CN102344922A - 一种提取大豆种子dna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆种子中高质量DNA的提取方法，解决了大豆种子基因组总DNA提取多糖去除不彻底、难提取的问题。步骤为：取适量大豆种子，粉碎成粉末状；取0.1g大豆样品粉末，加入20％SDS溶液100μl、500μlCTAB提取缓冲液和4μl蛋白酶K，65℃恒温水浴消化60min，每10min颠倒混匀一次；加入36μl 5mol/L KAC，混匀，冰浴30min，离心；取上清，加等体积氯仿/异戊醇，混匀10min，离心；取上清，沿管壁缓慢旋转加入等体积预冷的异丙醇，室温下沉淀，离心；弃上清，70％乙醇洗涤沉淀3次；自然晾干，70μl TE缓冲液溶解沉淀，-20℃冰箱保存。这种方法操作简单、快速，提取的基因组DNA条带清晰，完整性好，纯度最高，杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，重复性好，可以满足许多分子生物学实验需要。

Description

一种提取大豆种子DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取大豆种子DNA的方法。

背景技术

基因组DNA提取是PCR检测、限制性酶切、分子杂交等一切分子生物学研究的基础技术，大豆高质量基因组DNA提取的成功与否关键在于组织材料的来源以及酚类、多糖类等杂质的去除是否彻底。有些情况下，组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或做一些特殊的处理。传统CTAB方法目前在植物DNA提取中较为常用，且一般选用尽可能新鲜、幼嫩的组织材料或幼苗，对于大豆而言，若以幼苗为材料，就必须经过浸种催芽、幼苗培养、液氮研磨等过程，所以，大部分时间耗费在了实验材料的准备中。而传统的SDS法不能有效去除多糖等物质，提取的DNA不纯，含杂质较多。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种提取大豆种子DNA的方法，本方法操作简单，可快速的提取大豆种子基因组DNA，提取的DNA条带清晰，完整性好，纯度高，杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，而且重复性好，可以满足许多分子生物学实验需要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种提取大豆种子DNA的方法，步骤如下：

(1)取适量大豆种子，粉碎，待用；

(2)取0.1g左右上述粉末，置于1.5ml离心管中，加入100ul 20％的SDS溶液(质量百分数)、500ul CTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶K，充分混匀后，放入60～65℃恒温水浴锅中消化约60min，期间每10min颠倒混匀一次；

(3)加入36ul 5mol/L的KAC，混匀，冰浴约30min，10000～12000r/min离心10min；

(4)取上述离心后的上清液，置于另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，轻柔颠倒混匀约10min，10000～12000r/min离心10min；

(5)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积-20℃预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000～12000r/min离心3min；

(6)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70％乙醇(体积百分数)洗涤沉淀3次，即得大豆种子DNA，自然晾干后，加入70ul TE缓冲液溶解沉淀，-20℃冰箱保存。

在大豆干种子的基因组DNA提取中，最重要的就是去除蛋白、多糖等杂质，提取过程中的盐浓度对去除多糖很关键，高盐浓度下多糖在液相中非常稳定，不易沉淀。传统SDS法不能有效去除多糖等物质，提取的DNA含杂质较多。CTAB是一种阳离子去污剂，在高盐(＞0.7mol/L)浓度下与核酸形成可溶复合物，一旦降低盐浓度(0.1～0.5mol/L NaCl)CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，因此，传统CTAB方法去除多糖较为干净，但DNA产率相对低的多。特别在无法及时冷冻保存新鲜样品或直接从干样、种子中提取DNA时，传统CTAB和传统的SDS方法均对高质量DNA的得率和纯度产生或多或少的影响。本发明将CTAB方法和SDS方法相结合，经实验研究表明，此方法提取的大豆种子DNA条带清晰，完整性好，纯度最高，杂质含量少，且操作简便。以其作为模板对Lectin基因进行PCR检测，特异性产物明显，而且重复性好，可以满足许多分子生物学实验比如PCR检测、限制性酶切、分子杂交等的需要。

附图说明

图1为实施例1中大豆种子基因组总DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳和EB染色示意图。

图2为实施例1中CTAB方法提取大豆种子基因组总DNA的0.8％琼脂糖凝胶电泳和EB染色示意图。

图3为实施例3中大豆内源基因Lectin的PCR产物电泳示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1提取大豆种子基因组总DNA

