CN105950610A

CN105950610A - 磁珠法粪便细菌基因组dna/病毒rna快速提取方法

Info

Publication number: CN105950610A
Application number: CN201610402154.2A
Authority: CN
Inventors: 杨磊
Original assignee: Hangzhou Zhuoli Nano Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Zhuoli Nano Technology Co Ltd
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2016-09-21

Abstract

本发明公开了一种磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法。其步骤是：S1、取粪便于离心管中，加入buffer A，破碎静置，取上清液于新的离心管中；S2、向上清液中先后加入buffer B和buffer C，水浴加热；S3、DNA/RNA的吸附：裂解完成后，先后加入buffer D和buffer E，涡旋振荡、静置、磁分离，留下固体物；S4、向留下固体物的离心管先后加入buffer F和buffer G，涡旋振荡，磁分离；S5、在经过步骤4处理后的离心管中加入buffer H，涡旋振荡、水浴加热、再次涡旋振荡，冷却并磁分离，将上清液移到新的离心管中备用。

Description

磁珠法粪便细菌基因组DNA /病毒RNA快速提取方法

技术领域

本发明涉及分子生物学、医学技术领域，具体地说涉及一种磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法。

背景技术

肠道菌群是机体的重要组成部分，其菌群结构数量和种类的变化与机体的健康和疾病有着密切关系，人和动物的健康状况可由外界环境因子与机体自身及体内微生物菌群共同相互作用决定，因此研究宿主与体内菌群之间的相互作用关系具有重大的意义。

粪便与肠道内容物相似，含有大量的微生物、植物和肠道脱落细胞等，将粪便微生物作为研究对象，有利于更好的研究肠道微生物，而且粪便取样方便、无损伤。

由于粪便成分复杂，不同的细菌壁的组成成分和结构不一样，所以提取方法对获得基因组DNA有很大差异。而样本中DNA或RNA的提取是肠道微生物后续研究中最关键最重要的一步，提取时不仅要尽可能多的微生物DNA或RNA提取出来，更要保证提取的质量，去除其他杂质，尤其是RNA的提取要避免提取过程中的大量降解，因此快速、方便、高效的粪便基因组DNA/RNA的提取方法变得非常重要。

目前提取粪便DNA/RNA的方法主要分为传统方法和各种试剂盒法，但是传统方法步骤繁琐，费时费力，试剂盒法价格昂贵且提取出的粪便DNA/RNA产量不高、纯度低、时间长、效果不理想。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的缺陷，提供一种磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，克服现有技术中传统方法步骤繁琐、费时费力，试剂盒法价格昂贵且提取出的粪便DNA/RNA产量不高、纯度低、时间长、效果不理想的缺陷。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，该提取方法的步骤是：

S1、粪便前处理：称取人或动物粪便于离心管中，加入buffer A，待粪便充分破碎后进行静置，待离心管固体沉淀、有上清液析出时，取上清液于新的离心管中，以备后续实验；所述buffer A由浓度为0.1～1M磷酸二氢钾和浓度为0.1～1M的氯化钠溶液按体积比1：1～5混合而成；

S2、粪便中微生物的裂解：向盛放上述上清液的离心管中先后加入buffer B和buffer C，涡旋振荡混合均匀，在低于摄氏100度的条件下水浴加热；所述buffer B由浓度0.1～10mol/L胍盐、浓度1～50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和浓度10～100mmol/L的十二烷基硫酸钠按体积比1：1～3：1～5混合而成；pH值范围为4.0～7.0；所述buffer C为1～50mg/mL蛋白酶K；

S3、DNA/RNA的吸附：裂解完成后，先后加入buffer D和buffer E，涡旋振荡，在充分混匀后静置；然后将静置后的离心管放入磁力架上进行磁分离，去除离心管中的液体，留下固体物；所述buffer D为磁珠；所述buffer E为体积浓度20～80％的醇溶液；

