CN111849963A - 一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法 - Google Patents

一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于核酸纯化技术领域，具体为一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)裂解：向步骤(1)所得动物组织病料中加入裂解液一，用匀浆器处理得到匀浆液，向匀浆液中加入氯仿，并于8000r/min下离心，静置分层得含有核糖核酸的料液；(3)吸附：向含有核糖核酸的料液加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(4)清洗：将磁珠和洗涤液混合均匀，除去洗涤液，完成一次清洗，重复上述步骤3次以上；(5)洗脱：将经过清洗的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(6)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。

Description

一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法
技术领域
本申请属于核酸纯化技术领域，具体为一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法。
背景技术
RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息传递过程中的桥梁。动物疾病对畜牧业以及人类的食品安全都有着重要的影响，采用分子生物学方法对动物组织进行病原菌诊断能够获得最准确的结果，而病菌和病毒的遗传信息载体为核糖核酸，然而RNA极易变性、降解，因此，如何从动物组织中提取有效的核糖核酸尤为重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本申请提供了一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，本申请是通过下述方案实现的：
一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)裂解：向步骤(1)所得动物组织病料中加入裂解液一，用匀浆器处理得到匀浆液，向匀浆液中加入氯仿，并于8000r/min下离心，静置分层得含有核糖核酸的料液；(3)吸附：向含有核糖核酸的料液加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(4)清洗：将磁珠和洗涤液混合均匀，除去洗涤液，完成一次清洗，重复上述步骤3次以上；(5)洗脱：将经过清洗的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(6)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。
优选的，所述步骤(2)所述的裂解液一为盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水。
优选的，所述盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水的质量比为 90:50:110:15:11:1000。
优选的，所述步骤(2)的离心温度为零下3℃。
优选的，所述步骤(3)所述的裂解液二为盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水。
优选的，所述盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水的质量比为 83:151:17:5:167:1000。
优选的，所述步骤(5)洗脱液为钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水。
10、如权利要求书7所述的一种用于动物组织病料核酸的快速提取方法，其特征在于，所述钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水的质量比为19:11:6:9:3:100。
优选的，所述步骤(6)中乙醇、醋酸钠和洗脱液的质量比为1:1:50。
有益效果：本申请所用的裂解液一可以有效抑制核糖核酸酶的活性，保证所提取的核糖核酸的纯度以及完整性；本申请通过对磁珠进行洗脱，可除去杂质；步骤简单，缩短提取时间，通过机械剪切力提取RNA，减少了化学因素对核酸的影响。
附图说明
图1为实施例所得核酸的电泳检测图。
具体实施方式
实施例1
一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)裂解：向步骤(1)所得动物组织病料中加入裂解液一，用匀浆器处理得到匀浆液，向匀浆液中加入氯仿，并于8000r/min下离心，静置分层得含有核糖核酸的料液；(3)吸附：向含有核糖核酸的料液加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(4)清洗：将磁珠和洗涤液混合均匀，除去洗涤液，完成一次清洗，重复上述步骤3次以上；(5)洗脱：将经过清洗的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(6)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。
优选的，所述步骤(2)所述的裂解液一为盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水。
优选的，所述盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水的质量比为 90:50:110:15:11:1000。
优选的，所述步骤(2)的离心温度为零下3℃。
优选的，所述步骤(3)所述的裂解液二为盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水。
优选的，所述盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水的质量比为 83:151:17:5:167:1000。
优选的，所述步骤(5)洗脱液为钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水。
优选的，所述钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6- 三异丙基苯基磺酰)咪唑和水的质量比为19:11:6:9:3:100。
优选的，所述步骤(6)中乙醇、醋酸钠和洗脱液的质量比为1:1:50。
实施例1所得核酸的电泳检测图如图1。
实施例2
一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)吸附：向经过研磨的核糖核酸加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(3)清洗：将磁珠和洗涤液混合均匀，除去洗涤液，完成一次清洗，重复上述步骤3次以上；(4)洗脱：将经过清洗的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(5)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。
优选的，所述步骤(2)所述的裂解液二为盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水。
优选的，所述盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水的质量比为 83:151:17:5:167:1000。
优选的，所述步骤(4)洗脱液为钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水。
优选的，所述钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6- 三异丙基苯基磺酰)咪唑和水的质量比为19:11:6:9:3:100。
优选的，所述步骤(5)中乙醇、醋酸钠和洗脱液的质量比为1:1:50。
实施例3
一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)裂解：向步骤(1)所得动物组织病料中加入裂解液一，用匀浆器处理得到匀浆液，向匀浆液中加入氯仿，并于8000r/min下离心，静置分层得含有核糖核酸的料液；(3)吸附：向含有核糖核酸的料液加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(4)洗脱：将步骤(3)的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(5)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。
优选的，所述步骤(2)所述的裂解液一为盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水。
优选的，所述盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水的质量比为 90:50:110:15:11:1000。
优选的，所述步骤(2)的离心温度为零下3℃。
优选的，所述步骤(3)所述的裂解液二为盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水。
优选的，所述盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水的质量比为 83:151:17:5:167:1000。
优选的，所述步骤(4)洗脱液为钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水。
优选的，所述钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6- 三异丙基苯基磺酰)咪唑和水的质量比为19:11:6:9:3:100。
优选的，所述步骤(5)中乙醇、醋酸钠和洗脱液的质量比为1:1:50。
实施例4
一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)裂解：向步骤(1)所得动物组织病料中加入裂解液一，用匀浆器处理得到匀浆液，向匀浆液中加入氯仿，并于8000r/min下离心，静置分层得含有核糖核酸的料液；(3)吸附：向含有核糖核酸的料液加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(4)清洗：将磁珠和洗涤液混合均匀，除去洗涤液，完成一次清洗，重复上述步骤3次以上；(5)洗脱：将经过清洗的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(6)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。
优选的，所述步骤(2)所述的裂解液一为盐酸胍、尿素、环己酮、醋酸钠和水。
优选的，所述盐酸胍、尿素、环己酮、醋酸钠和水的质量比为90:50:15:11:1000。
优选的，所述步骤(2)的离心温度为1℃。
优选的，所述步骤(3)所述的裂解液二为盐酸胍、碘化钠、EDTA、甘油和水。
优选的，所述盐酸胍、碘化钠、EDTA、甘油和水的质量比为83:17:5:167:1000。
优选的，所述步骤(5)洗脱液为草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水。
优选的，所述草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水的质量比为11:6:9:3:100。
优选的，所述步骤(6)中乙醇、醋酸钠和洗脱液的质量比为5:3:50。
将实施例1-4的核酸进行CT检测，CT值如下表，单位为亨氏。
样品1 样品2 样品3 平均值
实施例1 31.1 30.9 31.5 31.17
实施例2 22.8 20.9 21.3 21.67
实施例3 25.6 24.8 25.0 25.13
实施例4 19.6 19.0 19.7 19.43

