CN101914526B - 血清或血浆中微小rna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效富集血清或血浆中微小RNA的提取方法，用Trizol和氯仿预分离样品中微小RNA，然后通过标记有-Si-OH功能基团的磁珠的方法捕获预分离样品中的微小RNA，用磁性分离器分离磁珠及样品；经过简单的洗涤干燥后，加无RNA酶水后通过水浴箱加热洗脱，进一步通过磁性分离器分离即可。本发明的方法可用于候选疾病标志物微小RNA的大规模验证和临床应用时的微小RNA的提取。本发明方法能高效富集血清或血浆中微小RNA，不仅方便快捷，且价格低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及血清或血浆中微小RNA的提取方法。
背景技术
微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类全长为19～25个核糖核苷酸的非编码调控单链小分子RNA，由一段具有发卡环结构的单链RNA前体剪切后生成，通过与目标mRNA(messenger RNA，信使RNA)分子的3-端非编码区域(3-UTR)互补配对使目标mRNA分子的翻译受到抑制，从而在转录后对靶基因的表达水平进行调控。
根据miRBase数据库(the microRNA database)的记载，现已发现的miRNAs达9500多个，研究证实很多miRNAs与疾病的发生发展有关，尤其值得的关注的是与肿瘤发生发展密切相关。近来，一些研究发现，miRNAs可以在血清或血浆中稳定存在，并且许多疾病患者的血清或血浆中的一些miRNAs的表达明显与正常人不同，可以作为一种特异的疾病标志物进行测定。Mitchell等发现miRNA-141在25例前列腺癌患者血清中均高表达，可以达到60％的敏感性、100％的特异性，并且与前列腺特异性抗原(PSA)的表达水平有一定的关系。近来Resnick等对卵巢上皮癌患者血清中的miRNAs也进行了测定：28例患者的血清均在治疗前收集，以正常未婚者作对照，结果显示：miR-21、miR-92、miR-93、miR-126、miR-29b在患者中明显高表达，而miR-155、miR-127、miR-99b则低表达，并且发现miR-21、miR-92、miR-93在患者CA-125(癌抗原-125)升高以前出现，所以预示着这3种miRNAs可以作为癌基因治疗靶点及卵巢上皮癌早期发现的标志物。各种肿瘤的临床用药均存在不同程度的损伤肝功能的副作用，Wang等在小鼠肝损伤模型中发现一些在肝组织中高表达的miRNAs，如miR-122、miR-192可以在小鼠血清中持续高表达，这些血清中的miRNAs在肝损伤早期就可以检测出来，所以他们提出miR-122、miR-192可以作为药物性肝损伤的早期诊断指标。
由于血清或血浆中miRNAs比较稳定，且其具有潜在的疾病标志物的巨大价值。对于肿瘤患者诊断具有较好的敏感性及特异性，加上取材的相对无创性，显示出了其作为肿瘤标志物的优势，但距临床应用还有一定距离。首先血清或血浆中miRNAs提取是关键的一个步骤，现有一些miRNAs提取试剂盒可以用于血清或血浆中miRNAs提取，如美国Qiagen公司的miRNeasy mini kit，但由于其价格比较贵而限制了其大规模应用。
发明内容
本发明提供了一种血清或血浆中微小RNA的提取方法，能有效富集血清或血浆中微小RNA，提取效率与现有大公司的试剂盒相当，而价格仅是它们的1/3以下，有利于血清或血浆中微小RNA在临床的验证和推广应用。
一种血清或血浆中微小RNA的提取方法，依次包括以下步骤：
(1)将血清或血浆样本与RNA抽提试剂以体积比为1∶1.5～2.5在第一离心管内震荡混合后静置，再向第一离心管中加入氯仿震荡混合，并在4～6℃温度下离心分离得到上层液体，为预分离样品；
由于所述的血清或血浆样本通常是预先保存在-70℃以下的，因此在使用前需要在冰上预先融解，然后分装到第一离心管中，再与RNA抽提试剂混合；离心分离在4～6℃温度下进行，可有效保持预分离样品中微小RNA的稳定性；
为了去除预分离样品中杂质，重复所述的加入氯仿震荡混合并在4～6℃温度下离心分离的操作至少一次；
(2)将步骤(1)得到的预分离样品收集在第二离心管中，并向第二离心管中加入标记有-Si-OH功能基团的磁珠，混合均匀后静置，使得所述的磁珠充分捕获预分离样品中的微小RNA；再将第二离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，这样在第二离心管中得到(仅剩下)捕获有微小RNA的磁珠；
(3)向经步骤(2)分离后得到的装有捕获有微小RNA的磁珠的第二离心管中，加入高盐缓冲液混合均匀，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体；再向第二离心管中加入体积百分比为70～75％的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体，得到洗涤后的捕获有微小RNA的磁珠；
由于经过步骤(2)分离得到的磁珠不仅捕获了大量微小RNA，还吸附了一些杂质，经过高盐缓冲液的洗涤和分离，有效除去这些杂质，再采用无毒易挥发的乙醇进一步洗涤和分离，除去了高盐缓冲液可能引入的杂质；
为了达到更好的洗涤效果，重复所述的加入高盐缓冲液混合均匀，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次；
