CN113005017B - 提升灵芝菌三萜化合物的光生物反应器及藻菌共生体系的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提升灵芝菌三萜化合物的光生物反应器及藻菌共生体系的构建方法，所述光生物反应器内设置隔挡膜，隔挡膜将光生物反应器分为第一培养箱和第二培养箱，第一培养箱用于培养蛋白核小球藻，第二培养箱用于培养灵芝菌，隔挡膜用于防止蛋白核小球藻细胞体和灵芝菌细胞体产生黏连和胶黏。采用光生物反应器构建藻菌共生体系的方法包括S1：将蛋白核小球藻细胞接种于第一培养箱内的PDB培养基；S2：将灵芝菌细胞接种于第二培养箱内的PDB培养基；S3：将蛋白核小球藻细菌和灵芝菌细胞接种后的光生物反应器置于恒温恒光的无菌室，温度设置为28‑30℃，光照强度设置为130μmol/m2/s‑150μmol/m2/s，培养10‑15天。本发明的藻菌共生体系对灵芝菌的三萜化合物的提升具有显著的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术制造领域，尤其涉及一种提升灵芝菌三萜化合物的光生物反应器及用光生物反应器提升三萜化合物含量的藻菌共生体系构建方法。
背景技术
抗肿瘤药物的研发一直是生物医药技术的研究热点，天然抗癌物质具有毒副作用小的巨大优势。三萜类化合物是一种典型的活性抗癌物质，而灵芝菌(Ganoderma lucidum)能够产生大量的三萜化合物，因此如何提升灵芝菌的三萜化合物含量成为备受关注的热点。目前，灵芝菌产生三萜类化合物产量的提升依然是这种活性抗癌物质提取的技术瓶颈之一。
发明内容
本发明提供一种提升灵芝菌三萜化合物的光生物反应器及藻菌共生体系的构建方法，本发明的藻菌共生体系对灵芝菌培养体系中三萜类化合物的提升具有显著的效果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种提升灵芝菌三萜化合物含量的光生物反应器，所述光生物反应器内设置隔挡膜，所述隔挡膜将所述光生物反应器分为第一培养箱和第二培养箱，第一培养箱用于培养蛋白核小球藻，第二培养箱用于培养灵芝菌，所述隔挡膜用于防止蛋白核小球藻细胞体和灵芝菌细胞体产生黏连和胶黏，但是细胞体之外的活性物质可以正常透过隔挡膜。
优选地，所述隔挡膜为孔径为0.22μm的水相聚醚砜膜。
优选地，所述光生物反应器长25cm、宽15cm、高15cm。
一种提升灵芝菌三萜化合物含量的藻菌共生体系构建方法，体系构建采用权利要求1-3任意一项所述的提升灵芝菌三萜化合物含量的光生物反应器，包括以下步骤：
S1：将5-10mL浓度为1×105cell/mL-5×105cell/mL的蛋白核小球藻接种于第一培养箱内的PDB培养基；
S2：将5-10mL浓度为1×105CFU/mL-5×105CFU/mL的灵芝菌接种于第二培养箱内的PDB培养基；
S3：将蛋白核小球藻细菌和灵芝菌接种后的光生物反应器置于恒温恒光的无菌室，温度设置为28-30℃，光照强度设置为130μmol/m2/s-150μmol/m2/s，培养10-15天；
其中步骤S1和S2不分先后顺序。
优选地，所述步骤S1中浓度为1×105cell/mL-5×105cell/mL的灵芝菌的具体培养为将处于对数期的蛋白核小球藻接种于PDB培养基中，进行无菌培养，培养3-5代，直至蛋白核小球藻细胞浓度达到1×105cell/mL-5×105cell/mL时用于藻菌共生体系的构建。
优选地，所述步骤S2中浓度为1×105CFU/mL-5×105CFU/mL的灵芝菌的具体培养为将处于对数期的灵芝菌接种于PDB培养基中，进行无菌光照培养，培养3-5代，直至灵芝菌细胞浓度达到1×105CFU/mL-5×105CFU/mL时用于藻菌共生体系的构建。
本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：
本发明发现蛋白核小球藻细胞产生的活性物质和产生的胞外多糖能够有效促进灵芝菌的生长和三萜类化合物的产量，并且利用光生物反应器将蛋白核小球藻和灵芝菌两种细胞采用隔挡膜分开培养，隔挡膜可以使蛋白核小球藻与灵芝菌细胞体分隔的同时，细胞之外的物质自由交换，有效避免了藻细胞和灵芝菌的黏连导致的对灵芝菌三萜化合物含量的检测。
平铺生长更有利于灵芝菌的生长和三萜类化合物的产生，因此，本发明提供了一种底部面积较大的光生物反应器，与传统的小型发酵罐培养相比，更有利于灵芝菌的生长和三萜类化合物产量的提升。
