CN104711252A - 一种适用于淡水红藻dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于藻类DNA的提取方法技术领域，具体涉及一种适用于淡水红藻DNA的提取方法。本发明主要解决了现有用于提取淡水红藻DNA的提取试剂盒存在无法提取高质量DNA的技术问题。本发明的主要步骤是：一、向经液氮研磨的藻体中加入多糖溶解缓冲液，溶解藻体表面多糖，二、加入DNA提取缓冲液，裂解细胞；三、抽提以及DNA纯化。本发明能分离纯化出高质量的串珠藻属和熊野属植物的基因组DNA，DNA产量大，纯度高，能够满足后续的分子生物学研究的要求。
Description
技术领域
本发明属于藻类DNA的提取方法技术领域，具体涉及一种适用于淡水红藻DNA的提取方法。
背景技术
现代的红藻大多数为海洋红藻，淡水红藻的种类较少。有的学者认为淡水红藻可能是在地质变迁过程中，海洋红藻在海陆交替时残留在淡水中的孑遗生物。因此，淡水红藻是藻类进化中的重要类群，研究淡水红藻的起源、系统发育、生理生态具有重要的学术价值。然而，提取高质量的DNA样品，是进行这些研究的基础。
目前常用的藻类植物DNA的提取方法主要是CTAB法等常规的植物组织DNA的提取方法，市面上也没有专门针对藻类植物DNA提取的试剂盒，主要是一些植物总DNA提取试剂盒，而这些试剂盒对于淡水红藻特别是串珠藻属和熊野属的藻类来说通常是不适用的，很难提取到高质量的DNA。
发明内容
本发明的目的是解决现有用于提取淡水红藻DNA的提取试剂盒存在无法提取高质量DNA的技术问题，提供一种适用于淡水红藻DNA的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取淡水红藻藻体100-150mg置于研钵中，向研钵中加入适量液氮，将淡水红藻藻体研磨成粉末；
2)将研磨好的淡水红藻藻体粉末置于第一个2.0ml的离心管中，并向离心管中加入1ml的多糖溶解缓冲液，充分混匀后将离心管置于55℃的水浴或金属浴中加热1h，在浴热过程中间隔颠倒混匀；
3)将浴热混匀后的淡水红藻藻体冷却至常温，在5000rpm的转速下离心处理3min，弃上清，收集沉淀物；
4)向步骤3)收集的沉淀物中依次加入800μl 55℃预热的DNA提取缓冲液、2μlβ-巯基乙醇和6-8μl浓度为20mg/L的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃的水浴或金属浴中加热1h，浴热过程中每10min颠倒混匀一次；
5)向步骤4)制备的混合液中加入800μl的水饱和酚，温和混匀5min，在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第二个2.0ml的离心管中；
6)向步骤5)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第三个2.0ml的离心管中；
7)向步骤6)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第四个2.0ml的离心管中；
8)向步骤7)制备的上清液中加入与上清液相同体积的氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第五个2.0ml的离心管中；
9)向步骤8)制备的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇和pH为5.2浓度为3mol/L的醋酸钠，其中无水乙醇与上清液的体积比为2:1，醋酸钠与上清液的体积比为1:10，轻摇混匀并在-20℃的温度下冷冻30min或在常温下静置直至絮状物出现，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理20min，弃上清，收集沉淀物；
10)向步骤9)收集的沉淀物中加入1ml浓度为75％温度为40℃预热的乙醇，轻摇洗涤沉淀，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理5min，弃上清，收集沉淀物；
11)在室温下将步骤10)收集的沉淀物置于通风处挥发乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50μl的超纯水或TE溶液，并在4℃的温度下静置1h后即得淡水红藻DNA。
所述步骤2)中使用的多糖溶解缓冲液为浓度为0.5-1mol/L的葡萄糖溶液。
所述步骤4)中使用的DNA提取缓冲液为浓度为0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷碱、pH为8.0浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠水溶液、浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液或质量分数为1％的十二烷基硫酸钠水溶液中的任意一种。
所述淡水红藻藻体为用硅胶干燥后的冷冻淡水红藻藻体。
所述的淡水红藻为串珠藻属或熊野属。
本发明采用以上技术方案，有效解决了传统或改良的CTAB法在提取的总DNA时纯度不高的问题，并能消除淡水红藻藻体由于多糖类物质含量较高而造成的DNA提取失败或杂质较多等影响，提供了一种能够获得完整的、高质量的淡水红藻的总DNA的方法，能够满足后续PCR扩增等常规分子生物学研究需要。
附图说明
图1是本发明第一种实施方式提取的DNA的电泳图；
图2是本发明第二种实施方式提取的DNA的电泳图；
图3是本发明第三种实施方式提取的DNA的电泳图；
具体实施方式
实施例1
本实施例中所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取用硅胶干燥后的串珠藻属淡水红藻藻体100mg置于研钵中，向研钵中加入适量液氮，将串珠藻属淡水红藻藻体研磨成粉末；
2)将研磨好的串珠藻属淡水红藻藻体粉末置于第一个2.0ml的离心管中，并向离心管中加入1ml浓度为0.5mol/L的葡萄糖溶液，充分混匀后将离心管置于55℃的水浴中加热1h，在浴热过程中间隔颠倒混匀；
3)将浴热混匀后的串珠藻属淡水红藻藻体冷却至常温，在5000rpm的转速下离心处理3min，弃上清，收集沉淀物；
4)向步骤3)收集的沉淀物中依次加入800μl 55℃预热的浓度为0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷碱、2μlβ-巯基乙醇和6μl浓度为20mg/L的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃的水浴中加热1h，浴热过程中每10min颠倒混匀一次；