同样，为了达到更好的洗涤效果，重复所述的加入体积百分比为70～75％的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次；
(4)干燥步骤(3)得到的第二离心管中的磁珠，再向第二离心管中加入洗脱液，在60～70℃的水浴下静置，从磁珠上洗脱捕获的微小RNA；
在60～70℃的水浴下洗脱，既可保证洗脱效率和效果，尽可能获得大量的微小RNA；又可保证不破坏微小RNA的结构，避免微小RNA变性，保证提取样品的质量。
(5)将步骤(4)得到的第二离心管先在室温离心，再置于所述的磁性处理器上分离，吸取离心管内液体进行收集，即为含有微小RNA的提取样品。通常，将收集的含有微小RNA的提取样品保存在-70℃以下待用。
本发明中，所述的RNA抽提试剂优选为trizol试剂，所述的trizol试剂方便易得，可以从各种商业途径购买获得，如可从美国invitrogen公司购得；同时，本发明中所述的trizol试剂可高效富集血清或血浆中的微小RNA。
本发明中，步骤(1)中血清或血浆样本与RNA抽提试剂的体积比优选为1∶2，此时富集微小RNA的效果最好。
本发明中，所述的标记有-Si-OH功能基团的磁珠可以通过商业途径购买得到，比如美国Chemicell公司的SiMAG/MP-DNA或者geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的磁珠。本发明中，优选采用直径为1um～2um的磁珠，与微小RNA结合具有最佳的结合效果，能更有效地捕获微小RNA。
本发明中，所述的磁性处理器为内部设有磁铁的装置，可设有各种形状的支架，其具有磁力并可分离磁珠。当含有磁珠的反应体系放置在磁性处理器上时，在磁力的作用下，溶液中本来相对均匀分布的磁珠集中在磁极方向，从而达到分离磁珠的目的。
本发明中，所述的高盐缓冲液为5mol/L硫氰酸胍，也可以直接使用美国Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的Wash-Buffer I。从成本方面考虑，优选所述的高盐缓冲液为5mol/L硫氰酸胍。
本发明中，所述的洗脱液优选为无RNA酶的双蒸灭菌水，或经过DEPC处理的双蒸灭菌水，保持提取样品中微小RNA的完整。
所述的无RNA酶的双蒸灭菌水可以从各种商业途径购买到，如北京百泰克生物技术有限公司；所述的经DEPC处理的双蒸灭菌水的制备方法如下：去离子水经0.1％焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate，DEPC)过夜处理后，再经高温高压灭菌制备而成。经DEPC处理的双蒸灭菌水中RNA酶失活。
本发明中，用Trizol试剂和氯仿提取血清或血浆样本中总RNA，得到预分离样品；然后采用标记有-Si-OH功能基团的磁珠来捕获预分离样品中的微小RNA，并用磁性分离器从预分离样品中分离得到捕获有微小RNA的磁珠；对捕获有微小RNA的磁珠进行简单的洗涤除去杂质后，干燥捕获有微小RNA的磁珠，并采用洗脱液加热洗脱捕获在磁珠上的微小RNA，最后通过磁性分离器分离，得到富集微小RNA的提取样品。
采用本发明方法提取血清或血浆中微小RNA，提取效率与现有大公司的试剂盒相当，而价格仅是它们的1/3以下(如Qiagen公司的miRNeasymini kit价格为人民币2864元，可以提取50份样品，即每个样品提取需要57.28元；而本发明提取每个样品只需要人民币15元左右)，有利于血清或血浆中微小RNA在临床的验证和推广应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明可有效富集血清或血浆中微小RNA，因此，采取本发明方法，可以快速、有效、低成本地提取血清或血浆中微小RNA。用本发明方法从每200μl血清或血浆提取的微小RNA就足够用于检测6个以上微小RNA，因此，本发明方法提取成本比较低，有利于候选疾病标志物微小RNA的大规模临床验证和后续的临床应用。
具体实施方式
下面结合实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
实施例1血清中微小RNA的提取
一种血清中微小RNA的提取方法，其具体步骤如下：
将预先保存于-70℃冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200μl血清样本到标记好的1.5ml的①号离心管中，然后加400μl的trizol试剂，震荡混合后静置8～10分钟；然后再向①号离心管加入100μl氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4℃条件下离心15分钟；从离心机里拿出①号离心管，吸取上层白色液体到1.5ml的③号离心管中；向③号离心管中加入100μl氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4℃条件下离心15分钟；从离心机里拿出③号离心管，吸取上层白色液体，为预分离样品；
将预分离样品收集在1.5ml的②号离心管中，并向②号离心管中加入50μl美国Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的磁珠，磁珠的直径为2um，混合均匀后室温静置8～10分钟；将②号离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，在②号离心管中得到捕获有微小RNA的磁珠；