附图说明
图1为本发明的提升灵芝菌三萜化合物含量的光生物反应器结构示意图；
图2为本发明实施例的藻、菌、藻菌共生体系中三萜类化合物的含量对比图。
附图标记说明：1-第一培养箱；2-第二培养箱；3-隔挡膜；4-蛋白核小球藻；5-灵芝菌；6-蛋白核小球藻产生的活性物质(CGF)和胞外多糖；7-三萜化合物。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种提升灵芝菌三萜化合物的光生物反应器及藻菌共生体系的构建方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。
参看图1，一种提升灵芝菌三萜化合物含量的光生物反应器，光生物反应器长25cm、宽15cm、高15cm，光生物反应器内设置隔挡膜3，隔挡膜3将所述光生物反应器分为第一培养箱1和第二培养箱2，第一培养箱1用于培养蛋白核小球藻4，第二培养箱2用于培养灵芝菌5，隔挡膜3用于确保小球藻细胞体和灵芝菌细胞之间的胞外物质交换的同时使蛋白核小球藻细胞与灵芝菌分隔，蛋白核小球藻产生的活性物质(CGF)和胞外多糖6能够促进灵芝菌5的生长，进而促使灵芝菌三萜类化合物7的产生，隔挡膜3能够确保小球藻产生的活性物质(CGF)和胞外多糖6进入到第二培养箱2，促进了灵芝菌产生三萜化合物7，并且阻隔膜3有效避免了藻细胞和灵芝菌的黏连导致的对灵芝菌三萜化合物含量的检测。
其中隔挡膜3为孔径为0.22μm的水相聚醚砜膜。
一种提升灵芝菌三萜化合物含量的藻菌共生体系构建方法，体系构建采用提升三萜化合物含量的光生物反应器，包括以下步骤：
S1：将处于对数期的蛋白核小球藻接种于PDB培养基中，进行无菌培养，培养3-5代，直至蛋白核小球藻细胞浓度达到1×105cell/mL-5×105cell/mL时用于藻菌共生体系的构建；
将5-10mL浓度为1×105cell/mL-5×105cell/mL的蛋白核小球藻细胞接种于第一培养箱内的PDB培养基；
S2：将处于对数期的灵芝菌接种于PDB培养基中，进行无菌光照培养，培养3-5代，直至灵芝菌细胞浓度达到1×105CFU/mL-5×105CFU/mL时用于藻菌共生体系的构建
将5-10mL浓度为1×105CFU/mL-5×105CFU/mL的灵芝菌接种于第二培养箱内的PDB培养基；
S3：将蛋白核小球藻和灵芝菌接种完成的光生物反应器置于恒温恒光的无菌室，温度设置为28-30℃，光照强度设置为130μmol/m2/s-150μmol/m2/s，培养10-15天；
其中步骤S1和S2不分先后顺序。
实施例1
将处于对数期的蛋白核小球藻(购买于中国科学院淡水藻种库，编号FACHB-5)、灵芝菌(购买于中国普通微生物菌种保藏中心，编号5.896)分别接种于新鲜配制且灭菌的PDB培养基中，进行无菌培养，共培养3代，生长情况稳定且藻细胞浓度达到1×105cell/mL时用于藻菌共生体系的构建；分别取5mL蛋白核小球藻细胞和灵芝菌，分别接种于装有500mL已灭菌的PDB培养基的光生物反应器的第一培养箱和第二培养箱。
设置了单种蛋白核小球藻体系、单种灵芝菌体系、藻菌分隔培养体系、藻菌混合培养体系，单种蛋白核小球藻体系、单种灵芝菌体系为光生物反应器中第一培养箱和第二培养箱都接种蛋白核小球藻或灵芝菌；藻菌分隔培养体系为将蛋白核小球藻接种于第一培养箱，灵芝菌接种于第二培养箱，其中藻菌比例为1:1(1×105cell/mL：1×105CFU/mL)、1:2(1×105cell/mL：2×105CFU/mL)、1:3(1×105cell/mL：3×105CFU/mL)；藻菌混合培养体系为将蛋白核小球藻和灵芝菌接种在一个培养基中，同样藻菌比例有1:1(1×105cell/mL：1×105CFU/mL)、1:2(1×105cell/mL：2×105CFU/mL)、1:3(1×105cell/mL：3×105CFU/mL)。
接种完成的培养基置于恒温恒光照的无菌室内培养，温度设置为30℃，光照强度设置为130μmol/m2/s，培养15天。
然后检测培养体系中的三萜化合物的含量，步骤如下：
(1)取灵芝菌菌液或混合培养体系中的菌液，经真空泵抽滤，经已灭菌的去离子水离心洗涤3次(8000-10000g/min，4℃，3-5min)，弃去上清液取沉淀烘干(105-120℃)，将烘干后的粉末研磨备用。
(2)取一定量灵芝菌菌丝粉末，置锥形瓶中，加入5-10mL体积分数为75％的乙醇浸泡1-1.5h。
