CN106455621B - 蛋清处理 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及廉价且有效的制备蛋清(例如，从转基因鸡产下的蛋中获得)的方法，以从蛋清中批量层析分离蛋白质(例如，重组蛋白)。本发明还涉及过滤酸化的蛋清的方法和从蛋清中分离蛋白质的方法。

Description

蛋清处理
相关申请的交叉引用
本申请要求在2014年4月23日提交的美国临时申请第61/983,003号案的优先权，在此将其全文并入以供参考。
背景技术
转基因鸟类(例如，转基因鸡，鹌鹑或者火鸡)是用于获得外源重组蛋白的理想表达系统，所述外源重组蛋白可用于需要大量蛋白质供应的药物或其他的商业应用。一只母鸡每年可以产下多达330只鸡蛋，每只鸡蛋含有6.5g蛋白质。总蛋白质中约3.5g来自蛋清，其中7种不同的蛋白质占90％；卵清蛋白仅占有蛋清蛋白质的2g(约50％的蛋清蛋白质)。目前，已知来源于转基因动物的输卵管特定表达和从所述蛋清中收获的平均外源基因产物为每个鸡蛋约5至10mg。在鸡蛋中生产外源蛋白的优点可包括世代时间短和通过人工授精的繁殖率高。各种蛋白质已经在转基因鸡的鸡蛋中表达。可参阅，例如美国专利号6730822和美国公开号2006/0015960。
许多外源治疗性蛋白(例如，人重组蛋白，比如细胞因子(例如，红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(GC-SF)、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、抗体、和人体的溶酶体酶)是制药行业感兴趣的。治疗性蛋白易于从(例如)转基因鸡的蛋清中大量获得。然而，从所述蛋清中分离外源蛋白的传统方法，往往依赖于使用免疫亲和方法或仅适用于小规模生产(比如，包括总蛋清体积至多5L)的其它方法。对于大规模蛋白质生产，基于成本、劳动力和时间这种方法是不实用的。
发明内容
本发明基于如下意想不到的发现，即：向工业规模(例如，具有至少10L的体积)的蛋清池(例如，从诸如鸡、鹌鹑或者火鸡的转基因鸟所下的蛋中获得)中加入少量的酸性缓冲液(例如，单次大剂量注射(in a single bolus injection))，可以制备蛋清用于重组蛋白的批量层析分离，所述重组蛋白如无需稀释蛋清的来自蛋清的人治疗性蛋白。这种方法可以显著地减少需要经过下游分离/纯化过程的蛋清物质的量(例如，在层析分离中使用的柱的数量)，从而显著地减少了从蛋清中分离重组蛋白的成本、劳动力和时间。因此，本发明中描述的方法可以极大地提高蛋清制备的效率，从而用于大的、工业规模的治疗性蛋白生产。
一方面，本发明的特征在于一种制备用于批量层析处理的蛋清的方法，包括以下步骤：(1)将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中，每千克蛋清中所述酸性缓冲液的质量分数约0.5wt％至约5wt％；和(2)将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合，以形成pH约5至约6.5的混合蛋清。
另一方面，本发明的特征在于一种从蛋清中分离重组蛋白的方法，包括以下步骤：(1)提供含有重组蛋白的蛋清池，所述蛋清池的体积至少10L；(2)调节所述蛋清的pH至约5至约6.5，其中所述pH已调节的蛋清的电导率为约8mS/cm至约20mS/cm；(3)过滤所述蛋清以形成溶液(即，清液)；和(4)通过柱层析从蛋清中分离重组蛋白。
再一方面，本发明的特征在于一种过滤酸化的蛋清的方法，包括以下步骤：(1)使电导率在约8mS/cm和约20mS/cm之间的预处理缓冲液通过过滤器；和(2)使pH为约5至约6.5的蛋清通过所述过滤器得到过滤的蛋清。
具体实施方案可以包括一个或者多个下述特征。
所述酸化剂选自由乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、高氯酸、柠檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸构成的组。
所述酸性缓冲液可以进一步包括约5M至约6M(例如，约5.7M)的醋酸钠。
每千克蛋清中，所述酸性缓冲液的质量分数为约0.5wt％-约2wt％(例如，约0.7wt％-约1.5wt％、约0.9wt％-约1.4wt％、或约1.2wt％-约1.3wt％)。
所述酸性缓冲液的pH值为约4至约6.5(例如，约4、约4.5、约5、约5.5、约6.0或者约6.5)。
在将所述酸性缓冲液与所述蛋清混合之后，所述混合的蛋清的pH可以是约5至约6.5。在一些实施方案中，所述混合的蛋清的pH是约5至约6.3(例如，约5.7至约6.3、约5.8至约6.2、约5.9至约6.1、或者约6)。在一些实施方案中，所述混合的蛋清的pH是使所述混合的蛋清粘度最低的值。
所述蛋清可以混合至少约1h和/或在约2℃至约25℃的温度下混合。
所述蛋清池的体积至少约10L(例如，至少约50L)。
可以单次大剂量注射和/或至少约1L/min的速率将所述酸性缓冲液加入到所述蛋清池中。
向所述蛋清池中加入所述酸性缓冲液和混合所述蛋清可以同时进行。
所述方法可以进一步包括允许所述混合的蛋清沉降的步骤，以使所述蛋清分离成上层、中间层和下层。在这样的实施方案中，所述方法可以进一步包括分离所述中间层的步骤。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括在分离步骤之后过滤所述中间层。所述过滤可以包括使所述中间层的至少一部分(例如，全部)通过平均孔径在约0.1μm至约100μm的过滤器。在一些实施方案中，所述过滤可以包括使所述中间层的至少一部分通过多个过滤器。
所述方法进一步包括过滤所述混合的蛋清，而不允许所述混合的蛋清沉降。在这样的实施方案中，所述过滤步骤可以包括通过平均孔径为约0.1μm至约100μm的过滤器过滤所述混合的蛋清。在一些实施方案中，在初始过滤所述混合的蛋清后，所述过滤步骤可以包括1个或者多个后续过滤步骤，所述一个或者多个后续过滤步骤使用平均孔径为约0.1μm至约40μm的一个或者多个过滤器。
所述方法进一步包括在混合步骤之后的离心分离步骤，其中将所述混合的蛋清离心，以将含有卵粘蛋白(ovomucin)-溶菌酶复合物的沉淀物与上清液分离。
所述蛋清可以包括对蛋清外源的重组治疗性蛋白。
所述酸性缓冲液的电导率可以是约8mS/cm至约40mS/cm。
在每千克所述蛋清中所述酸性缓冲液的质量分数为约0.5wt％至约5wt％。
预处理缓冲液可以用于准备用于滤过酸化的蛋清的过滤器。所述预处理缓冲液可以具有与所述蛋清的pH基本相似或者相同的pH，范围是约5.0至约6.5。例如，所述预处理缓冲液的pH可为约5.9至约6.1(例如，约6)。
所述预处理缓冲液可以包括磷酸钠和氯化钠。
所述预处理缓冲液的电导率可为约10mS/cm至约20mS/cm。
所述酸化的蛋清的电导率可为约8mS/cm至约20mS/cm。
所述过滤器的过滤介质面积可为至少约8m2。
所述过滤器的平均孔径可为约0.1μm至约100μm。
