CN113930397B - 酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于工程细胞的构建和培养领域，具体涉及一种酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法。所述构建培养方法为：首先培养酿酒酵母细胞；然后经多步差速离心法，获得酵母细胞线粒体粗提物；将酵母细胞线粒体粗提物利用蔗糖密度梯度离心法，获取纯化的酵母细胞线粒体；将纯化的酵母细胞线粒体以添加至96孔板培养的MDA‑MB‑231乳腺肿瘤细胞的培养液中，孵育培养即可。本发明所培养的工程细胞，具有较快的生长速度，能在较短的时间内达到实验所需的细胞数量，大大缩短了实验周期。本发明所述的工程细胞构建方法，较为简单，原材料成本较低。本发明所构建的工程细胞，具有与原细胞系相同的细胞性质，能够较好地满足实验要求。
Description
技术领域
本发明属于工程细胞的构建和培养领域，具体涉及一种酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法。
背景技术
随着肿瘤疾病在人类疾病当中的发病率以及致死率的日益升高，攻克癌症这一世界性难题，已经困扰了人类数十年，其中，乳腺肿瘤细胞尤为突出，其在女性当中的发病率呈现逐年升高，发病年龄逐年降低的态势，世界各国科研工作者和医学工作者，都在为研制新型抗癌药物夜以继日的工作。随着每一种新型药物的研发，其先导一定是以相对应的体外肿瘤细胞作为试验对象，所以，能够在更短的时间内，获得试验所要求的肿瘤细胞数量至关重要，研制过程每缩短一秒钟，就意味着可以多挽救一个生命。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用于制作面包和馒头等食品及酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5-10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，酵母被用作研究真核生物的模式生物。酿酒酵母被认为是最具潜力的大规模生产菌种。 酿酒酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，测序工作于1996年完成。酿酒酵母具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。
线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。其直径在0.5到1.0微米左右。大多数真核细胞或多或少都拥有线粒体。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法，该方法构建了一种乳腺肿瘤类的工程细胞，与普通乳腺肿瘤细胞相比较，该种细胞具有更快的生长速度，能够在更短的时间内生长到实验所需的细胞数量，大大缩短了实验周期。
为实现上述目的，本发明所采用的具体技术方案如下：
本发明提供了一种酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法，包括以下步骤：
（1）将平板培养基上的酿酒酵母菌接种于液体培养基中，放置于摇床培养至对数生长期，得酿酒酵母细胞；
（2）将液体培养基倒入离心管中，经多步差速离心法，获得酵母细胞线粒体粗提物；
（3）将酵母细胞线粒体粗提物置于超速离心管中，利用蔗糖密度梯度离心法，获取纯化的酵母细胞线粒体；
（4）将纯化的酵母细胞线粒体以190μg/ml的浓度添加至96孔板培养的MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的培养液中，共孵育培养12小时，即得到含有酵母细胞线粒体的乳腺肿瘤细胞。
进一步的，步骤（1）中，所述酿酒酵母细胞具体的培养方法为：
1）称取2.5%葡糖糖、2.5%蛋白胨、1%酵母浸粉，用蒸馏水溶解，定容；
2）将培养基分装至锥形瓶中，经115℃高压灭菌15-20分钟，按2-10%的接种量将酿酒酵母菌接入培养基中，30-35℃摇床培养36-48小时即可。
