CN104975000B - 一种发状念珠藻基因组dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法：离心收集发状念珠藻纯培养细胞，依次用无菌水、1.0％NaCl溶液和无菌水清洗；匀浆破壁；采用以下提取液对DNA进行提取，提取液为：100mM Tris‑HCl、20mM EDTANa₂、1.4M NaCl、0.2％巯基乙醇、2.0％CTAB，pH＝8.0。本发明与现有的试剂盒提取方法相比，所涉及的实验操作简单，试剂易得，成本低，得率高。采用本发明提取的基因组DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.8左右，纯度高，无弥散现象，完整性好，可直接用于PCR、基因重组等高精度的分子生物学实验研究。

Description

一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法

技术领域

本发明属于生物学研究的基础技术领域，具体涉及一种高纯度发状念珠藻基因组DNA的提取方法。

背景技术

发菜(Nostoc flagelliforme)，又称发状念珠藻，是蓝菌门念珠藻目的细菌，广泛分布于我国的沙漠和贫瘠土壤中，因其色黑而细长，如人的头发而得名。发菜富含各种营养物质，尤其是发菜胞外多糖和发菜藻蓝蛋白，具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖、抗凝血等功能，食用和药用价值很高。日本微细藻类综合研究所和富山医科药科大学的药理试验结果表明，发菜多糖对单纯疱疹病毒等具有明显的抗病毒活性。

由于发菜生长环境的特殊性和人工培育技术的滞后，原料短缺成为提取其功能活性物质工业化的瓶颈。近年来，科研工作者采用基因工程技术等手段构建产发菜活性物质的重组工程菌株，为直接转化生产其活性物质开辟了一条新途径。要实现这一途径，关键是要获取高纯度的发菜基因组DNA，目前DNA提取方法主要有高盐低pH法、SDS裂解法、植物基因组DNA提取试剂盒等。Rodrigo等利用CTAB法提取了珊瑚藻基因组DNA。Christine等和Jang-Seu等分别用植物DNA试剂盒提取了衣藻Chlamydomonas和甲藻Dinoflafellate的DNA，并对提取的DNA进行了分析。Elena等和Mo等也对一些微藻DNA进行提取研究。这些方法虽然可以提取到一定量的DNA，但是产率低，纯度差。

由于发状念珠藻的特殊性，故单纯地重复采用以上任何一种方法均不能很好地排除胞外多糖、蛋白质、酚类等物质的干扰。这些物质的存在给DNA的提取和后续实验带来极大的困难。如胞外多糖能抑制连接酶、聚合酶的生物酶活；蛋白质存在会造成DNA纯度下降；酚类物质氧化可引起DNA降解、变色，影响后续试验的进行。另外，实验室常用的植物基因组DNA提取试剂盒是离心柱型试剂盒，需过吸附柱，DNA得率低，纯度差，样品的花费较高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，可以获得OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8左右的高纯度发状念珠藻基因组DNA。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

该提取方法包括以下步骤：

1)离心收集发状念珠藻培养细胞，依次用无菌水、质量分数0.8～1.2％的NaCl水溶液以及无菌水清洗所述细胞；

2)经过步骤1)后，对所述细胞进行破壁，然后离心收集破碎后的细胞；

3)称取0.1～0.3g所述破碎后的细胞并转入装有2000～4000μL 65℃预热提取液的离心管中，充分混匀后置于65℃水浴中50～70min，其间摇动所述离心管若干次，得混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa₂、NaCl、巯基乙醇以及CTAB，得到含有100～105mM Tris-HCl、20～22mM EDTANa₂、1.4～1.5M NaCl、体积分数0.2～0.25％的巯基乙醇以及质量分数2.0～2.2％的CTAB的混合溶液，然后用NaOH调节混合溶液的pH至8.0，得提取液；

4)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1；

5)对上清液按照步骤4)重复处理1～2次，向最后一次得到的上清液中加入异丙醇，然后于-18～-20℃静置30～45min；

6)离心收集步骤5)中静置过程析出的白色沉淀，依次用500～800μL 75％乙醇和60～90μL 1.5mol/L的NaAc水溶液的混合液、75％乙醇以及无水乙醇洗涤白色沉淀，洗涤后自然风干。

所述步骤1)中依次用无菌水、质量分数1.0％的NaCl水溶液以及无菌水清洗所述细胞各2次，每次清洗后于4℃以及4000～6000r/min下离心8～12min收集细胞。