所述蛋清可以在压力差小于约30psi(例如，小于约15psi)时通过所述过滤器。
所述实施方案具有以下优点。
通常，用于从蛋清中分离/纯化外源蛋白质的层析柱是非常昂贵的，这可能是在商业和工业规模生产来自蛋清中的重组蛋白的关键限制因素之一。因为仅使用少量的酸性缓冲液来获得酸化的蛋清，用于获得纯化的治疗性蛋白的所述酸化的蛋清的量显著减少(即，比常规稀释法少至少3-4倍)。因此，随后将所述酸化的蛋清装到柱子中消耗的时间也明显减少，这允许在工业过程中快速生产蛋白质。此外，因为在所述蛋清制备和分离/纯化过程中，一些治疗性蛋白对所暴露的环境敏感，通过减少样品体积使在制备和分离/纯化过程中花费的时间最小化，对通常涉及蛋清体积为500L或者更多的商业生产是非常有利的。总之，通过使用本文所述的方法，可以极大地使处理的时间、材料、劳力降低到最小。
从说明书和附图以及从权利要求中，其它特征，目的和优点将是显而易见的。
具体实施方案
本发明涉及制备蛋清(例如，从转基因鸡所产下的蛋中取得)的有效方法，以用于从蛋清中批量层析分离蛋白质(例如，重组蛋白)，以及从所述蛋清中分离蛋白质的方法。本文所述的方法制备的蛋清一般是适于批量层析处理的均匀的、低粘度的溶液。
在一些实施方案中，用作本文所述的方法的起始物质的蛋清可以包括蛋清外源的重组蛋白(例如，重组治疗性蛋白)。示例性的重组蛋白包括细胞因子，比如GC-SF、GM-CSF、红细胞生成素和干扰素(如干扰素-α或者干扰素-β)；人溶酶体酶；免疫球蛋白(例如，抗体)和结构蛋白。可以从批量层析处理中分离的其它示例性的重组蛋白已经在例如美国申请公开号2009/0299037中描述。
通常，本文所述的制备蛋清的方法包括(1)将适量含有酸化剂的酸性缓冲液(例如，占每千克所述蛋清的质量分数约0.5wt％至约5wt％)加入到蛋清池(例如，至少约10L的体积)；和(2)将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合，以形成具有合适pH(例如，pH范围约5至约6.5)的混合的蛋清。
通常，本文所述方法中使用的蛋清池具有工业规模并且体积相对较大。例如，所述蛋清池可以具有至少10L(例如，至少约50L、至少约100L、至少约200L、至少约300L、至少约400L、至少约500L、至少约600L、至少约700L、至少约800L、至少约900L、至少约1000L、至少约1500L、至少约2000L、至少约3000L、至少约4000L、至少约5000L、至少约10000L或者至少约20000L)的体积。制备蛋清作为起始物质用于本文所述的方法中，该制备蛋清的方法已经在例如美国申请公开号2009/0299037中描述。
在所述酸性缓冲液中的酸化剂通常可以是任意合适的酸(例如，有机酸或者无机酸)。示例性的酸化剂包括乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、高氯酸、柠檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸。在一些实施方案中，2种或者多种(例如，3种或者4种)酸的组合可以用作所述酸性缓冲液中的酸化剂。
在一些实施方案中，所述酸性缓冲液可以包括一种或多种盐(例如，碱性盐)。这种盐的例子可以是醋酸钠。在一些实施方案中，在所述酸性缓冲液中使用的盐可以是在所述酸性缓冲液中使用的酸化剂的盐。在其它实施方案中，在酸性缓冲液中使用的盐可以是与所述酸性缓冲液中使用的酸化剂不同的酸的盐。在一些实施方案中，所述酸性缓冲液可以包括约5M至约6M(例如，约5.7M)的盐(例如，醋酸钠)。不希望受到理论的束缚，据信使用这种浓度的盐可以产生具有适量的缓冲含量(buffering content)的酸性缓冲液。如果缓冲含量太高，所述酸性缓冲液可能会变得易燃和/或具有腐蚀性，使得所述缓冲液不能安全地维持、处理、和/或储存。如果缓冲含量太低，可能需要大量体积的酸性缓冲液将所述蛋清的pH值调节至目标值，从而降低了所述蛋清制备过程以及下游的(downstream)蛋白质分离/纯化过程的效率。
通常，在所述酸性缓冲液中使用的酸化剂和盐的量根据所述酸性缓冲液的所需pH而不同。在一些实施方案中，所述酸性缓冲液的pH为约4至约6.5(例如，约4至约5或者约4至约4.5)。例如，所述酸性缓冲液的pH为约4或pH为约4.5。
所述酸性缓冲液可以通过本领域已知的任意合适的方法制成。例如，所述酸性缓冲液可以通过将酸化剂加入含碱溶液，以将所述溶液的pH值调节到所需值而形成。例如，可以将冰醋酸溶液加入适量的NaOH中，得到含有5.7M醋酸钠的酸性缓冲液。
通常，相对于所述蛋清，所述酸性缓冲液的量是少的。例如，每千克所述蛋清中，所述酸性缓冲液的量为约0.5wt％至约5wt％(例如，约0.5wt％至约2wt％、约0.7wt％至约1.5wt％、约0.9wt％至约1.4wt％、约1wt％至约1.4wt％或约1.1wt％至约1.3wt％)。通常，由于没有预期到加入少量的酸性缓冲液会有效地将所述蛋清的pH值调节到目标值，制备适于批量层析处理的均匀的、低粘度的蛋清需要加入体积为所述蛋清体积的2-5倍(即200％至500％)的酸性缓冲液，。由于在所述蛋清制备过程中使用的层析柱和其它制备设备的尺寸限制，这种方法在大型生产规模上是不经济实用或可行的。意想不到地是，本发明人发现，通过加入与所述蛋清的量相比而言少量的酸性缓冲液(例如，每千克所述蛋清至多约5wt％)可以得到适于批量层析处理的均匀的、低粘度的蛋清，从而显著地减少了在层析分离过程中使用的柱的数量、这些方法中使用的其他设备的尺寸、以及从所述蛋清中分离重组蛋白的成本和时间。
不希望受到理论的束缚，据信与所述蛋清的量相比，加入相对较少的量的酸性缓冲液的另外的优点包括(1)可以忽略不计的蛋清稀释，(2)电导率上基本不改变，允许卵粘蛋白-溶酶菌复合物从蛋清中析出，转而降低了所述蛋清在较低的pH范围(例如，pH 5至6.5)下的粘度，并且有助于在过滤和层析处理期间从所述蛋清中分离不想要的物质，以及(3)使在粘蛋清中低pH袋(pH pocket)的形成最小化，所述pH袋可能损坏重组蛋白或者导致所述蛋清物质的pH不均匀。
通常，所述酸性缓冲液的电导率范围在约8mS/cm至约40mS/cm。例如，所述酸性缓冲液具有至少约8mS/cm(例如，至少约9mS/cm、至少约10mS/cm、至少约11mS/cm、至少约12mS/cm、至少约13mS/cm、至少约14mS/cm、至少约15mS/cm、至少约16mS/cm、至少约17mS/cm、至少约18mS/cm、至少约19mS/cm、至少约20mS/cm、至少约21mS/cm、至少约22mS/cm、至少约23mS/cm、至少约24mS/cm、至少约25mS/cm)和/或至多约40mS/cm(例如，至多约39mS/cm、至多约38mS/cm、至多约37mS/cm、至多约36mS/cm、至多约35mS/cm、至多约34mS/cm、至多约33mS/cm、至多约32mS/cm、至多约31mS/cm、至多约30mS/cm、至多约29mS/cm、至多约28mS/cm、至多约27mS/cm、至多约26mS/cm、至多约25mS/cm)的电导率。例如，所述酸性缓冲液可以具有在约8mS/cm和约40mS/cm之间的任意值的电导率。不希望受到理论的束缚，据信使用电导率在约8mS/cm至约40mS/cm的酸性缓冲液会使所述混合的蛋清的电导率的变化最小化，以使该方法可以用下游蛋白质分离步骤实施和简化(streamline)，而不改变在分离步骤使用的柱层析的分离条件并且不会引起进一步的沉淀和聚集。