5)向步骤4)制备的混合液中加入800μl的水饱和酚，温和混匀5min，在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第二个2.0ml的离心管中；
6)向步骤5)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第三个2.0ml的离心管中；
7)向步骤6)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第四个2.0ml的离心管中；
8)向步骤7)制备的上清液中加入与上清液相同体积的氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第五个2.0ml的离心管中；
9)向步骤8)制备的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇和pH为5.2浓度为3mol/L的醋酸钠，其中无水乙醇与上清液的体积比为2:1，醋酸钠与上清液的体积比为1:10，轻摇混匀并在-20℃的温度下冷冻30min，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理20min，弃上清，收集沉淀物；
10)向步骤9)收集的沉淀物中加入1ml浓度为75％温度为40℃预热的乙醇，轻摇洗涤沉淀，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理5min，弃上清，收集沉淀物；
11)在室温下将步骤10)收集的沉淀物置于通风处挥发乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50μl的超纯水或TE溶液，并在4℃的温度下静置1h后即得串珠藻属淡水红藻藻体DNA。
对本实施例提取的串珠藻属淡水红藻藻体DNA进行了电泳检测，检测结果如图1所示，图中1-1-2，8-9，2-1-9为采用本方法提取的串珠藻属的DNA样本，1-3-7采用改良的CTAB法提取的串珠藻属DNA样品，检测结果显示采用本方法提取的总DNA纯度较高。
实施例2
本实施例中所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取用硅胶干燥后的熊野属淡水红藻藻体150mg置于研钵中，向研钵中加入适量液氮，将熊野属淡水红藻藻体研磨成粉末；
2)将研磨好的熊野属淡水红藻藻体粉末置于第一个2.0ml的离心管中，并向离心管中加入1ml浓度为1mol/L的葡萄糖溶液，充分混匀后将离心管置于55℃的金属浴中加热1h，在浴热过程中间隔颠倒混匀；
3)将浴热混匀后的熊野属淡水红藻藻体冷却至常温，在5000rpm的转速下离心处理3min，弃上清，收集沉淀物；
4)向步骤3)收集的沉淀物中依次加入800μl 55℃预热的pH为8.0浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠水溶液、2μlβ-巯基乙醇和8μl浓度为20mg/L的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃的金属浴中加热1h，浴热过程中每10min颠倒混匀一次；
5)向步骤4)制备的混合液中加入800μl的水饱和酚，温和混匀5min，在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第二个2.0ml的离心管中；
6)向步骤5)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第三个2.0ml的离心管中；
7)向步骤6)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第四个2.0ml的离心管中；
8)向步骤7)制备的上清液中加入与上清液相同体积的氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第五个2.0ml的离心管中；
9)向步骤8)制备的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇和pH为5.2浓度为3mol/L的醋酸钠，其中无水乙醇与上清液的体积比为2:1，醋酸钠与上清液的体积比为1:10，轻摇混匀并在常温下静置直至絮状物出现，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理20min，弃上清，收集沉淀物；
10)向步骤9)收集的沉淀物中加入1ml浓度为75％温度为40℃预热的乙醇，轻摇洗涤沉淀，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理5min，弃上清，收集沉淀物；
11)在室温下将步骤10)收集的沉淀物置于通风处挥发乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50μl的超纯水或TE溶液，并在4℃的温度下静置1h后即得熊野属淡水红藻藻体DNA。
对本实施例提取的熊野属淡水红藻藻体DNA进行了电泳检测，检测结果如图2所示，检测结果显示采用本方法提取的总DNA纯度较高。
实施例3
本实施例中所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，包括以下步骤：
1)取用硅胶干燥后的串珠藻属淡水红藻藻体130mg置于研钵中，向研钵中加入适量液氮，将串珠藻属淡水红藻藻体研磨成粉末；
2)将研磨好的串珠藻属淡水红藻藻体粉末置于第一个2.0ml的离心管中，并向离心管中加入1ml浓度为0.7mol/L的葡萄糖溶液，充分混匀后将离心管置于55℃的水浴中加热1h，在浴热过程中间隔颠倒混匀；
3)将浴热混匀后的串珠藻属淡水红藻藻体冷却至常温，在5000rpm的转速下离心处理3min，弃上清，收集沉淀物；
4)向步骤3)收集的沉淀物中依次加入800μl 55℃预热的浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液、2μlβ-巯基乙醇和7μl浓度为20mg/L的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃的水浴中加热1h，浴热过程中每10min颠倒混匀一次；