所述破壁的方式为采用玻璃匀浆器进行2～3次匀浆。

所述提取液各组分的浓度为：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa₂、1.4M NaCl、体积分数0.2％的巯基乙醇以及质量分数2.0％的CTAB，所述提取液的pH为8.0。

所述提取方法具体包括以下步骤：

a)离心收集处于生长对数期的发状念珠藻纯培养细胞，将所述细胞依次用无菌水清洗2次、质量分数1.0％的NaCl水溶液清洗2次，再用无菌水清洗2次，每次清洗后于4℃以及4000～6000r/min下离心8～12min收集细胞；

b)用玻璃匀浆器对经过步骤a)清洗后的细胞进行二次匀浆破壁，然后于4℃以及4000～6000r/min下离心8～12min并收集沉淀于底部的破碎后的细胞；

c)称取0.1～0.3g所述破碎后的细胞并转入装有2000～4000μL 65℃预热提取液的离心管中，充分混匀后置于65℃水浴中50～70min，其间每隔15min摇动所述离心管1次，得混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa₂、NaCl、巯基乙醇以及CTAB，得到含有100mM Tris-HCl、20mM EDTANa₂、1.4M NaCl、体积分数0.2％的巯基乙醇以及质量分数2.0％的CTAB的混合溶液，然后用NaOH调节混合溶液的pH至8.0，得提取液；

d)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1；

e)对上清液按照步骤d)重复处理1～2次，向最后一次得到的上清液中加入异丙醇，然后于-20℃静置30～45min；

f)通过4℃以及12000r/min下离心8～12min收集步骤e)中静置过程析出的白色沉淀；

g)用500～800μL 75％乙醇和60～90μL 1.5mol/L的NaAc水溶液使白色沉淀悬浮后静置30min，然后于4℃以及6000～9000r/min下离心10min，弃上清液；

h)将步骤g)离心得到的沉淀用800μL 75％乙醇悬浮后静置30min，然后于4℃以及6000r/min下离心10min，弃上清液；

i)将步骤h)离心得到的沉淀用无水乙醇悬浮后静置30min，然后于4℃以及6000r/min下离心10min，弃上清液并自然风干沉淀。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)本发明采用无菌水、NaCl水溶液和无菌水清洗细胞的方式，使细胞表面的杂质和胞外多糖含量降到最低，减少培养液中营养物质(如无机盐)和糖类对提取DNA的污染，减少残糖对后续PCR、酶切等抑制作用；

(2)本发明使用所述提取液提取发状念珠藻基因组DNA，其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.8左右，纯度良好，且PCR验证试验获得了条带清晰、重复性好的扩增结果，同时该提取液的毒性大大降低。

(3)与植物试剂盒提取方法相比，具有试验步骤少，操作简单，试剂易得，提取成本低，电泳条带单一、清晰、无弥散等特点，提取的基因组DNA可直接用于PCR、基因重组等高精度的分子生物学实验研究。

此外，离心收集处于生长对数期的发状念珠藻纯培养细胞，可以减少直接采用野生发菜提取对DNA造成的污染。本发明使用玻璃匀浆器二次匀浆破壁的方式，破壁效果好，细胞破碎率高，也避免了液氮的使用，环保节能。

附图说明

图1a为本发明方法提取发菜基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，左起第1泳道(M)：23000-bp marker；第2-11泳道：不同发状念珠藻样品DNA。

图1b为采用植物试剂盒提取法提取发菜基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，左起第1泳道(M)：23000-bp marker；第2-11泳道：不同发状念珠藻样品DNA。

图2为PCR扩增产物检测结果图，左起第1泳道(M)：4500-bp marker；第2-5泳道：以纯度较好的NH-01、NH-02、NH-03、NH-06DNA为模板的PCR产物电泳结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

(一)高纯度发状念珠藻基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：

(1)于4℃、4000～6000r/min离心8～12min,收集处于生长对数期的发状念珠藻纯培养细胞(样品数量10份)，依次用无菌水清洗细胞2次，质量分数1.0％的NaCl水溶液清洗细胞2次，再用无菌水清洗2次，6000r/min(4℃)离心10min收集细胞；