在一些实施方案中，可以单次大剂量注射的方式将所述酸性缓冲液加入到蛋清池中。在一些实施方案中，用合适的注射速率(例如，至少约1L/min)进行单次大剂量注射，以确保在合适的时间内(例如，至多约5min)添加所述酸性缓冲液。不希望受到理论的束缚，据信使用单次大剂量注射的优点包括：(1)形成在重力作用下易于沉降的相对大的絮凝物，从而降低对大过滤器的需求，以及(2)避免对粘性蛋清池的连续滴定的需要，其可能会导致错误的pH读数而引发酸或碱的重复添加，进而可能损坏在所述蛋清中的重组蛋白并且提高了所产生的蛋清溶液的浊度。
在一些实施方案中，在将所述酸性缓冲液加入到所述蛋清池后，所述蛋清在适宜的温度(例如，约2℃至约25℃)下混合合适的时间(例如，至少约1h)以形成具有合适pH的混合的蛋清。在一些实施方案中，所述酸性缓冲液的加入和所述蛋清的混合可以同时进行。
通常，所述酸性缓冲液的加入和所述酸性缓冲液与所述蛋清的混合会导致大量的沉淀物(例如，卵粘蛋白-溶酶菌复合物)的形成。所述沉淀物通常会降低留在所述溶液中蛋清的粘度。
在一些实施方案中，所述混合的蛋清的pH是使混合的蛋清粘度最低的值。例如，所述混合的蛋清可以具有至少约5(例如，至少约5.2、至少约5.4、至少约5.6、至少约5.7、至少约5.8或者至少约5.9)和/或至多约6.5(例如，至多约6.3、至多约6.2或者至多约6.1)的pH。在一些实施方案中，所述混合的蛋清的pH约6。不希望受到理论的束缚，据信这样的pH(例如，约6)可以允许在重力作用下形成最大量的来自蛋清沉降的沉淀物，从而减少对过滤的需要并且有利于形成均匀的、低粘度的蛋清溶液。
通常，所述混合的蛋清(即，酸化的或者经pH调节的蛋清)具有相对低的电导率(例如，与未经酸性缓冲液处理的蛋清的电导率类似)。例如，所述混合的蛋清的电导率至少约8mS/cm(例如，至少约8.2mS/cm、至少约8.4mS/cm、至少约8.6mS/cm、至少约8.8mS/cm、至少约9mS/cm、至少约9.2mS/cm、至少约9.4mS/cm、至少约9.6mS/cm、至少约9.8mS/cm、至少约10mS/cm、至少约11mS/cm、至少约12mS/cm、至少约13mS/cm或至少约14mS/cm)和/或至多约20mS/cm(例如，至多约19mS/cm、至多约18mS/cm、至多约17mS/cm、至多约16mS/cm、至多约15mS/cm、至多约14mS/cm、至多约13mS/cm、至多约12mS/cm、至多约11.8mS/cm、至多约11.6mS/cm、至多约11.4mS/cm、至多约11.2mS/cm、至多约11mS/cm、至多约10.8mS/cm、至多约10.6mS/cm、至多约10.4mS/cm、至多约10.2mS/cm或者至多约10mS/cm)。例如，所述混合的蛋清的电导率可以为约8mS/cm至约20mS/cm中的任意值。不希望受到理论的束缚，据信将所述混合的蛋清的电导率保持在约8mS/cm至约20mS/cm，这将允许所述混合的蛋清符合下游蛋白质分离步骤的条件，从而所述混合的蛋清可以一致地用于所述分离步骤，而不改变在该步骤中使用的柱层析的分离条件。
混合完成之后，本文所述的方法可以包括允许所述混合的蛋清沉淀合适的时间(例如，至少约6h)的可选步骤，以使所述蛋清分离为上层、中间层和下层。通常，所述上层包括某些较低密度的不需要的物质(例如，变性蛋白质以及包括磷脂、甘油三酯和胆固醇的泡沫脂质)，所述下层包括蛋清蛋白形成的沉淀物(例如，卵粘蛋白-溶酶菌复合物)，并且所述中间层包括相对澄清的蛋清溶液。
在一些实施方案中，在所述沉淀步骤期间，如果所述混合的蛋清的pH落在所需值(例如，5.7±0.1、6.0±0.1或者6.3±0.1)之外，通过使用酸(例如，上述的酸性缓冲液)或者碱(例如，5.7M醋酸钠或者1N氢氧化钠溶液)调节所述混合的蛋清的pH值到所需的值。在这样的实施方案中，pH调节后可以在室温下另外进行混合(例如，至少约1h)和沉降(例如，至少约3h)。通常，总的混合和沉降时间不超过24h，以使所述蛋清中外源蛋白质暴露于处理环境的时间最小化，从而保持这些蛋白质的生物学活性。
在一些实施方案中，本文所述的方法可以在沉降步骤之后包括从所述混合的蛋清中分离中间层的步骤。通常，所述中间层可以使用本领域已知的方法分离。例如，可以通过将管(例如，金属或聚碳酸酯管)插入中间层(优选在中间层的中心)，将中间层从含有混合的蛋清的容器中虹吸出来，从而可将中间层的内容物(content)泵送到接收容器中而不干扰上层和下层。
通常，分离所述中间层之后，可以过滤所述中间层的至少一部分(例如，所有的中间层)，以除去悬浮在所述中间层的任意颗粒，以获得均匀的、低粘度、澄清的蛋清溶液。这个步骤也可以称为蛋清提纯(clarification)。在一些实施方案中，所述中间层可以通过一个或多个平均孔径至多约100μm的过滤器过滤(例如，至多约90μm、至多约80μm、至多约70μm、至多约60μm、至多约50μm、至多约40μm、至多约30μm、至多约20μm、至多约10μm、至多约9μm、至多约8μm、至多约7μm、至多约6μm、至多约5μm、至多约4μm、至多约3μm、至多约2μm或者至多约1μm)和/或至少约0.1μm(例如，至少约0.2μm、至少约0.3μm、至少约0.4μm、至少约0.5μm、至少约0.6μm、至少约0.7μm、至少约0.8μm、至少约0.9μm、至少约1μm、至少约2μm或者至少约3μm)。例如，过滤器可具有约0.1μm至约100μm(例如，约0.1μm至约40μm、约40μm至约100μm、约3μm至约6μm、或约0.1μm至约0.3μm)的平均孔径。
在一些实施方案中，可以通过彼此串联连接的多个过滤器过滤中间层，其中过滤器的平均孔径依次减小。例如，可通过包含三个串联连接的过滤器的过滤系统过滤中间层，其中，第一过滤器可具有约40μm的平均孔径，第二过滤器可具有约3μm至约6μm的平均孔径，并且第三过滤器可具有约0.1μm至约0.3μm的平均孔径。这种过滤系统的一个例子是包括从Pall公司商购的连续深层过滤器(例如，包括T2600、K200P和Bio10深层过滤器)的系统。任选地，所述过滤系统可以进一步包括在第三过滤器下游的第四过滤器(例如，具有约0.2μm的平均孔径)。第四过滤器的一个例子是得自Sartorius公司的Sartobran P过滤器。
在一些实施方案中，用于过滤所述中间层的过滤器可具有大的过滤介质面积。例如，所述过滤器可以具有至少约1m2(例如，至少约2m2、至少约4m2、至少约6m2或至少约8m2)的过滤介质面积。