S4、残留杂质的去除：向留下固体物的离心管先后加入buffer F和buffer G，涡旋振荡，充分混匀后进行磁分离；所述buffer F由浓度0.1～10mol/L盐溶液和浓度1～50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐按体积比1：1～5混合而成，pH值为5～10；所述Buffer G为1～50mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液；

S5、DNA/RNA的洗脱：在经过步骤4处理后的离心管中加入buffer H，涡旋振荡，待充分混匀后进行水浴加热；然后再次涡旋振荡，充分混匀，冷却到室温后进行磁分离，得到含有基因组NDA/RNA的洗脱液，将洗脱液移到新的离心管中备用；所述buffer H为浓度0.1～10mol/L盐酸盐溶液，pH值为6～10。

作为对上述技术方案的改进，在步骤4中，当buffer F的pH值范围不在5～10之间时，加入30％～80％的醇溶液调节buffer F的pH值范围为5～10。

作为对上述技术方案的改进，在步骤2中，水浴加热的温度为37℃～95℃；水浴加热的时间为10分钟至1小时。

作为对上述技术方案的改进，在步骤5中，水浴加热的温度为30℃～75℃；水浴加热的时间为1分钟至10分钟。

作为对上述技术方案的改进，在步骤2、3、4、5中，涡旋振荡的时间为3～30秒。

作为对上述技术方案的改进，在步骤3中，静置的时间为1～10min。

与现有技术相比，本发明具有的优点和积极效果是：

本发明的磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，从粪便中提取细菌基因组DNA或病毒RNA速度快，提取量大、纯度好、操作简便、价格低、质量稳定、安全环保、无需反复离心、可配合自动化仪器实现大批量自动化操作。该方法解决了粪便DNA/RNA提取时间长、步骤繁琐、破坏性大、提取量低、纯度差、价格高等缺点与不足。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

本实施例的粪便细菌基因组DNA提取的提取方法的步骤是：

1.粪便前处理：称取人或动物粪便200mg～500mg于2mL离心管中，加入300ul～3mLbuffer A，充分破碎后，取上清液100ul～1mL于新的离心管中，以备后续实验。

2.粪便中微生物的裂解：在上述备用的离心管中加入200ul～2mL buffer B和5～50ulbuffer C，涡旋振荡混合均匀，37℃～95℃条件下水浴加热10分钟至1小时。

3.杂质去除与DNA/RNA的吸附：裂解完成后加入10～100ul buffer D和100ul～1mL的buffer E，涡旋振荡充分混匀，静置1～10min。将离心管放入磁力架上磁分离，去除离心管中的液体。

4.残留杂质的去除：分别加入100ul～1000ul buffer F和buffer G，涡旋振荡3～30秒，充分混匀后进行磁分离。

5.DNA/RNA的洗脱：在上述离心管中加入30～300ul buffer H，涡旋振荡3～30秒，充分混匀，30～75℃水浴1～10分钟。涡旋振荡3～30秒，充分混匀，冷却到室温，磁分离，将洗脱液移到新的离心管中备用。

Buffer A：由浓度为0.1～1M磷酸二氢钾和0.1～1M的氯化钠溶液按体积比1：1～5混合而成。

Buffer B：由浓度0.1～10mol/L胍盐、1～50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及浓度为10～100mmol/L的十二烷基硫酸钠按体积比1：1～3：1～5混合而成，pH值范围为4.0～7.0。

Buffer C：1～50mg/mL蛋白酶K。

Buffer D：磁珠：磁性强，1～5秒即可彻底吸附，分散性好，轻轻振荡即可实现单分散。

Buffer E：体积浓度为20～80％醇溶液。

Buffer F：由浓度0.1～10mol/L盐溶液和1～50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐按体积比1：1～5混合而成，调整pH值范围为5～10，使用时加入30％～80％的醇溶液。

Buffer G：1～50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,使用时体积浓度为20～80％醇溶液。