Claims (9)

1.一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)研磨，将动物组织病料于液氮下研磨至粉末，后将研磨后的动物组织病料超声处理3次，处理条件为：功率350W，频率26kHz，超声时间5s，间歇1min；(2)裂解：向步骤(1)所得动物组织病料中加入裂解液一，用匀浆器处理得到匀浆液，向匀浆液中加入氯仿，并于8000r/min下离心，静置分层得含有核糖核酸的料液；(3)吸附：向含有核糖核酸的料液加入含有磁珠的裂解液二，静置，除去溶液得吸附有核糖核酸的磁珠；(4)清洗：将磁珠和洗涤液混合均匀，除去洗涤液，完成一次清洗，重复上述步骤3次以上；(5)洗脱：将经过清洗的磁珠至于洗脱液中，充分混合，除去磁珠得含有核糖核酸的洗脱液；(6)向洗脱液中加入乙醇和醋酸铵，充分搅拌后，静置、过滤得核糖核酸。
2.如权利要求书1所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述步骤(2)所述的裂解液一为盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水。
3.如权利要求书2所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述盐酸胍、尿素、异硫氰酸铵、环己酮、醋酸钠和水的质量比为90:50:110:15:11:1000。
4.如权利要求书1所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述步骤(2)的离心温度为零下3℃。
5.如权利要求书1所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述步骤(3)所述的裂解液二为盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水。
6.如权利要求书5所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述盐酸胍、二硫苏糖醇、碘化钠、EDTA、甘油和水的质量比为83:151:17:5:167:1000。
7.如权利要求书1所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述步骤(5)洗脱液为钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水。
8.如权利要求书7所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述钨酸钠、草酸钠、2-(三氟甲基)苯并咪唑、氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑、1-(2,4,6-三异丙基苯基磺酰)咪唑和水的质量比为19:11:6:9:3:100。
9.如权利要求书1所述的一种用于动物病理组织核酸的快速提取方法，其特征在于，所述步骤(6)中乙醇、醋酸钠和洗脱液的质量比为1:1:50。
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