在一些实施方案中，在将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合以形成混合的蛋清之后，可以过滤所述混合的蛋清，而不需要使所述混合的蛋清中的沉淀物沉淀。在这样的实施方案中，可以过滤所述混合的蛋清(包括在添加/混合步骤期间形成的沉淀物和剩余的蛋清溶液)，而不用预先从所述混合的蛋清中分离沉淀物。例如，在所述酸性缓冲液和所述蛋清混合后，可以通过使用本文所述的一种或多种过滤器(例如，包括具有孔径依次减小的三个串联连接的过滤器的过滤系统)过滤所述混合的蛋清而不沉淀。不希望受到理论束缚，据信通过减少沉淀步骤，这种方法可以显著地减少制备用于批量层析处理的蛋清和用于从蛋清中分离蛋白质的时间和成本。
在一些实施方案中，在将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合以形成混合的蛋清之后，可以将所述混合的蛋清离心，以从上清液中分离沉淀物(例如，卵粘蛋白-溶菌酶复合物)。然后可以通过使用本文所述的一种或多种过滤器过滤由此得到的上清液。
通常，所述过滤的蛋清溶液可以用于通过使用柱层析分离重组蛋白，比如离子交换层析或基于疏水相互作用的层析。这种层析方法的例子已在例如美国申请公开号2009/0299037中描述。
在一些实施方案中，本发明的特征在于从蛋清中分离重组蛋白的方法。例如，这样的方法可以包括以下步骤：(1)提供含有重组蛋白的蛋清池，所述池具有至少约10升的体积；(2)将所述蛋清的pH调节至约5至约6.5，其中所述经pH调节的蛋清的电导率为约8mS/cm至约20mS/cm；(3)过滤所述蛋清以形成溶液；以及(4)通过柱层析法分离所述蛋清中的重组蛋白。所述调节步骤可以通过与上述相同的方式向所述蛋清中加入少量的酸性缓冲液(例如，每千克蛋清约0.5wt％至约5wt％)来进行。过滤和分离步骤可以通过本文所述的方法或本领域已知的方法进行。
在一些实施方案中，本发明的特征在于过滤酸化的蛋清(例如，通过上述酸性缓冲液酸化的蛋清)的方法。例如，这样的方法可以包括以下步骤：(1)使电导率在约8mS/cm和约20mS/cm之间的预处理缓冲液通过过滤器；和(2)使pH为约5至约6.5的蛋清(例如，具有至少约50L的体积)通过所述过滤器以获得过滤的蛋清。然后，可以通过柱层析法将过滤的蛋清用于分离重组蛋白。在一些实施方案中，在这些方法中使用的过滤器可以与上述那些过滤器类似或相同。例如，所述过滤器可以具有与上述那些过滤器相同的平均孔径(例如，约0.1μm至约100μm)或过滤介质面积(例如至少约8m2)。
在一些实施方案中，所述预处理缓冲液可用于使所述蛋清(例如酸化的蛋清)通过过滤器之前润湿过滤器。所述预处理缓冲液可以包括一种或多种盐(例如碱性盐)。示例性盐包括磷酸钠和氯化钠。在一些实施方案中，所述预处理缓冲液可以包括磷酸钠和氯化钠的组合。
通常，所述预处理缓冲液可以包括酸。示例性酸包括乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、高氯酸、柠檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸。在一些实施方案中，两种或更多种(例如，三种或四种)酸的组合可以用于所述预处理缓冲液中。
在一些实施方案中，所述预处理缓冲液可以具有与所述蛋清的pH基本上相同的pH。例如，所述预处理缓冲液可以具有至少约5(例如，至少约5.2、至少约5.4、至少约5.6、至少约5.7、至少约5.8或至少约5.9)的pH和/或至多约6.5(例如，至多约6.4、至多约6.3、至多约6.2或至多约6.1)。在一些实施方案中，所述预处理缓冲液可具有约6的pH。不希望受到理论的束缚，据信，使用具有与所述蛋清的pH基本上相同的pH的预处理缓冲液来处理过滤器，可以将过滤器表面的pH调节至与所述蛋清的pH类似，从而使过滤期间蛋清的沉淀最小化，过滤期间蛋清的沉淀可能导致过滤器阻塞或阻碍样品的流动而在过滤器上引起剪切应力的，从而严重缩短所述过滤器的使用寿命。
通常，所述预处理缓冲液可以具有与所述蛋清的电导率相容的电导率，从而使所述过滤的酸化的蛋清与在下游分离/纯化过程中使用的柱层析(例如，离子交换层析)的特性相容。例如，所述预处理缓冲液的电导率可以为至少约8mS/cm(例如，至少约9mS/cm、至少约10mS/cm、至少约11mS/cm、至少约12mS/cm、至少约13mS/cm、至少约14mS/cm、至少约15mS/cm、至少约16mS/cm、至少约17mS/cm、至少约18mS/cm)，和/或至多约20mS/cm(例如，至多约19mS/cm、至多约18mS/cm、至多约17mS/cm、至多约16mS/cm、约15mS/cm、至多约14mS/cm、至多约13mS/cm、至多约12mS/cm或至多约11mS/cm)。例如，所述预处理缓冲液的电导率可以是在约8mS/cm和约20mS/cm之间的任意值。本发明人发现，使用未经上述预处理缓冲液处理的过滤器来过滤蛋清溶液将导致过滤器被过滤过程中形成的沉淀物快速堵塞。另一方面，本发明人出乎意料地发现，使用具有上述电导率的预处理缓冲液处理过滤器，可以调节过滤器表面的电导率使其与所述蛋清的电导率相似，从而使过滤期间所述蛋清的沉淀最小化并显著提高所述过滤器的使用寿命。
在一些实施方案中，所述蛋清可以在相对小的差压(例如，小于约30psi、小于约25psi、小于约20psi、小于约15psi、小于约12psi psi、小于约10psi或小于约5psi)下通过过滤器。不希望受到理论的束缚，由于过滤器可能非常昂贵，据信在相对小的压差下使所述蛋清通过过滤器可以将对过滤器的损坏和/或阻塞最小化，从而降低产品成本。
本文引用的所有出版物(例如，专利，专利申请出版物和文章)的内容通过引用的方式将其整体并入本文中。
以下实施例仅用于说明，而不用于限制。
实施例1：制备用于具有沉淀步骤的批量层析处理的蛋清的方法
将储存在-20℃下、在4L Nalgene瓶中的50至400千克冷冻蛋清在室温下在设定在21±1℃的水浴中解冻约5至7小时。将每个瓶从水浴中每小时取出一次，目视检查以确定解冻程度，反复颠倒并放回水浴中直到完全解冻。将已解冻的瓶子从水浴中取出，并在2至8℃下储存。在最后一瓶蛋清解冻后，将瓶中的蛋清汇集到顶部敞口的混合容器中。在pH4.0下，将含有5.7M醋酸钠(相对于蛋清的重量为约1.3％wt/wt)的酸性缓冲液以1千克/分钟的速度加入到解冻的蛋清池中，确保加入酸性缓冲液的持续时间不超过5分钟，从而在2至8℃得到最终目的pH 6.0±0.1。在无温度控制的顶部敞口的混合容器中连续搅拌蛋清混合物1小时，然后倒入密闭的一次性(single use)混合器中，在2至8℃冷藏，并混合6小时。在混合停止后，使沉淀物沉降6小时。根据需要，在2至8℃下使用5.7M醋酸钠或1N氢氧化钠进一步将pH调节至6.0±0.1，随后再混合1小时，并在室温下沉降3小时(混合和沉降的总时间不超过24小时)。在沉降完成后，所述混合的蛋清形成三层，即上层，中间层和下层。然后将管置于中间层中，并通过管将中间层虹吸或泵出而不干扰上层和下层。过滤器用每平方米过滤面积80升纯净水预先清洗(依次分别为40微米、3至6微米、0.1至0.3微米的Pall公司深层过滤器)以除去全部的有机碳、可过滤物和可提取物，然后排水。然后将预先清洗的过滤器用1个过滤器滞留体积的pH为6.0的含有20mM磷酸钠和140mM氯化钠的预处理缓冲液处理，然后排水。将蛋清溶液倒出，避开沉降的沉淀物和聚集的蛋清颗粒；并通过死端(dead end)过滤法以每种过滤器类型(filter type)1升/平方米的流速过滤或小于30psid的压差过滤，以除去任何未沉降的沉淀物质并收集到无菌一次性混合器中。在蛋清过滤完成时，用1个过滤器滞留体积的pH为6.0的含有20mM磷酸钠和140mM氯化钠的pH6.0的预处理缓冲液清洗过滤系统中保留的蛋清，从而回收产物并将其收集在无菌一次性混合器中。对所述过滤的蛋清溶液取样以用于酶活性和紫外(UV)吸光度的测量，并在2至8℃下储存至多24小时，然后通过柱层析法分离蛋清中的重组蛋白。表1显示了通过使用上述酸性缓冲液(即5.7M NaOAc、pH4.0和1.3％wt/wt)的蛋清酸化的结果。
