CN104178431A - 一种提取土生隐球酵母线粒体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取土生隐球酵母线粒体的方法，本方法对现有差速离心法的操作步骤、提取缓冲液的组分和配制方法进行改良，延长菌体预处理时间，期间不断震荡；在酶解破壁步骤中，改良酶解缓冲液的组分，增加蜗牛酶的用量同时添加纤维素酶，延长酶解破壁的时间和孵育温度，使菌体破壁彻底，增加原生质体的得率；为了原生质体裂解温和不至于破坏线粒体，原生质体裂解液和线粒体洗涤缓冲液均用PBS配制。用该方法可以提取到高质量的线粒体，其结构完整，细胞色素氧化酶系统没有被破坏，具有活性。该方法提取到的线粒体可以用于以线粒体为研究对象的生理生化研究。该方法具有简单、经济、易于操作等优点，适合在普通生物实验室中操作和推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种线粒体的提取方法，特别涉及一种用于提取土生隐球酵母线粒体的方法。
背景技术
线粒体是细胞中一种重要的细胞器，存在于绝大多数活细胞中，线粒体在细胞代谢中扮演着重要的角色，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。因此，研究线粒体内外膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构、功能及理化性质已经成为细胞生物学研究中的重要课题，而提取有活性的线粒体则是这些研究的基础。
目前提取线粒体的方法很多，包括蔗糖密度梯度离心法、差速离心法和试剂盒提取方法。蔗糖密度梯度离心法属于传统方法，该法成本低，但是费时费力，而且需要超速低温离心机，而提取线粒体的试剂盒价格比较昂贵。差速离心法只适用于酿酒酵母线粒体的提取，用于土生隐球酵母提取时，对细胞破壁比较困难，原生质体得率低，进一步导致无法得到线粒体。
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简便快捷的方法，从土生隐球酵母细胞材料中提取高质量的、活性强的线粒体，适用于实验应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的操作步骤为：
（1）将GM（葡萄糖培养基）或者YPD（酵母膏胨葡萄糖培养基）液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液，在25-30℃下，100-200 rpm摇60-120 min；
（2）将上述溶液离心弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后离心收集沉淀；
（3）向沉淀中加入酶解缓冲液，混匀后在温度为28-36 ℃，转速100-200 rpm条件下处理2-6 h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况，取样的多少依据菌体量多少来定，使形成的原生质体在显微镜下不重叠为准；
（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，离心去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液，混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡10-30 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况；
（5）于4 ℃，1200-1800 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液重复洗涤2-3次，每次均弃去沉淀收集上清溶液，将所得上清液在4 ℃，12000-20000 g离心20 min收集沉淀；
（6）加入线粒体洗涤缓冲液，在4 ℃，1200-1800 g离心10 min去沉淀；
（7）将上述上清液在4 ℃，12000-20000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体，
加入线粒体洗涤缓冲液悬浮线粒体；
（8）将线粒体悬浮液与詹纳斯绿B应用液按1:1比例混匀，室温染色15 min后显微镜检下观察，线粒体为蓝绿色，呈椭圆形或卵圆形颗粒状。
本发明中所述预处理缓冲液为pH8.0，含2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.5-1% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液。
本发明中所述酶解缓冲液为pH7.4，含20-60 mg/mL蜗牛酶，2-5 mg/mL纤维素酶、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
本发明中所述原生质体裂解液为pH7.5，含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
本发明中所述线粒体洗涤缓冲液为pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
1%詹纳斯绿B母液：取 50mg詹纳斯绿B粉末溶解于5mL Rioger溶液 (NaCl 0.85g，KC1 0.25g，CaCl2 0.03g，用去离子水定容至100mL)，稍加热(30～40℃)溶解，过滤，即得。
詹纳斯绿B应用液：取1%詹纳斯绿B母液 1mL，加入49mL Rioger溶液，混匀即得，现配现用；
上述配制缓冲液的PBS均为0.01mol/L的1×PBS溶液。
1×PBS（0.01mol/L）：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 3.62g，KH2PO4 0.24g，ddH2O 1L，pH调到7.4。
本发明方法的优点是：简单、方便快捷、经济、易于操作。与其他方法相比，该方法提取的土生隐球酵母线粒体得率高、质量好并且具有高的活性；本方法对现有差速离心法的操作步骤、提取缓冲液的组分和配制方法进行改良，延长菌体预处理时间，期间不断震荡；在酶解破壁步骤中，改良酶解缓冲液的组分，增加蜗牛酶的用量同时添加纤维素酶，延长酶解破壁的时间和孵育温度，使菌体破壁彻底，增加原生质体的得率；为了原生质体裂解温和不至于破坏线粒体，原生质体裂解液和线粒体洗涤缓冲液均用PBS配制。用该方法可以提取到高质量的线粒体，其结构完整，细胞色素氧化酶系统没有被破坏，具有活性。该方法提取到的线粒体可以用于以线粒体为研究对象的生理生化研究。
附图说明
图1为本发明土生隐球酵母细胞破壁后原生质体形成的显微镜观察图，其中A为未破壁的土生隐球酵母细胞；B为破壁后形成的原生质体；
图2为本发明裂解后的原生质体的显微镜观察图；
图3为本发明染色后的线粒体的显微镜观察图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：
本实施例利用从云南保山茶园酸性土壤中分离到的一株土生隐球酵母菌（Cryptococcus humicolus）BSLL1-1菌株，通过本发明方法，获得了高质量的有活性的线粒体，具体操作如下：
（1）将GM液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液（pH8.0 含0.1mol/L EDTA、1% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液），摇匀，在28℃下，100 rpm摇90 min；
（2）将上述溶液5000 rpm离心5 min，弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后5000 rpm离心5min，收集沉淀；