(1)本发明方法步骤如下：

a)取适量大豆种子，于小型粉碎机中粉碎，成粉末状保存，待用；

b)取0.1g上述粉末，置于1.5ml离心管中，加入100ul 20％的SDS溶液(质量百分数)、500ulCTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶K，充分混匀后，放入65℃恒温水浴锅中消化60min，期间每10min颠倒混匀一次；

c)加入36ul 5mol/L的KAC，混匀，冰浴30min，10000r/min离心10min；

d)取上述离心后的上清液，置于另一离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶

1)，混匀10min后，12000r/min离心10min；

e)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积-20℃预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000r/min离心3min；

f)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70％乙醇(体积百分数)洗涤沉淀3次，即得大豆种子DNA。

g)将上述制得的大豆种子DNA自然晾干后，加入70ul TE缓冲液溶解沉淀，取3ul用于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，结果如图1所示，表明用本发明方法得到的DNA亮度最高，比较丰富，比较清晰，且无拖尾现象，样品间的重复性也很好，可以佐证本方法提取的总DNA质量很好。

(2)传统的CTAB方法步骤如下：

a)取适量大豆种子，于小型粉碎机中粉碎，成粉末状保存，待用；

b)取0.1g上述粉末，置于1.5ml离心管中，加入600ul CTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶

K，充分混匀后，放入65℃恒温水浴锅中消化60min，期间每10min颠倒混匀一次；

c)向离心管中加入等体积的Tris饱和酚，颠倒混匀10min，10000r/min离心10min；

d)取上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)，混匀10min，10000r/min离心10min；

e)取上清液，加等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，混匀10min后10000r/min离心10min；

f)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积-20℃预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000r/min离心3min；

g)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70％乙醇(体积百分数)洗涤沉淀3次，即得大豆种子DNA。

h)将上述制得的大豆种子DNA自然晾干后，加入70ul TE缓冲液溶解沉淀，取3ul用于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，结果如图2所示，表明CTAB方法提取DNA时，步骤繁琐，抽提次数多，所用时间长，DNA条带较弱，且拖尾严重。结论：与传统的CTAB方法相比较，本发明方法提取的DNA有更好的稳定性，不仅提取的总DNA质量很好，而且操作简便，用时较短。

实施例2  测定样品基因组总DNA的浓度

利用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，取待测样品3μl(实施例1制备)，用双蒸水稀释至3000μl，装进比色皿，放进紫外分光光度计样品室的S架上，分别测定所提取DNA溶液在260nm、280nm时的吸光值，本发明方法提取DNA的吸光值如表1所示，传统的CTAB方法提取DNA的吸光值如表2所示。对于双链DNA，OD₂₆₀＝1.0时溶液浓度为50μg/ml。待测DNA溶液的浓度计算公式为：

DNA样品浓度(μg/μl)＝OD₂₆₀×1000(样品稀释倍数)×50/1000。

纯的DNA溶液的OD₂₆₀/OD₂₈0应为1.8；OD₂₆₀/OD₂₈₀大于1.9时，表明有RNA污染；小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。

表1本发明方法提取DNA的浓度和纯度检测

表2传统CTAB法提取DNA的浓度和纯度检测

结论：与传统的CTAB方法相比较，本发明方法提取DNA的纯度最高，浓度最大，并且较稳定，效果很理想。

实施例3  大豆内源基因Lectin的PCR检测

以大豆内源基因凝集素Lectin为模板设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列为：

Lectin-1：5′-GCCCTCTACTCCACCCCAATCC-3′；

Lectin-2：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3′。

PCR反应体系总体积25ul，于200ul离心管中加入基因组DNA(实施例1中本发明方法制备)、引物各1ul，9.5ul灭菌双蒸水，和12.5ul Mix(10×Buffer，dNTP，Mg²⁺，TaqDNA聚合酶)，同时设置空白对照实验(以无菌水代替基因组DNA)。混匀后置于PCR反应仪上进行扩增。PCR反应程序：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸7min；4℃保存。取8μl扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测，溴化乙锭染色，用凝胶成像系统成像记录。

结果：如图3所示，五个样品均实现有效扩增，扩增产物片段条带清晰，长度约为118bp，与引物设计的特异性片段长度相符，说明核酸抽提液为大豆基因组DNA，能满足后续PCR实验的需要。

Claims (1)

1.一种提取大豆种子DNA的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取适量大豆种子，粉碎，待用；

(2)取0.1g上述粉末，置于1.5ml离心管中，加入100ul 20％的SDS溶液、500ul CTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶K，充分混匀后，放入60～65℃恒温水浴锅中消化60min，期间每10min颠倒混匀一次；

(3)加入36ul 5mol/L的KAC，混匀，冰浴30min，10000～12000r/min离心10min；

(4)取上述离心后的上清液，置于另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻柔颠倒混匀10min，10000～12000r/min离心10min；

(5)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积-20℃预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000～12000r/min离心3min；

(6)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70％乙醇洗涤沉淀3次，即得大豆种子DNA。

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