将上述得到的②号离心管从磁性处理器中取出，向②号离心管中加入500μl geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的Wash-BufferI，混合均匀后室温静置2～3分钟，再将②号离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，重复Wash-Buffer I洗涤操作一次；将②号离心管从所述的磁性处理器中取出，向②号离心管中加入500μl体积百分比为70％的乙醇，混合均匀后室温静置2～3分钟，再将②号离心管置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体，重复乙醇洗涤操作一次，得到洗涤后的捕获有微小RNA的磁珠；
将②号离心管放入真空离心机抽滤，等②号离心管内磁珠干燥后，向②号离心管中加入40μl无RNA酶的双蒸灭菌水，放到水浴箱，60℃静置10分钟，从磁珠上洗脱捕获的微小RNA；将②号离心管从所述的水浴箱中取出放到离心机，室温8000g/min离心1分钟；将②号离心管从离心机取出置于磁性处理器上，吸取管内液体，即为含有微小RNA的提取样品。将得到的含有微小RNA的提取样品收集在新的离心管，作好标记保存于-70℃冰箱中待用。
实施例2本发明与其它方法提取血清中微小RNA的效果对比
对比例1
将预先保存于-70℃冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200μl到标记好的1.5ml①号离心管中，然后加400μl trizol，震荡混合后静置8～10分钟；然后再加入100μl氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4℃条件下离心15分钟；从离心机里拿出①号离心管，吸取上层白色液体到③号离心管中，加入100μl氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4℃条件下离心15分钟；从离心机里拿出③号离心管，吸取上层白色液体到②号离心管中，加入2倍上层液体体积异丙醇，混合均匀后放在-20℃冰箱过夜(大概16-18小时)；然后12000g/min，4℃条件下离心10分钟；倒掉液体，加入1毫升预冷的75％乙醇，12000g/min，4℃条件下离心10分钟；倒掉液体，等自然干燥后重溶于10μl无RNA酶水，作好标记保存于-70℃冰箱中待用。
对比例2
采用美国Qiagen公司的miRNeasy mini kit试剂盒。操作步骤如下：将预先保存于-70℃冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200μl血清样本到标记好的1.5ml①号离心管中，然后向①号离心管中加400μl试剂盒中的裂解液，震荡混合后静置8～10分钟；然后再加入100μl氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4℃条件下离心15分钟；从离心机里拿出①号离心管，吸取上层白色液体到③号离心管中，加入100μl氯仿，震荡混合后放入离心机，12000g/min，4℃条件下离心15分钟；从离心机里拿出③号离心管，吸取上层白色液体到②号离心管中，加入1.5倍体积的纯乙醇混合均匀；吸取700μl到试剂盒自配的柱子上，8000g/min，15℃条件下离心15秒；倒掉底部液体，再加剩余样品，在同样条件下离心；倒掉底部液体，加700μl RWT到柱子，8000g/min，15℃条件下离心15秒；倒掉底部液体，加500μl RPE到柱子，8000g/min，15℃条件下离心15秒；倒掉底部液体，加500μl RPE到柱子，8000g/min，15℃条件下离心2分钟；柱子转移到④号离心管，12000g/min，15℃条件下离心1分钟；加无RNA酶水40μl，把柱子转移到⑤号离心管中，8000g/min，15℃条件下离心1分钟，作好标记保存于-70℃冰箱中待用。
荧光定量PCR检测
将采用实施例1与对比例1和2的方法得到的含微小RNA的提取样品分别经过荧光定量PCR(PCR为Polymerase Chain Reaction的简写，即为聚合酶链式反应)检测进行比较。荧光定量PCR采用美国ABI(Appliedbiosystems)公司用于检测miR-191的成套试剂盒，包括
MicroRNA Assays，MicroRNA Reverse Transcription Kit和
Universal PCR Master Mix，NoUNG，采用TAGMAG探针法。
具体步骤如下：
A：miR-191反转录
反应试剂及用量
100mmol/L dNTPs：0.15ul
Multiscribe反转录酶(RT enzyme)：1ul
10×反转录缓冲液(10*RT buffer)：1.5ul
RNA抑制剂(RNase Inhibitor)：0.19ul
反转录引物(RT primers)：2ul
含微小RNA的提取样品(sample)：2ul
无核酸酶的水(Nuclease-free water)：8.2ul
反应体系：15ul/管。
反应程序：16℃·30分钟；42℃·30分钟；85℃·5分钟；4℃保存。
B：miR-191荧光定量PCR检测
TaqMan 2*Universal PCR Master Mix：10ul.