（3）向沉淀中加入酶解缓冲液（pH7.4含40 mg/mL蜗牛酶，4 mg/mL纤维素酶、0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蜗牛酶和纤维素酶均购于上海楷洋生物技术有限公司），混匀后在温度为32 ℃，转速160rpm条件下处理4h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况；
该步骤为获得高得率线粒体的关键步骤，如果细胞破壁不彻底，那么原生质体得率不高，则最后就无法得到线粒体。结果通过显微镜镜检发现，菌体细胞破壁比较彻底，破壁的原生质体细胞呈圆形（图1B），而没有经过破壁的对照细胞则呈椭圆形（图1A），原生质体得率达到98%；
（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，5000 rpm离心5 min，去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、5mmol/L EDTA、0.35mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡15 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况，结果如图2所示，大部分原生质体均已经裂解破碎，原生质体裂解充分也是获得线粒体的前提；
（5）于4 ℃，1500 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液洗涤2次，每次均弃去沉淀收集上清溶液，将所得上清液在4 ℃，18000g离心20 min收集沉淀；
（6）加入线粒体洗涤缓冲液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、0.5mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），在4 ℃，1500 g离心10 min去沉淀；
（7）将上述上清液在4 ℃，18000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体，加入线粒体洗涤缓冲液悬浮线粒体；
（8）将线粒体悬浮液与詹纳斯绿B应用液按1:1比例混匀，詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行活体染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；室温染色15 min后显微镜检下观察，结果如图3所示，线粒体为蓝绿色，呈椭圆形或卵圆形颗粒状，说明提取的线粒体具有活性。
实施例2：利用从云南保山茶园酸性土壤中分离到的一株土生隐球酵母菌（Cryptococcus humicolus）BSLL1-1菌株，通过本发明方法，获得了高质量的有活性的线粒体，具体操作如下：
（1）将GM液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液（pH8.0 含10mmol/L EDTA、0.5% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液），摇匀，在25℃下，150rpm摇120 min；
（2）将上述溶液10000rpm离心4min，弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后10000rpm离心4min，收集沉淀；
（3）向沉淀中加入酶解缓冲液（pH7.4含60 mg/mL蜗牛酶，2 mg/mL纤维素酶、0.35mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蜗牛酶和纤维素酶均购于上海楷洋生物技术有限公司），混匀后在温度为28 ℃，转速200rpm条件下处理2h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况；
该步骤为获得高得率线粒体的关键步骤，如果细胞破壁不彻底，那么原生质体得率不高，则最后就无法得到线粒体。结果通过显微镜镜检发现，菌体细胞破壁比较彻底，破壁的原生质体细胞呈圆形，而没有经过破壁的对照细胞则呈椭圆形，原生质体得率达到60%；
（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，10000rpm离心4min，去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L EDTA、0.5mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡10 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况，大部分原生质体均已经裂解破碎，原生质体裂解充分也是获得线粒体的前提；
（5）于4 ℃，1800 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液洗涤2次，每次均弃去沉淀收集上清溶液，将所得上清液在4 ℃，15000g离心20 min收集沉淀；
（6）加入线粒体洗涤缓冲液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L EDTA、0.35mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），在4 ℃，1200 g离心10 min去沉淀；
（7）将上述上清液在4 ℃，15000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体，加入线粒体洗涤缓冲液悬浮线粒体；
（8）将线粒体悬浮液与詹纳斯绿B应用液按1:1比例混匀，詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行活体染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；室温染色15 min后显微镜检下观察，线粒体为蓝绿色，呈椭圆形或卵圆形颗粒状，说明提取的线粒体具有活性。
实施例3：利用从云南保山茶园酸性土壤中分离到的一株土生隐球酵母菌（Cryptococcus humicolus）BSLL1-1菌株，通过本发明方法，获得了高质量的有活性的线粒体，具体操作如下：
（1）将YPD液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液（pH8.0 含50mmol/L EDTA、0.8% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液），摇匀，在30℃下，200rpm摇60 min；
（2）将上述溶液8000rpm离心3min，弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后8000rpm离心3min，收集沉淀；
（3）向沉淀中加入酶解缓冲液（pH7.4含20 mg/mL蜗牛酶，5 mg/mL纤维素酶、0.5mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蜗牛酶和纤维素酶均购于上海楷洋生物技术有限公司），混匀后在温度为36 ℃，转速100rpm条件下处理6h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况；
该步骤为获得高得率线粒体的关键步骤，如果细胞破壁不彻底，那么原生质体得率不高，则最后就无法得到线粒体。结果通过显微镜镜检发现，菌体细胞破壁比较彻底，破壁的原生质体细胞呈圆形，而没有经过破壁的对照细胞则呈椭圆形，原生质体得率达到65%；
（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，8000rpm离心3min，去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡30min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况，大部分原生质体均已经裂解破碎，原生质体裂解充分也是获得线粒体的前提；
