新放置在振荡器上，以相同频率再振荡30秒。将振荡后的96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心1分钟。将离心后的96孔板75度水浴20分钟。将水浴后的96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心15分钟。将离心后的上清液转移至新的96孔平板中。加入等体积的100％异丙醇，缓慢来回反转4次。将96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，室温离心15分钟。将96孔板倒置，倒掉上清液，再在96孔板中加入150毫升冰浴70％乙醇润洗。将96孔板放入离心机，设置转速为5000rpm，离心5分钟后，将96孔板倒置，倒掉乙醇，并将96孔板放置在干净的吸水纸上30秒，再换新的吸水纸再吸干30秒。小管底部乳白色团状物即为植物基因组DNA。将96孔板正面朝上放置在通风橱内干燥1小时整。加入40微升去离子水，并存储在-20摄氏度冰箱内。取0.5微升DNA溶液直接用于PCR模板。用Qiagen Purgene提取DNA方法作为对照。
实施例二：用打孔器在新鲜水稻叶片上打1片直径为0.6厘米的圆型叶片。叶片可4摄氏度保存备用，1周内提取，或室温长期保存的干燥叶片。其它步骤同实施例一。用QiagenPurgene提取DNA方法作为对照。
实施例三：用打孔器在新鲜高粱叶片上打1片直径为0.6厘米的圆型叶片。叶片可4摄氏度保存备用，1周内提取，或室温长期保存的干燥叶片。其它步骤同实施例一。用Qiagen
Purgene提取DNA方法作为对照。
实施例四：用打孔器在新鲜大豆叶片上打1片直径为0.6厘米的圆型叶片。叶片可4摄氏度保存备用，1周内提取，或室温长期保存的干燥叶片。其它步骤同实施例一。用Qiagen
Purgene提取DNA方法作为对照。
本发明方法与Qiagen Purgene提取DNA方法比较
1)DNA稳定性
以下是用本发明(图1.植物基因组DNA加样5微升电泳检测结果(左一栏))所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)新鲜叶片基因组DNA加样5微升电泳检测照片。图1左二栏为所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)4摄氏度保存一周的叶片基因组DNA加样5微升电泳检测照片。图1左三栏为所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)室温长期保存的干燥叶片基因组DNA加样5微升电泳检测照片。图1右侧是用Qiagen Purgene提取新鲜玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)基因组DNA加样5微升电泳检测照片(图1)。本发明方法提取的DNA(图1左侧)，在胶顶端有一条清晰的DNA条带，DNA片段无降解，与图1右侧所示的Qiagen Purgene提取DNA方法所得到的条带相似，说明所提取的基因组DNA稳定性良好。
以下是用本发明所提取的玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)基因组DNA经-20摄氏度保存12个月后，取1微升为模板进行某基因片段(1kb)PCR扩增的电泳检测结果(图2.植物基因组DNA为模板的PCR产物电泳检测结果)。图2右侧是用Qiagen Purgene提取玉米(第一行)、水稻(第二行)、高粱(第三行)和大豆(第四行)基因组DNA经-20摄氏度保存24小时后取1微升为模板进行某基因片段(1kb)PCR扩增的电泳检测结果。本发明方法提取的DNA(图2左侧)作为模板经PCR扩增，得到预期1kb大小的清晰条带，无杂带，与图2右侧所示的Qiagen Purgene提取DNA方法所得到的PCR产物片段相似，说明所提取的基因组DNA稳定性良好，适合PCR反应。
2)纯度
用NanoDrop Spectrophotometer分光光度计检测DNA的纯度指标260/280值和260/230值：
-260/280值
本发明提取DNA(图3.本发明提取DNA的NanoDrop Spectrophotometer分光光度计检测结果)的260/280值为：1.9575±0.06751543(样品数n＝96)
Qiagen Purgene提取DNA(图4.Qiagen Purgene提取DNA的NanoDrop
Spectrophotometer分光光度计检测结果)的260/280值为：1.9025±0.115022881(样品数n＝96)
T-test的P值＝0.370189683，差异不显著，说明本发明方法提取的DNA与Qiagen Purgene提取的DNA在纯度上无差异，均有微量RNA存在，但不影响相关实验结果。
-260/230值
若260/230小于2.0，有杂质；若2.0≤260/230≤2.2，高纯度DNA。
本发明提取DNA(图3)的260/230值为：2.085±0.051961524(样品数n＝96)Qiagen Purgene提取DNA(图4)的260/230值为：1.0125±0.154472788(样品数n＝96)T-test的P值＝3.89599x 10-12，差异显著，说明本发明方法提取的DNA与QiagenPurgene提取的DNA相比较，有较高的DNA纯度。
3)浓度
本发明方法提取DNA的浓度为：400.54±124.4068434纳克/微升(ng/ul)Qiagen Purgene提取DNA的浓度为：119.86±99.23338091纳克/微升(ng/ul)T-test的P值＝1.46027x 10-7，差异显著，说明本发明方法提取的DNA浓度要显著高于与同等稀释条件下Qiagen Purgene提取的DNA浓度，本发明方法提取DNA更有效。
数据证明，在DNA的稳定性上，本发明方法提取DNA与Qiagen Purgene提取DNA相似，但本发明方法提取DNA较Qiagen Purgene提取DNA有较高的DNA纯度和浓度。
说明书附图说明
图1是植物基因组DNA加样5微升电泳检测结果图；
图2是植物基因组DNA为模板的PCR产物电泳检测结果图；
图3是本发明提取DNA的NanoDrop Spectrophotometer分光光度计检测结果图；
图4是Qiagen Purgene提取DNA的NanoDrop Spectrophotometer分光光度计检测结果图。
Claims (7)
1.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于DNA提取液的配方：
-100mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl(PH 8.0)；
-10mM乙二胺四乙酸(EDTA)；
-1M氯化钾(KCl)。
2.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于DNA提取材料为1片直径为0.6厘米的圆型新鲜叶片或4摄氏度保存的叶片，或室温长期保存的干燥叶片。
3.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于在96孔板小管内放入1粒直径为0.4厘米的钢珠和200微升提取液。
4.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于在96孔板上放置一层Parafilm封口膜，用硬物平面(直径约1厘米)顶端将96个小管顶端一一按紧，以防提取液和组织液渗漏。
5.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于DNA提取过程中75度的水浴20分钟。
6.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于将96孔板正面朝上放置在通风橱内干燥1小时。
7.植物全基因组DNA提取方法，其特征在于取0.5-1微升DNA溶液直接用于PCR模板。
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