表1
Figure BDA0001151716590000151
实施例2：没有沉降步骤的制备用于批量层析处理的蛋清的方法
在约24至72小时的时间内，在2至8℃下(在步入式冷室中)解冻400千克(+/-10％)的冷冻蛋清(-20℃)。将解冻的蛋清汇集到夹套式单次使用的密闭混合容器中并且温度保持在2至8℃。将pH为4.0的含有5.7M醋酸钠(1.08％wt/wt)的酸性缓冲液以1千克/分钟的速率加入到解冻的蛋清中，确保加入所述酸性缓冲液的持续时间不超过5分钟，以获得最终目的pH 6.0±0.5。将酸化的蛋清溶液在2至8℃下连续搅拌3小时。然后在过滤之前，将酸化的蛋清通过夹套罐加热至21±3℃。过滤器用每平方米过滤面积80升的纯净水预先清洗过滤器(依次分别为40微米、3至6微米、0.1至0.3微米的Pall公司的深层过滤器)以除去全部有机碳、可过滤物和可提取物。用pH为6.0的含有20mM磷酸钠和140mM氯化钠的预处理缓冲液置换过滤器系列(filter train)中的纯净水，直到过滤器流出物的电导率在预处理缓冲液可接受的电导率范围内(例如10至15mS/cm)。以1升/分钟/平方米/每种过滤器的流速、或在导致差压≤10psi的条件下，将均匀混合的酸化的蛋清通过死端过滤，以除去任何沉淀的或聚集的物质。使用体积相当于过滤器系列滞留体积的80％的初始过滤器流出物来置换预处理缓冲液，并在产物收集之前丢弃。将剩余的已过滤的预处理缓冲液和蛋清收集到无菌一次性混合器中。在蛋白过滤完成时，将过滤系统中保留的蛋清用1.5个过滤器系列滞留体积(当1个滞留体积保留在过滤器系列中时，收集0.5个滞留体积)pH为6.0的含有20mM磷酸钠和140mM氯化钠的预处理缓冲液冲洗，从而回收产物并将其收集在所述无菌一次性混合器中。对过滤的蛋清进行取样以测量酶活性和吸光度，并在2至8℃下储存至多24小时，然后通过柱层析法分离蛋清中的重组蛋白。
实施例3：缩减蛋清制备工艺的规模，以评估直接装样对深层过滤性能和蛋清酸化的鲁棒性的影响
原料
用于提纯研究的所有化学品均为USP/MC级。蛋清源材料在表2中列出。所有源材料在使用前储存在-20℃下并在2至8℃下解冻48至72小时。汇集源材料并将其保持在2至8℃直到酸化步骤。
表2：蛋清源材料
实验 蛋清等分试样(L) 滴度(g/L)* 接合性(Zygosity)
1 20 0.77 同源
2 20 1.02 同源
3 20 0.79 同源
*基于酶活性
对于所有缓冲液制备，在温度补偿至25℃的条件下，用pH/电导率计进行电导率测量。在20℃下测量缓冲液的pH。该过程中缓冲液制备配方在下表3中列出。
表3：缓冲液配方
Figure BDA0001151716590000171
处理设备
GE healthcare公司为Process skids(AKTA Explorers)提供服务(定期维修)。在整个特性研究期间，Synageva PD人员维护工艺设备(Pall Stax底盘(Chassis)和AKTAExplorers)。下表4列出了本实施例中使用的所有硬件设备。
表4：设备列表
Figure BDA0001151716590000181
使用表5所列的以下配置的STAX深层过滤器(40μm、3-6μm和0.1-0.3μm)和另外的Sartobran P0.2μm过滤器来设置Pall STAX底盘(PN#SXLSC02W)。
底盘#1：(底部)歧管→T2600→通气板(顶部)
底盘#2：(底部)歧管→K200P→通气板→歧管→Bio10→通气板(顶部)
将每个过滤器夹在1.5“入口/出口歧管(P/N：7008225)和顶部排气板之间。在初次水冲洗期间，根据经验来确定每个过滤器的滞留体积。
表5：深层过滤设备
Figure BDA0001151716590000191
柱XK 16/20(GE Healthcare公司)用作所有苯基疏水相互作用层析(PHIC)柱的填料。所有层析在装有Unicorn软件版本5.31(GE Healthcare公司)的AKTA Explorer上进行。
步骤
在开始提纯步骤之前，将冷冻的蛋清等分试样(总共20L)在2至8℃下解冻48至72小时。将解冻的蛋清汇集到具有无菌介质衬垫(Thermo Scientific/Hyclone P/N 343050-0005)的适当大小的聚丙烯罐(25L)中。在2至8℃下，使用顶置式混合器(330rpm)将汇集的蛋清混合至均匀。然后通过加入pH为4.0的5.7M醋酸钠将混合的蛋清调节至目的pH。表6列出了为实现目的pH进行的每次提纯实验中加入的5.7M醋酸钠的体积。监测pH超过2小时以确保达到目的pH。
表6：汇集的蛋清酸化
Figure BDA0001151716590000201
在过滤之前，用过滤的RO/DI水以80L/m2单独冲洗过滤器。在水冲洗期间，每个过滤器的滞留体积根据经验确定。在水冲洗完成后，将过滤器连接到连续的系列中并用16L/m2的PHIC平衡缓冲液(20mM磷酸钠、140mM氯化钠、pH 6.0)冲洗。当流出物的pH和电导率满足冲洗缓冲液规格(例如，pH6.0±0.1，电导率16.0±2.0)时，缓冲液冲洗结束。使用3/8”浸管(I/P 73管Cole)以1.0L/min连续混合(顶置式混合器，300rpm)的方式将混合的蛋清装入到过滤器系列上。收集80％的测量的累积滞留体积(～13.2L)并引至废物。然后将滤液收集在单独的适当大小的容器中，直到凝结的低密度沉淀物进入浸渍管。然后用1.5倍滞留体积(～25L)平衡缓冲液冲洗过滤器系列。使用干净的罐桨(tank paddle)将最终滤液充分混合以确保在上样之前的均匀性。在PHIC分离之前，滤液在2至8℃下储存过夜。
在PHIC分离之前，使用室温条件的水浴加热在2至8℃下储存的滤液。将滤液通过Sartobran 150柱(0.45um/0.22um，P/N 5231307H4-00)二次过滤，以产生最终的PHIC负荷。表7列出了所使用的缓冲液和过程中的参数。
表7：PHIC层析单元操作步骤
Figure BDA0001151716590000211
结果与讨论
(1)直接装样酸化的蛋清(即，没有沉降步骤)