（5）于4 ℃，1200 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液洗涤3次，每次均弃去沉淀收集上清溶液，将所得上清液在4 ℃，20000g离心20 min收集沉淀；
（6）加入线粒体洗涤缓冲液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、0.05mol/L EDTA、0.9mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），在4 ℃，1800 g离心10 min去沉淀；
（7）将上述上清液在4 ℃，20000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体，加入线粒体洗涤缓冲液悬浮线粒体；
（8）将线粒体悬浮液与詹纳斯绿B应用液按1:1比例混匀，詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行活体染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；室温染色15 min后显微镜检下观察，线粒体为蓝绿色，呈椭圆形或卵圆形颗粒状，说明提取的线粒体具有活性。
实施例4：利用从云南保山茶园酸性土壤中分离到的一株土生隐球酵母菌（Cryptococcus humicolus）BSLL1-1菌株，通过本发明方法，获得了高质量的有活性的线粒体，具体操作如下：
（1）将YPD液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液（pH8.0 含2mmol/L EDTA、0.6% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液），摇匀，在26℃下，180rpm摇80 min；
（2）将上述溶液7000rpm离心4min，弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后7000rpm离心4min，收集沉淀；
（3）向沉淀中加入酶解缓冲液（pH7.4含30 mg/mL蜗牛酶，3 mg/mL纤维素酶、0.6mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液，蜗牛酶和纤维素酶均购于上海楷洋生物技术有限公司），混匀后在温度为30 ℃，转速150rpm条件下处理5h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况；
该步骤为获得高得率线粒体的关键步骤，如果细胞破壁不彻底，那么原生质体得率不高，则最后就无法得到线粒体。结果通过显微镜镜检发现，菌体细胞破壁比较彻底，破壁的原生质体细胞呈圆形，而没有经过破壁的对照细胞则呈椭圆形，原生质体得率达到80%；
（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，12000rpm离心4min，去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、0.7mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡20 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况，大部分原生质体均已经裂解破碎，原生质体裂解充分也是获得线粒体的前提；
（5）于4 ℃，1600 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液洗涤3次，每次均弃去沉淀收集上清溶液，将所得上清液在4 ℃，16000g离心20 min收集沉淀；
（6）加入线粒体洗涤缓冲液（pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、0.6mol/L 山梨醇的0.01mol/L PBS溶液），在4 ℃，1600 g离心10 min去沉淀；
（7）将上述上清液在4 ℃，12000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体，加入线粒体洗涤缓冲液悬浮线粒体；
（8）将线粒体悬浮液与詹纳斯绿B应用液按1:1比例混匀，詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行活体染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；室温染色15 min后显微镜检下观察，线粒体为蓝绿色，呈椭圆形或卵圆形颗粒状，说明提取的线粒体具有活性。
Claims (5)
1.一种提取土生隐球酵母线粒体的方法，其特征在于按以下操作进行：
（1）将GM或者YPD液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液，在25-30℃下，100-200 rpm摇60-120 min；
（2）将上述溶液离心弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后离心收集沉淀；
（3）向沉淀中加入酶解缓冲液，混匀后在温度为28-36 ℃，转速100-200 rpm条件下处理2-6 h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况；
（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，离心去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液，混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡10-30 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况；
（5）于4 ℃，1200-1800 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液重复洗涤2-3次，每次均弃去沉淀收集上清液，将所得上清液在4 ℃，12000-20000 g离心20 min收集沉淀；
（6）加入线粒体洗涤缓冲液，在4 ℃，1200-1800 g离心10 min去沉淀；
（7）将上述上清液在4 ℃，12000-20000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体。
2.根据权利要求1所述提取土生隐球酵母线粒体的方法，其特征在于：预处理缓冲液为pH8.0 含2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.5-1% β-巯基乙醇的0.01mol/L PBS溶液。
3.根据权利要求1所述提取土生隐球酵母线粒体的方法，其特征在于：酶解缓冲液为pH7.4含20-60 mg/mL蜗牛酶，2-5 mg/mL纤维素酶、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
4.根据权利要求1所述提取土生隐球酵母线粒体的方法，其特征在于：原生质体裂解液为pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、 2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
5.根据权利要求1所述提取土生隐球酵母线粒体的方法，其特征在于：线粒体洗涤缓冲液为pH7.5含10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L -0.1mol/L EDTA、0.35mol/L -0.9mol/L山梨醇的0.01mol/L PBS溶液。
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