(3)将浸泡后的菌丝粉末进行超声处理(60-90W，15-30min)。
(4)超声处理后的粉末进行过滤，将滤液置于干净的烧杯中，用适量体积分数为75％的乙醇洗涤滤渣，将洗液并和清澈的滤液合并转移入容量瓶，用无水乙醇定容至100mL。
(5)取0.1-0.2mL步骤(4)中的溶液置于试管中，待乙醇挥发干后加0.1-0.2mL的香草醛-冰醋酸溶液(5g香草醛加入100mL冰醋酸)。
(6)在步骤(5)的溶液中加0.5-0.8mL高氯酸后摇匀。
(7)将步骤(6)的溶液置于在水浴锅(50-70℃)中加热10-15min，加热处理结束后迅速置冰水中混合物中冷却5min。
(8)在步骤(7)中的溶液中加入1-5mL乙酸乙酯(优级纯)后摇匀。
(9)以与样品等量的蒸馏水作为空白对照，在546nm下使用分光光度计测定吸光度并用标准曲线计算三萜类化合物的浓度。
三萜化合物检测标准曲线绘制：取齐墩果酸(优级纯)3-5mg，加10-15mL无水乙醇作为对照，取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL对照组的溶液分别置15mL试管；将试管置于70-85℃挥干，试管恢复至室温时加入0.2mL新鲜配制的香草醛-冰醋酸溶液；加入高氯酸0.5-0.8mL后摇匀；将试管置于在水浴锅中(50-70℃)加热10-15min，加热处理结束后迅速置冰水中混合物中冷却5min；加入乙酸乙酯(优级纯)1-5mL并摇匀；在546nm波长下测吸光值，以吸光值A为纵坐标，齐墩果酸浓度c(mL/μg)为横坐标绘制标准曲线。
按照上述的三萜化合物含量的检测方法对上述实施例1中的培养体系中灵芝菌生长培养基中的三萜化合物的含量检测，结果如图2所示，从图中得到，藻菌分隔培养体系、藻菌混合培养体系的三萜化合物的含量均要显著高于单种灵芝菌体系；而藻菌分隔培养的三萜类化合物的含量要高于藻菌混合培养，这主要是藻菌混合培养，蛋白核小球藻细胞和灵芝菌细胞发生胶黏，导致分泌的三萜化合物含量不高，其中藻菌分隔体系中，藻菌比为1:1的分隔培养是三萜类化合物产量最高的体系。
综上所述，本发明的光生物发生器能够提升灵芝菌三萜化合物含量。
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明做出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。
Claims (3)
1.一种提升灵芝菌三萜化合物含量的藻菌共生体系构建方法，其特征在于，所述藻菌共生体系构建采用光生物反应器，所述生物反应器内设置隔挡膜，所述隔挡膜将所述光生物反应器分为第一培养箱和第二培养箱，第一培养箱用于培养蛋白核小球藻，第二培养箱用于培养灵芝菌，所述隔挡膜用于防止蛋白核小球藻细胞体和灵芝菌细胞体产生黏连和胶黏；所述隔挡膜为孔径为0.22μm的水相聚醚砜膜；所述光生物反应器长25cm、宽15cm、高15cm；
所述藻菌共生体系构建方法包括以下步骤：
S1：将5-10mL浓度为1×105cell/mL-5×105cell/mL的蛋白核小球藻接种于所述第一培养箱内的PDB培养基；
S2：将5-10mL浓度为1×105CFU/mL-5×105CFU/mL的灵芝菌接种于所述第二培养箱内的PDB培养基；
S3：将蛋白核小球藻和灵芝菌接种完成的光生物反应器置于恒温恒光的无菌室，温度设置为28-30℃，光照强度设置为130μmol/m2/s-150μmol/m2/s，培养10-15天；
其中步骤S1和S2不分先后顺序。
2.根据权利要求1所述的提升灵芝菌三萜化合物含量的藻菌共生体系构建方法，其特征在于，所述步骤S1中浓度为1×105cell/mL-5×105cell/mL的灵芝菌的具体培养为将处于对数期的蛋白核小球藻接种于PDB培养基中，进行无菌培养，培养3-5代，直至蛋白核小球藻细胞浓度达到1×105cell/mL-5×105cell/mL时用于藻菌共生体系的构建。
3.根据权利要求1所述的提升灵芝菌三萜化合物含量的藻菌共生体系构建方法，其特征在于，所述步骤S2中浓度为1×105CFU/mL-5×105CFU/mL的灵芝菌的具体培养为将处于对数期的灵芝菌接种于PDB培养基中，进行无菌光照培养，培养3-5代，直至灵芝菌细胞浓度达到1×105CFU/mL-5×105CFU/mL时用于藻菌共生体系的构建。
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