进一步的，步骤（2）中，所述酵母细胞线粒体粗提物的具体获取步骤为：
1）将液体培养基4000g×5min离心，收集细胞；
2）采用蒸馏水重悬细胞，洗去细胞表面的培养基，重复一次；
3）称量细胞重量，按照2.5ml/g细胞加缓冲液A重悬细胞，30-35℃振摇20-30分钟，而后4000g×5min离心收集细胞；
4）将收集的细胞用缓冲液重悬，将细胞洗两次；
5）将每克细胞（湿重）中加入35mg蜗牛酶，并按照4ml/g加入缓冲液B，在37℃保温1-2h，获得原生质体，然后10000g×10min离心，收集沉淀；
6）加入与原生质体体积相等的玻璃珠，并按照5ml/g加入缓冲液C，在旋涡震荡仪上破碎细胞，而后1500g×5min离心，收集上清液，将沉淀重复破碎离心一次，合并两次的上清液；
7）将上清液4000g×5min离心，收集沉淀，用2.5ml/g的缓冲液C重悬沉淀，13000g×15min离心，收集线粒体沉淀；
8）用2倍体积的缓冲液D轻轻重悬线粒体沉淀，13000g×15min离心，得到线粒体粗提物，保存于4℃；
酵母细胞线粒体粗提物的获取步骤均在4℃下进行。
进一步的，步骤（3）中，所述蔗糖密度梯度离心法获得酵母细胞纯化线粒体的步骤为：
1）用缓冲液E配制质量分数分别为60%，32%，23%，15%的蔗糖溶液；
2）超速离心管自下而上上样为1.5ml的60%蔗糖溶液，4ml的32%蔗糖溶液，1.5ml的23%蔗糖溶液，1.5ml的15%蔗糖溶液，4-6ml保存于缓冲液D中的线粒体粗提物；
3）2℃，140000g离心1-1.5h，轻轻取出离心管，在蔗糖浓度60%和32%的界面处，即为纯化的酵母细胞线粒体，取出；
4）用缓冲液D将纯化的线粒体重悬，2℃，10000g×10min离心，洗涤两次，保存于EP管中。
上述培养过程中，所述乳腺肿瘤细胞的细胞培养基为DMEM培养基；所述缓冲液A为：12.114g的Tris-Base，硫酸调pH到9.4,2.5ml的4M的DTT溶液，加水定容至1L；所述缓冲液B为：218.604g的山梨糖醇，13.954g的K2HPO4，2.692g的KH2PO4，加水定容至1L；所述缓冲液C为：50ml的100mM的Tris-HCL，54.8g的山梨糖醇，1ml的0.5M的EDTA，5ml的0.1M的PMSF，1g的BSA，加水444ml；所述缓冲液D为：4.5543g的蔗糖，10ml的0.1M的Mops，10ml的10mM的EDTA，加80ml的水；所述缓冲液E为:10ml的0.1M的Mops，10ml的10mM的EDTA，加80ml的水。
进一步的，所述MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞在培养液中进行贴壁培养，待细胞生长至50-80%即可。
本发明采用BCA蛋白测定法，测定所提取的纯化的酵母细胞线粒体的蛋白浓度，并用缓冲液D稀释至190μg/ml，以10-20μl/ml的剂量添加至96孔板培养的MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的培养液中共孵育培养12小时，即得到含有酵母细胞线粒体的乳腺肿瘤细胞。
本发明的有益效果为：
1、本发明所培养的工程细胞，具有较快的生长速度，能在较短的时间内达到实验所需的细胞数量，大大缩短了实验周期。
2.本发明所述的工程细胞构建方法，较为简单，原材料成本较低。
3.本发明所构建的工程细胞，具有与原细胞系相同的细胞性质，能够较好地满足实验要求。
附图说明
图1为双光子荧光显微镜图。
图2为细胞的存活率图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述方法思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包含在本发明的范围内。
实施例1
（一）培养酿酒酵母细胞
1）称取2.5%葡糖糖、2.5%蛋白胨、1%酵母浸粉，用蒸馏水溶解，定容；