Nuclease-free water：7ul
Primer+probe：1ul
反转录产物：2ul
反应体系：20ul/管，2次重复。
反应程序：50℃·2分钟，95℃·10分钟-----95℃·15秒；60℃·60秒循环40次。
PCR检测结果见表1，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值(threshold)时所经历的循环数。荧光域值(threshold)采用30000。即Ct值越低说明起始miR-191含量越高。
表1
从表1可见，本发明方法的提取效果与世界上最公认的美国Qiagen公司的试剂盒(对比例2)效果接近，而明显优于其它方法(对比例1)。
实施例3血清中微小RNA的提取的重复性实验
将预先保存于-70℃冰箱的血清样本放在冰上融化，等融化后取200μl到标记好的1.5ml离心管中，采用与实施例1相同的方法提取微小RNA。重复三次，得到的含微小RNA的提取样品分别记为样本1，样本2，样本3。对三次重复实验提取得到的样本1，样本2和样本3进行荧光定量PCR分析，结果如表1所示。
其中，荧光定量PCR检测条件和步骤同实施例2相同，重复检测三次，检测结果如表2所示。荧光域值(threshold)采用30000。
表2
从表2中可见，采取本发明方法提取血清中微小RNA具有非常好的重复性。
实施例4血浆中微小RNA的提取
将预先保存于-70℃冰箱的血浆样本放在冰上融化，等融化后取200μl血浆样本到标记好的1.5ml的①号离心管中，接下来的实验步骤同实施例1。
另外，荧光定量PCR检测条件和步骤同实施例2相同，重复检测二次，检测结果如表3所示。荧光域值(threshold)采用30000。
表3
从表3中可见，采取本发明方法提取血浆中微小RNA也具有非常好的效果。
实施例5血清中微小RNA的提取
本实施例中除了把Wash-BufferI换成5mol/L硫氰酸胍，其它实验步骤同实施例1。
另外，荧光定量PCR检测条件和步骤与实施例2相同，重复检测二次，检测结果如表4所示。荧光域值(threshold)采用30000。
表4
从表4中可见，采取5mol/L硫氰酸胍为洗涤液提取血清中微小RNA也具有非常好的效果。
Claims (5)
1.一种血清或血浆中微小RNA的提取方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
（1）将血清或血浆样本与RNA抽提试剂以体积比为1：1.5~2.5在第一离心管内震荡混合后静置，再向第一离心管中加入氯仿震荡混合，并在4~6℃温度下离心分离得到上层液体，为预分离样品；所述的RNA抽提试剂为trizol试剂；
（2）将步骤（1）得到的预分离样品收集在第二离心管中，并向第二离心管中加入标记有-Si-OH功能基团的磁珠，所述的磁珠为美国Chemicell公司的geneMAG-RNA/DNA试剂盒中的磁珠，直径为1~2μm，混合均匀后静置；再将第二离心管置于磁性处理器上分离，移除管内液体，在第二离心管中得到捕获有微小RNA的磁珠；
（3）向经步骤（2）分离后得到的装有捕获有微小RNA的磁珠的第二离心管中，加入高盐缓冲液混合均匀，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体；再向第二离心管中加入体积百分比为70~75%的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体，得到洗涤后的捕获有微小RNA的磁珠；所述的高盐缓冲液为5mol/L硫氰酸胍；
（4）干燥步骤（3）得到的第二离心管中的磁珠，再向第二离心管中加入洗脱液，在60~70℃的水浴下静置，从磁珠上洗脱捕获的微小RNA；所述的洗脱液为无RNA酶的双蒸灭菌水，或经过DEPC处理的双蒸灭菌水；
（5）将步骤（4）得到的第二离心管先在室温离心，再置于所述的磁性处理器上分离，吸取离心管内液体进行收集，即为含有微小RNA的提取样品。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中，第一离心管内震荡混合的血清或血浆样本与RNA抽提试剂的体积比为1：2。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（1）中，重复所述的加入氯仿震荡混合并在4~6℃温度下离心分离的操作至少一次。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，重复所述的加入高盐缓冲液混合均匀，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤（3）中，重复所述的加入体积百分比为70~75%的乙醇，并置于所述的磁性处理器上分离，移除管内液体的操作至少一次。
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