(2)用玻璃匀浆器二次匀浆法对细胞进行破壁，6000r/min(4℃)离心10min收集沉淀于管底的破碎后的细胞(破碎率85％以上)；

(3)称取0.3g破碎后的细胞转入65℃预热的4000μL提取液(装于离心管内)中，充分混匀，65℃水浴45min，其间(指置于65℃水浴过程中)每隔15min轻轻摇动离心管1次，得混合物；提取液用无菌水配制，各组分的浓度为：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa₂、1.4MNaCl、体积分数0.2％的巯基乙醇、质量分数2.0％的CTAB，提取液pH＝8.0；Tris-HCl母液配制：取24.2g Tris用无菌水定容至200mL，然后用盐酸调节pH至8.0；

(4)向混合物中加入同体积的混合液氯仿：异戊醇(体积比为24:1)，轻轻翻动至液面混浊而无两相，8000r/min离心10min(4℃)收集上清液。重复此操作1～2次；

(5)取上清液，加入2/3体积异丙醇，于-20℃静置30min。于4℃下，12000r/min离心10min，收集白色沉淀；

(6)随后加入720μL 75％乙醇和80μL 1.5mol/L的NaAc水溶液洗涤沉淀：轻弹管底，使沉淀悬浮，静置30min。8000r/min离心10min(4℃)，弃上清液。加入800μL 75％乙醇洗涤30min，6000r/min离心10min(4℃)，弃上清液；

(7)无水乙醇洗涤30min，6000r/min离心10min(4℃)，弃上清液，自然风干沉淀(无酒精味即可)；

(8)将沉淀溶于100μL TE溶液，再加入1μL Rnase(10mg/L)，于37℃保温30min，-20℃保存备用。

利用上述方法分别提取10份发状念珠藻基因组DNA。

同时利用说明书背景技术中植物基因组DNA提取试剂盒的方法也提取上述样品的DNA做对比。

(二)对比实验：

一、DNA浓度及纯度测定

用752-紫外光栅分光光度计测定OD₂₆₀、OD₂₈₀。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测纯度和分子量大小。

1.紫外分光光度计检测

从表1的结果可以看出，本发明提取的发状念珠藻基因组DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8左右，表明DNA纯度较高，没有小分子污染；而采用植物基因组DNA提取试剂盒提取的发状念珠藻基因组DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.5左右，DNA纯度低，同时得率也显著低于本发明方法(具体见表2)。

2.琼脂糖凝胶电泳检测实验结果如图1a和图1b所示：

琼脂糖凝胶电泳结果显示，对于发状念珠藻细胞，2种提取方法均可获得一定量的DNA，本发明方法提取所得到的发状念珠藻基因组DNA质量较好，无断裂，完整性好，且无拖尾现象。证明本发明能很好的去除残糖、蛋白等影响物质；植物基因组DNA提取试剂盒提取得到的DNA质量较差，点样孔内有些许残留，证明样品中有残留的糖或者蛋白与DNA包裹，且拖尾现象严重，说明DNA降解严重。因此，本发明方法提取高纯度发状念珠藻基因组DNA，可直接用于PCR、基因重组等分子生物学实验。

表1本发明方法提取不同样品的发菜基因组DNA的纯度及产量

表2植物试剂盒提取不同样品发菜基因组DNA的纯度及产量

二、PCR验证试验

1.引物设计

以Nostoc punctiforme PCC73120光合作用相关组成蛋白设计引物，进行PCR扩增与检测，目的条带大小550bp，选择其中DNA纯度较好的样品NH-01、NH-02、NH-03、NH-06进行PCR扩增。

上游引物序列：TAGGAAGAAGCGAAAGCG(SEQ.ID.NO.1)

下游引物序列：CAGTTGATGGAATGGGTG(SEQ.ID.NO.2)

2.PCR扩增反应体系

以提取的4组纯度较好的发状念珠藻基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，进一步检测所提DNA的质量，反应在MyCycler Thermal Cycler型PCR仪上进行。采用优化后的反应体系和扩增程序。反应体系组成为：Template 70ng,2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，引物各1.5μL(引物浓度10μM)，用ddH₂O补足至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性2min，然后按94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行18个循环，最后72℃延伸2min。反应重复1次。

3.扩增产物电泳检测

取扩增产物5μL点样，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：0.5×TAE电泳缓冲液，电压110V，30min，电泳结束后，在FR-980A生物电泳成像分析系统下观察拍照(λ＝312nm)