2）将培养基分装至锥形瓶（100ml/瓶）中，经115℃高压灭菌15-20分钟，按2-10%的接种量将酿酒酵母菌接入培养基中，30-35℃摇床培养36-48小时，得发酵液；
（二）获取酵母细胞线粒体粗提物
1）4℃，4000g×5min离心收集细胞；
2）蒸馏水重悬细胞，洗去细胞表面的培养基，重复一次；
3）称量细胞重量，按照2.5ml/g细胞加缓冲液A重悬细胞，30-35℃振摇20-30分钟，而后4℃，4000g×5min离心收集细胞；
4）用缓冲液重悬，将细胞洗两次（4℃环境下进行）；
5）按照每克细胞（湿重）35mg加入蜗牛酶，并按照4ml/g加入缓冲液B，在37℃保温1-2h，溶解细胞壁，获得原生质体，然后10000g×10min离心，收集沉淀（4℃环境下进行）；
6）用玻璃珠法破碎细胞：加入与原生质体体积相等的玻璃珠，并按照5ml/g加入缓冲液C，在旋涡震荡仪上破碎细胞，而后1500g×5min离心，收集上清液，将沉淀重复破碎离心一次，合并两次的上清液（4℃环境下进行）；
7）将上清液4000g×5min离心，收集沉淀，用2.5ml/g的缓冲液C重悬沉淀，13000g×15min离心，收集线粒体沉淀（4℃环境下进行）；
8）用2倍体积的缓冲液D轻轻重悬线粒体沉淀，13000g×15min离心，得到线粒体粗提物，保存于4℃（4℃环境下进行）；
（三）获取酵母细胞纯化线粒体
1）用缓冲液E配制质量分数分别为60%，32%，23%，15%的蔗糖溶液；
2）超速离心管自下而上上样为1.5ml的60%蔗糖溶液，4ml的32%蔗糖溶液，1.5ml的23%蔗糖溶液，1.5ml的15%蔗糖溶液，4-6ml保存于缓冲液D中的线粒体粗提物；
3）2℃，140000g离心1-1.5h，轻轻取出离心管，在蔗糖浓度60%和32%的界面处，即为纯化的酵母细胞线粒体，取出；
4）用缓冲液D将纯化的线粒体重悬，2℃，10000g×10min离心，洗涤两次，保存于EP管中；
（四）采用BCA法测定纯化的酵母细胞线粒体蛋白浓度；
（五）以190μg/ml的浓度添加至96孔板培养的MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的培养液中，共孵育培养12小时，即得到含有酵母细胞线粒体的乳腺肿瘤细胞。
实施例2 酵母细胞线粒体通过共孵育进入了乳腺肿瘤细胞
将提取的纯化的酿酒酵母细胞线粒体立即用线粒体红色荧光探针进行标记，为防止有过量荧光探针影响实验结果，将标记的线粒体用缓冲液D重悬再离心，洗涤三次，洗去多余的荧光染料，与MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞进行12小时共孵育，而后使用DAPI试剂染色细胞核，用于细胞定位，于双光子荧光显微镜下观察。如图1
由双光子荧光显微镜图像可以看出，在细胞核（蓝色）附近，所聚集的被染色的酵母细胞线粒体（红色），已进入乳腺肿瘤细胞。
实施例3 MTT实验
对于提取的纯化的酵母细胞线粒体，用线粒体蛋白浓度来进行定量，对于MDA-MB-231细胞添加蛋白浓度为0μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml,60μg/ml,70μg/ml,80μg/ml,90μg/ml,100μg/ml,110μg/ml,120μg/ml,130μg/ml,140μg/ml,150μg/ml,160μg/ml,170μg/ml,180μg/ml,190μg/ml,200μg/ml的线粒体，观察细胞的存活率。实验结果如图2所示。
从图2中可以看出，当添加的酵母细胞线粒体蛋白浓度在190μg/ml时，所构建的乳腺肿瘤工程细胞生长速度最快，达到了普通MDA-MB-231细胞的1.5倍。
从上述实施例可以得出，本发明提供的技术方案，具有以下优点：本发明所培养的工程细胞，具有较快的生长速度，能在较短的时间内达到实验所需的细胞数量，大大缩短了实验周期；本发明所述的工程细胞构建方法，较为简单，原材料成本较低；本发明所构建的工程细胞，具有与原细胞系相同的细胞性质，能够较好地满足实验要求。
Claims (5)