最初，进行单中心点运行(“实验1”；1:20规模；pH约6的20L酸化的蛋清)以评价直接装样(无沉降，20L/m2的装样比)，对深层过滤性能建立代表性的实验模型。对于每个过滤器(即，T2600，K200P，Bio10)，虽然过滤器入口的进料压力在酸化的蛋清装样的过程中确实线性增加，但是压差不超过10psid。此外，在缓冲液冲洗期间，进料压力没有进一步增加，并且在过滤器T2600中表现出显著的降低。这些结果表明，在实验期间，直接装入到过滤器的酸化的蛋清没有明显阻塞所述过滤器。
蛋白回收结果总结在下表8中。如表8所示，提纯步骤后的蛋白回收率达到目标预期(>70％)。
表8：提纯后的蛋白回收
Figure BDA0001151716590000221
*基于酶活性
实验1的PHIC柱性能与包括酸化的蛋清沉降步骤的实验获得的结果相当。此外，通过使用4至20％三羟甲基氨基甲烷(Tris)-甘氨酸凝胶的SDS-PAGE检验来测量蛋白纯度。当与包括沉降步骤的实验相比时，来自实验1的PHIC洗脱部分没有在条带图案中显示任何差异。这些数据表明，在提纯(即过滤)期间将酸化的蛋清直接装样在产量和纯度方面不影响蛋白回收率或PHIC性能。
上述结果表明在提纯步骤期间可以将酸化的蛋清直接装样到过滤器中，而不经过沉降步骤。然后将该方法应用于下一部分中描述的鲁棒性研究实验(即实验2和3)。
(2)蛋清酸化的鲁棒性
使用2-因子、2-水平实验设计(高/低、低/高)来评估蛋清酸化步骤的鲁棒性。实验条件如表6所述。在实验2中，进行酸化24小时以达到5.67的最终pH(即约5.7)。在实验3中，进行酸化6小时以达到6.25的最终pH(即约6.3)。结果显示，由于T2600结垢增加，两个实验表现出相当的线性进料压力增加和相当的最大进料压力。在实验2中观察到较低的最大进料压力，据信这是由于蛋清pH和蛋清粘度(即，较低的蛋清pH导致较低的蛋清粘度)之间的相互关系。在任何情况下，进料压力都不超过10psig，示出了与实验1相当的性能。
在提纯步骤之后，实验2和3蛋白回收率分别为71％和83％，满足目标预期(即≥70％)并且与实验1(即79％)相当。在PHIC分离后，实验2和3中的蛋白产率分别为59％和68％，与包括沉降步骤的实验获得的结果相当。将实验2和3均与实验1比较的层析谱覆盖图证实了可比的柱性能。
上述结果表明酸化pH和时间的变化不会导致相对于酶活性或产率的任何明显的负面影响。因此，当提纯步骤在两个测试范围内(即酸化pH 5.7至6.3，酸化时间6至24小时)进行时是具有鲁棒性的。
(3)工艺中蛋清的稳定性
进行工艺保持(Process hold)研究以限定以下三个单元操作待检点(holdpoint)的最大保持时间(hold time)：(1)解冻的蛋清(2至8℃)，(2)酸化的蛋清(2至8℃和室温)，和(3)提纯的蛋清(2至8℃和室温)。在72至96小时的时间段内评价产物的稳定性(在酶活性方面)。进行两个单独的稳定性研究，以评估在酸化和提纯的蛋清步骤下，提纯参数方差对产物保持时间的影响。从上述两个鲁棒性实验(即实验2和3)的每一个中取出60mL等分试样(每个酸化和提纯的蛋清各两个)，并在2至8℃或室温下储存。每24小时取1.5mL样品直到72小时(pH 5.7/24小时)或96小时(pH 6.3/6小时)。由于时间限制，没有对实验1(中心点)进行稳定性研究。稳定性设计参数总结在下表9中。
表9：工艺中稳定性设计
Figure BDA0001151716590000241
*T＝0等于解冻起点(包括解冻时间的附加的保持时间)
**RT＝18-25℃(平均22℃)
结果显示，在2至8℃下，该工艺中所有三个待检点(解冻、酸化和提纯的蛋清)的酶活性在整个时间过程研究(高达96小时)内是稳定的。此外，酸化pH或酸化时间的变化通常对酶活性没有负面影响。用于酸化的蛋清待检点的单组测试参数(pH 5.7，室温)确实显示酶活性降低了～20％。然而，目前酸化的蛋清的商业方法储存目标温度为2至8℃，因此，该观察结果对于所述商业方法没有风险。基于所述数据，解冻/汇集的蛋清在2至8℃下可稳定长达168小时(包括最初的72小时解冻时间)，酸化的蛋清在2至8℃下可稳定长达96小时，提纯的蛋白阶段在2至8℃或室温下可稳定长达96小时。
(4)补充DNA清除研究
尽管蛋清本身不含有DNA，但是蛋清获取过程可能通过将少量蛋黄引入蛋清池而导致宿主基因组DNA的存在。对来自上述实验1至3的研究的酸化和提纯的蛋清进行宿主基因组DNA的分析。分析表明：
1、在合并的和酸化的蛋清中检测到DNA
2、鉴定在提纯步骤期间显著的DNA清除。
这些数据表明，除了蛋清宿主蛋白清除外，提纯步骤提供了从产物池中去除宿主基因组DNA的方法。
其他实施方案在所附权利要求的范围内。

Claims (44)

1.一种制备用于批量层析处理的蛋清的方法，所述方法包括以下步骤：
将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的0.5wt%至5wt%，并且所述酸性缓冲液包含5M至6M在所述酸性缓冲液中使用的酸化剂的盐；和
将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合以形成pH为5至6.5的混合的蛋清；
允许所述混合的蛋清沉降，以使所述蛋清分离成上层、中间层和下层。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸化剂选自由乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、氢氟酸、氢溴酸、高氯酸、柠檬酸、硼酸、酒石酸、乳酸、甲酸、草酸、尿酸和巴比妥酸组成的组。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述盐为醋酸钠。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述酸性缓冲液含有5.7M的醋酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的0.5wt%至2wt%。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的0.7wt%至1.5wt%。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的0.9wt%至1.4wt%。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有4至6.5的pH。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有4的pH。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有4.5的pH。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为5至6.3。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为5.7至6.3。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为5.8至6.2。