5)向步骤4)制备的混合液中加入800μl的水饱和酚，温和混匀5min，在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第二个2.0ml的离心管中；
6)向步骤5)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第三个2.0ml的离心管中；
7)向步骤6)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第四个2.0ml的离心管中；
8)向步骤7)制备的上清液中加入与上清液相同体积的氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第五个2.0ml的离心管中；
9)向步骤8)制备的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇和pH为5.2浓度为3mol/L的醋酸钠，其中无水乙醇与上清液的体积比为2:1，醋酸钠与上清液的体积比为1:10，轻摇混匀并在-20℃的温度下冷冻30min，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理20min，弃上清，收集沉淀物；
10)向步骤9)收集的沉淀物中加入1ml浓度为75％温度为40℃预热的乙醇，轻摇洗涤沉淀，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理5min，弃上清，收集沉淀物；
11)在室温下将步骤10)收集的沉淀物置于通风处挥发乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50μl的超纯水或TE溶液，并在4℃的温度下静置1h后即得串珠藻属淡水红藻藻体DNA。
对本实施例提取的串珠藻属淡水红藻藻体DNA进行了电泳检测，检测结果如图3所示，检测结果显示采用本方法提取的总DNA纯度较高。
上述实施例中的浓度为0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷碱、pH为8.0浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠水溶液或浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液还可以用质量分数为1％的十二烷基硫酸钠水溶液代替。
Claims (5)
1.一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取淡水红藻藻体100-150mg置于研钵中，向研钵中加入适量液氮，将淡水红藻藻体研磨成粉末；
2)将研磨好的淡水红藻藻体粉末置于第一个2.0ml的离心管中，并向离心管中加入1ml的多糖溶解缓冲液，充分混匀后将离心管置于55℃的水浴或金属浴中加热1h，在浴热过程中间隔颠倒混匀；
3)将浴热混匀后的淡水红藻藻体冷却至常温，在5000rpm的转速下离心处理3min，弃上清，收集沉淀物；
4)向步骤3)收集的沉淀物中依次加入800μl 55℃预热的DNA提取缓冲液、2μlβ-巯基乙醇和6-8μl浓度为20mg/L的蛋白酶K，充分混匀后置于55℃的水浴或金属浴中加热1h，浴热过程中每10min颠倒混匀一次；
5)向步骤4)制备的混合液中加入800μl的水饱和酚，温和混匀5min，在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第二个2.0ml的离心管中；
6)向步骤5)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第三个2.0ml的离心管中；
7)向步骤6)制备的上清液中加入与上清液相同体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第四个2.0ml的离心管中；
8)向步骤7)制备的上清液中加入与上清液相同体积的氯仿和异戊醇的混合物，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，轻摇萃取5min，室温下在13000rpm的转速下离心处理3min，取上清液置于第五个2.0ml的离心管中；
9)向步骤8)制备的上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇和pH为5.2浓度为3mol/L的醋酸钠，其中无水乙醇与上清液的体积比为2:1，醋酸钠与上清液的体积比为1:10，轻摇混匀并在-20℃的温度下冷冻30min或在常温下静置直至絮状物出现，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理20min，弃上清，收集沉淀物；
10)向步骤9)收集的沉淀物中加入1ml浓度为75％温度为40℃预热的乙醇，轻摇洗涤沉淀，并于室温下在10000rpm的转速下离心处理5min，弃上清，收集沉淀物；
11)在室温下将步骤10)收集的沉淀物置于通风处挥发乙醇，待沉淀物透明后，向透明溶液中加入50μl的超纯水或TE溶液，并在4℃的温度下静置1h后即得淡水红藻DNA。
2.根据权利要求1所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中使用的多糖溶解缓冲液为浓度为0.5-1mol/L的葡萄糖溶液。
3.根据权利要求1所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于：所述步骤4)中使用的DNA提取缓冲液为浓度为0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷碱溶液、pH为8.0浓度为0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠水溶液、浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液或质量分数为1％的十二烷基硫酸钠水溶液中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于：所述淡水红藻藻体为用硅胶干燥后的冷冻淡水红藻藻体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种适用于淡水红藻DNA的提取方法，其特征在于，所述的淡水红藻为串珠藻属或熊野属。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150617 |