1.一种酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将平板培养基上的酿酒酵母菌接种于液体培养基中，放置于摇床培养至对数生长期，得酿酒酵母细胞；
（2）将液体培养基倒入离心管中，经多步差速离心法，获得酵母细胞线粒体粗提物；
（3）将酵母细胞线粒体粗提物置于超速离心管中，利用蔗糖密度梯度离心法，获取纯化的酵母细胞线粒体；
（4）将纯化的酵母细胞线粒体以190μg/ml的浓度添加至96孔板培养的MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的培养液中，共孵育培养12小时，即得到含有酵母细胞线粒体的乳腺肿瘤细胞；
所述酵母细胞线粒体粗提物的具体获取步骤为：
1）将液体培养基4000g×5min离心，收集细胞；
2）采用蒸馏水重悬细胞，洗去细胞表面的培养基，重复一次；
3）称量细胞重量，按照2.5ml/g细胞加缓冲液A重悬细胞，30-35℃振摇20-30分钟，而后4000g×5min离心收集细胞；
4）将收集的细胞用缓冲液重悬，将细胞洗两次；
5）将每克湿重细胞中加入35mg蜗牛酶，并按照4ml/g加入缓冲液B，在37℃保温1-2h，获得原生质体，然后10000g×10min离心，收集沉淀；
6）加入与原生质体体积相等的玻璃珠，并按照5ml/g加入缓冲液C，在旋涡震荡仪上破碎细胞，而后1500g×5min离心，收集上清液，将沉淀重复破碎离心一次，合并两次的上清液；
7）将上清液4000g×5min离心，收集沉淀，用2.5ml/g的缓冲液C重悬沉淀，13000g×15min离心，收集线粒体沉淀；
8）用2倍体积的缓冲液D轻轻重悬线粒体沉淀，13000g×15min离心，得到线粒体粗提物，保存于4℃；
所述获取步骤均在4℃下进行。
2.根据权利要求1所述的构建培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酿酒酵母细胞具体的培养方法为：
1）称取2.5%葡萄糖、2.5%蛋白胨、1%酵母浸粉，用蒸馏水溶解，定容；
2）将培养基分装至锥形瓶中，经115℃高压灭菌15-20分钟，按2-10%的接种量将酿酒酵母菌接入培养基中，30-35℃摇床培养36-48小时。
3.根据权利要求1所述的构建培养方法，其特征在于，步骤（3）中，所述蔗糖密度梯度离心法获得酵母细胞纯化线粒体的步骤为：
1）用缓冲液E配制质量分数分别为60%，32%，23%，15%的蔗糖溶液；
2）超速离心管自下而上上样为1.5ml的60%蔗糖溶液，4ml的32%蔗糖溶液，1.5ml的23%蔗糖溶液，1.5ml的15%蔗糖溶液，4-6ml保存于缓冲液D中的线粒体粗提物；
3）2℃，140000g离心1-1.5h，轻轻取出离心管，在蔗糖浓度60%和32%的界面处，即为纯化的酵母细胞线粒体，取出；
4）用缓冲液D将纯化的线粒体重悬，2℃，10000g×10min离心，洗涤两次，保存于EP管中。
4.根据权利要求3所述的构建培养方法，其特征在于，所述乳腺肿瘤细胞的细胞培养基为DMEM培养基；所述缓冲液A为：12.114g的Tris-Base，硫酸调pH到9.4,2.5ml的4M的DTT溶液，加水定容至1L；所述缓冲液B为：218.604g的山梨糖醇，13.954g的K2HPO4，2.692g的KH2PO4，加水定容至1L；所述缓冲液C为：50ml的100mM的Tris-HCL，54.8g的山梨糖醇，1ml的0.5M的EDTA，5ml的0.1M的PMSF，1g的BSA，加水444ml；所述缓冲液D为：4.5543g的蔗糖，10ml的0.1M的Mops，10ml的10mM的EDTA，加80ml的水；所述缓冲液E为:10ml的0.1M的Mops，10ml的10mM的EDTA，加80ml的水。
5.根据权利要求1-3任一项所述的构建培养方法，其特征在于，所述MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞在培养液中进行贴壁培养，待细胞生长至50-80%。
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