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为5.9至6.1。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH为6。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合的蛋清的pH是使所述混合的蛋清的粘度最低的值。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清混合至少1小时。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清在2℃至25℃的温度下混合。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清池的体积至少10升。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述酸性缓冲液单次大剂量注射入所述蛋清池。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述酸性缓冲液以至少1L/min的速率加入。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酸性缓冲液的加入和所述蛋清的混合同时进行。
23.根据权利要求1所述的方法，进一步包括分离所述中间层的步骤。
24.根据权利要求23所述的方法，进一步包括在所述分离步骤之后过滤所述中间层。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述过滤包括使所述中间层的至少一部分通过平均孔径为0.1μm至100μm的过滤器。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述过滤包括使所述中间层的至少一部分通过多个过滤器。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述混合步骤之后进一步包括离心步骤，以离心所述混合的蛋清，从而从上清液中分离出包含卵粘蛋白-溶菌酶复合物的沉淀物。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋清包含对蛋清外源的重组治疗性蛋白。
29.一种从蛋清中分离重组蛋白的方法，包括：
提供一池含有重组蛋白的蛋清，所述池的体积至少10升；
通过将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中调节所述蛋清的pH至5至6.5，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的0.5wt%至5wt%，并且所述酸性缓冲液包含5M至6M在所述酸性缓冲液中使用的酸化剂的盐；其中，所述pH调节后的蛋清的电导率为8mS/cm至20mS/cm；
允许所述蛋清沉降，以使所述蛋清分离成上层、中间层和下层；
过滤所述中间层以形成溶液；以及
通过柱层析分离所述蛋清中的重组蛋白。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述过滤步骤包括使所述中间层的至少一部分通过平均孔径为0.1μm至100μm的过滤器。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述调节步骤包括将所述蛋清与所述酸性缓冲液混合。
32.根据权利要求29所述的方法，其中，所述酸性缓冲液具有8mS/cm至40mS/cm的电导率。
33.一种过滤酸化的蛋清的方法，包括：将含有酸化剂的酸性缓冲液加入到蛋清池中，所述酸性缓冲液占每千克所述蛋清的0.5wt%至5wt%，并且所述酸性缓冲液包含5M至6M在所述酸性缓冲液中使用的酸化剂的盐；
将所述酸性缓冲液和所述蛋清混合以形成pH为5至6.5的蛋清；
允许所述蛋清沉降，以使所述蛋清分离成上层、中间层和下层；
使电导率在8mS/cm和20mS/cm之间的预处理缓冲液通过过滤器；以及
使所述中间层通过所述过滤器。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述预处理缓冲液具有与所述蛋清基本上相同的pH。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述预处理缓冲液具有5.9至6.1的pH。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述预处理缓冲液具有6的pH。
37.根据权利要求33所述的方法，其中，所述预处理缓冲液包括磷酸钠和氯化钠。
38.根据权利要求33所述的方法，其中，所述预处理缓冲液具有10mS/cm至18mS/cm的电导率。
39.根据权利要求33所述的方法，其中，所述蛋清具有8mS/cm至20mS/cm的电导率。
40.根据权利要求33所述的方法，其中，所述过滤器具有至少8m2的过滤介质面积。
41.根据权利要求33所述的方法，其中，所述过滤器具有0.1μm至100μm的平均孔径。
42.根据权利要求33所述的方法，其中，所述蛋清具有至少50L的体积。
43.根据权利要求33所述的方法，其中，使所述蛋清在小于30psi的压差下通过所述过滤器。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，使所述蛋清在小于15psi的压差下通过所述过滤器。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017169978A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 株式会社カネカ 精製されたネコ由来エリスロポエチンの製造方法
US11155794B2 (en) 2016-08-23 2021-10-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of purifying a heterologous protein from an egg white
CN107242346A (zh) * 2017-06-22 2017-10-13 安徽王家坝生态农业有限公司 一种从蛋白中获取多肽制品的方法
US10792618B2 (en) 2018-06-19 2020-10-06 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Particle separation and/or purification of a fluid

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2377961A (en) * 1942-04-22 1945-06-12 Domestic Egg Products Inc Manufacture of water-soluble egg albumen