检测结果：

扩增产物均检测到了大小约550bp的条带，条带清晰，重复性好(见图2)。

Claims (4)

1.一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，其特征在于：该提取方法包括以下步骤：

1)离心收集发状念珠藻培养细胞，依次用无菌水、质量分数0.8～1.2％的NaCl水溶液以及无菌水清洗所述细胞；

2)经过步骤1)后，对所述细胞进行破壁，然后离心收集沉淀于管底的破碎后的细胞；所述破壁的方式为采用玻璃匀浆器进行2～3次匀浆，破碎率85％以上；

3)称取0.1～0.3g所述破碎后的细胞并转入装有2000～4000μL 65℃预热提取液的离心管中，充分混匀后置于65℃水浴中50～70min，其间摇动所述离心管若干次，得混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa₂、NaCl、巯基乙醇以及CTAB，得到含有100～105mM Tris-HCl、20～22mM EDTANa₂、1.4～1.5M NaCl、体积分数0.2～0.25％的巯基乙醇以及质量分数2.0～2.2％的CTAB的混合溶液，然后用NaOH调节混合溶液的pH至8.0，得提取液；

4)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1；

5)对上清液按照步骤4)重复处理1～2次，向最后一次得到的上清液中加入2/3体积异丙醇，然后于-18～-20℃静置30～45min；

6)离心收集步骤5)中静置过程析出的白色沉淀，依次用500～800μL 75％乙醇和60～90μL 1.5mol/L的NaAc水溶液的混合液、75％乙醇以及无水乙醇洗涤白色沉淀，洗涤后自然风干。

2.根据权利要求1所述一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤1)中依次用无菌水、质量分数1.0％的NaCl水溶液以及无菌水清洗所述细胞各2次，每次清洗后于4℃以及4000～6000r/min下离心8～12min收集细胞。

3.根据权利要求1所述一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述提取液各组分的浓度为：100mM Tris-HCl、20mM EDTANa₂、1.4M NaCl、体积分数0.2％的巯基乙醇以及质量分数2.0％的CTAB，所述提取液的pH为8.0。

4.根据权利要求1所述一种发状念珠藻基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述提取方法具体包括以下步骤：

a)离心收集处于生长对数期的发状念珠藻纯培养细胞，将所述细胞依次用无菌水清洗2次、质量分数1.0％的NaCl水溶液清洗2次，再用无菌水清洗2次，每次清洗后于4℃以及4000～6000r/min下离心8～12min收集细胞；

b)用玻璃匀浆器对经过步骤a)清洗后的细胞进行二次匀浆破壁，然后于4℃以及4000～6000r/min下离心8～12min并收集沉淀于底部的破碎后的细胞；

c)称取0.1～0.3g所述破碎后的细胞并转入装有2000～4000μL 65℃预热提取液的离心管中，充分混匀后置于65℃水浴中50～70min，其间每隔15min摇动所述离心管1次，得混合物；所述提取液的制备方法为：向无菌水中加入Tris-HCl母液、EDTANa₂、NaCl、巯基乙醇以及CTAB，得到含有100mM Tris-HCl、20mM EDTANa₂、1.4M NaCl、体积分数0.2％的巯基乙醇以及质量分数2.0％的CTAB的混合溶液，然后用NaOH调节混合溶液的pH至8.0，得提取液；

d)向混合物中加入氯仿与异戊醇的混合液并翻动至不分相，然后离心并收集上清液；所述氯仿与异戊醇的体积比为24:1；

e)对上清液按照步骤d)重复处理1～2次，向最后一次得到的上清液中加入异丙醇，然后于-20℃静置30～45min；

f)通过4℃以及12000r/min下离心8～12min收集步骤e)中静置过程析出的白色沉淀；

g)用500～800μL 75％乙醇和60～90μL 1.5mol/L的NaAc水溶液使白色沉淀悬浮后静置30min，然后于4℃以及6000～9000r/min下离心10min，弃上清液；

h)将步骤g)离心得到的沉淀用800μL 75％乙醇悬浮后静置30min，然后于4℃以及6000r/min下离心10min，弃上清液；

i)将步骤h)离心得到的沉淀用无水乙醇悬浮后静置30min，然后于4℃以及6000r/min下离心10min，弃上清液并自然风干沉淀。