Buffer H：浓度0.1～10mol/L盐酸盐溶液，pH值为6～10。

实施例2

本实施例的粪便细菌基因组DNA提取的提取方法的步骤是：

1.粪便前处理：称取人或动物粪便200mg于2mL离心管中，加入500ul～1mL buffer A，充分破碎后，取上清液200ul～500ul于新的离心管中，以备后续实验。

2.粪便中微生物的裂解：在上述备用的离心管中加入200～500ul buffer B和20ul bufferC，涡旋振荡混合。

均匀，37℃～95℃条件下水浴加热30分钟至1小时。裂解完成后取上清500ul～1mL于新的离心管中。

3.DNA的吸附：在上述离心管中加入20～50ul buffer D和300～500ul的buffer E，涡旋振荡充分混匀，静置5min。将离心管放入磁力架上磁分离，去除离心管中的液体。

4.残留杂质的去除：分别依次加入100ul～1000ul buffer F和buffer G，涡旋振荡3～30秒，充分混匀后进行磁分离，吸弃废液。

5.DNA的洗脱：在上述离心管中加入30～300ul buffer H，涡旋振荡3～30秒，充分混匀，30～75℃水浴1～10分钟。涡旋振荡3～30秒，充分混匀，冷却到室温，磁分离，将洗脱液移到新的离心管中。

本申请人曾经选用四个标本，其中两个标本用本发明的提取方法进行粪便细菌基因组DNA提取，其余两个选用传统方法，结果如下表所示：

由表可知，本发明提取粪便基因组DNA的浓度较高，纯度较好，且提取速。

实施例3

本实施例的粪便病毒RNA的提取方法的步骤是：

1.粪便前处理：称取人或动物粪便200mg于2mL洁净的离心管中，加入500ul～1mL bufferA，充分破碎后，取上清液200ul～5ul于新的离心管中，以备后续实验。

2.粪便中微生物的裂解：在上述备用的离心管中加入300～500ul buffer B和20ul bufferC,涡旋振荡混合均匀，37℃～95℃条件下水浴加热5～30分钟。

3.RNA的吸附：裂解完成后加入20～50ul buffer D和300～500mL的buffer E，涡旋振荡充分混匀，静置5min。将离心管放入磁力架上磁分离，去除离心管中的液体。

5.RNA的洗脱：在上述离心管中加入30～300ul buffer H，涡旋振荡3～30秒，充分混匀，30～75℃水浴1～10分钟。涡旋振荡3～30秒，充分混匀，冷却到室温，磁分离，将洗脱液移到新的离心管中。

以上所用试剂与耗材均为无RNA酶污染的材料，操作过程中防止RNA的降解。

Claims

1.一种磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，其特征在于：该提取方法的步骤是：

S2、粪便中微生物的裂解：向盛放初级上清液的离心管中先后加入buffer B和buffer C，涡旋振荡混合均匀，在低于摄氏100度的条件下水浴加热；所述buffer B由浓度0.1～10mol/L胍盐、浓度1～50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和浓度10～100mmol/L的十二烷基硫酸钠按体积比1：1～3：1～5混合而成；pH值范围为4.0～7.0；所述buffer C为1～50mg/mL蛋白酶K；

2.根据权利要求1所述的磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，其特征在于：在步骤4中，当buffer F的pH值范围不在5～10之间时，加入30％～80％的醇溶液调节buffer F的pH值范围为5～10。

3.根据权利要求1所述的磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，其特征在于：在步骤2中，水浴加热的温度为37℃～95℃；水浴加热的时间为10分钟至1小时。

4.根据权利要求1所述的磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，其特征在于：在步骤5中，水浴加热的温度为30℃～75℃；水浴加热的时间为1分钟至10分钟。

5.根据权利要求1所述的磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，其特征在于：在步骤2、3、4、5中，涡旋振荡的时间为3～30秒。

6.根据权利要求1所述的磁珠法粪便细菌基因组DNA/病毒RNA快速提取方法，其特征在于：在步骤3中，静置的时间为1～10min。