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2191257A (en) 1937-08-10 1940-02-20 Armour & Co Egg white material and process of preparing the same
US2168926A (en) 1938-07-07 1939-08-08 Armour & Co Egg white process
US2237087A (en) 1938-07-14 1941-04-01 Armour & Co Process of treating egg whites
US2427726A (en) 1944-10-02 1947-09-23 Armour & Co Preparing dried egg products
US2744829A (en) * 1950-07-08 1956-05-08 Benjamin R Harris Treatment of liquid egg whites
US2610918A (en) 1951-04-10 1952-09-16 Kline Leo Preparation of dried eggs
US2758935A (en) 1953-03-16 1956-08-14 Ben L Sarett Treatment of eggs
ATE34648T1 (de) 1984-11-02 1988-06-15 Nestle Sa Verarbeitung von eidotter.
SI8510058A8 (en) 1985-01-16 1996-04-30 Inst Jozef Stefan P O Process for insulation of poultry egg's cystatine from egg-white
US4971827A (en) 1988-06-22 1990-11-20 Specialty Foods Investement Company Method of producing cholesterol-free egg products with an extended refrigerated shelf life and products produced thereby
US4853238A (en) 1988-07-21 1989-08-01 Worthington Foods, Inc. Method of treating liquid egg and egg white with microwave energy to increase refrigerated shelf life
DK114392D0 (da) * 1992-09-17 1992-09-17 Kem En Tec As Isolering af biomolekyler
AU4837996A (en) * 1996-02-29 1997-09-16 Delta Biotechnology Limited High purity albumin production process
GB9902000D0 (en) * 1999-01-30 1999-03-17 Delta Biotechnology Ltd Process
US7541512B2 (en) * 2001-03-30 2009-06-02 Synageva Biopharma Corp. Avians containing a lysozyme promoter transgene
US6936295B2 (en) 2002-05-23 2005-08-30 Cargill, Incorporated Method for treating liquid egg whites
KR100627680B1 (ko) 2004-02-10 2006-09-25 유익종 가열시 쓴맛이 제거된 응고방지용 난백액의 제조방법
JP2008535913A (ja) * 2005-04-11 2008-09-04 メダレックス インコーポレーティッド タンパク質精製方法
US20080026100A1 (en) * 2006-07-27 2008-01-31 Saint Simeon Marketing E Investimentos Lta. Method for the Production of Wine and Wine Obtained from Such a Method
US20080071067A1 (en) * 2006-09-20 2008-03-20 Avigenics, Inc. Methods of purifying proteins from egg white
WO2009052396A2 (en) * 2007-10-17 2009-04-23 Biova, L.L.C. Novel process for solubilizing protein from a proteinaceous material and compositions thereof
CN101603038B (zh) * 2009-07-10 2011-04-06 山东鲁北药业有限公司 一种溶菌酶的制备方法
AU2011242461B2 (en) * 2010-04-23 2015-10-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Lysosomal storage disease enzyme
MX335995B (es) 2010-07-02 2016-01-07 Rembrandt Entpr Inc Materiales aislados de proteinas de huevo y lipidos de huevo y metodos para producir los mismos.
WO2012146716A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Dsm Ip Assets B.V. Preparation of an egg white composition
US11155794B2 (en) * 2016-08-23 2021-10-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of purifying a heterologous protein from an egg white

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2377961A (en) * 1942-04-22 1945-06-12 Domestic Egg Products Inc Manufacture of water-soluble egg albumen

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