CN111218494B - 一种处理cho细胞发酵液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种处理CHO细胞发酵液的方法，具体步骤为碟片离心机处理CHO细胞发酵液后，经深层过滤和无菌处理即可获得发酵澄清液。经过本发明提供的处理方法可有效去除发酵液中含有的细胞碎片、HCP、宿主DNA、高分子聚合物等众多杂质，获得具有较高收率和较低浊度的发酵澄清液，极大的简化了下游纯化蛋白所需的工艺步骤。

Description

一种处理CHO细胞发酵液的方法
技术领域
本发明属于生物制药的蛋白质除杂制备技术领域，具体涉及一种碟片离心机和深层过滤联用处理CHO细胞发酵液的方法。
背景技术
CHO细胞是由Puck于1957年在中国仓鼠卵巢细胞发现的成纤维细胞系。发展至今，CHO细胞已成为生物技术药物领域最重要的细胞表达和生产系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术、生物反应器设计放大与强化技术以及大规模高密度细胞培养等技术的发展，CHO细胞系统被广泛应用于抗体药物、基因重组蛋白药物、病毒疫苗等生物技术领域的研究开发和工业化生产中。CHO细胞发酵是通过改造和筛选来得到高产的重组细胞株，同时开发了适用于CHO细胞生长的无血清培养基，通过将新的生物反应器培养技术应用于大规模重组蛋白的表达，从而得到了高产量的重组蛋白。
细胞培养过后需要经过澄清过滤、纯化制剂等步骤才能获得最后的目标重组蛋白。然而细胞培养液中包含细胞碎片、宿主细胞蛋白、DNA、高分子聚合物等众多杂质，需要比较复杂的纯化步骤和纯化工艺。目前，在细胞发酵液的预处理过程中，比较常用的有深层过滤(DF)、微滤(MF)、超滤(UF)、无菌过滤、膜色谱(MC)和离心等预处理方式。但是各种处理方式都各有利弊，所获得的发酵澄清液都需要后续进一步的纯化精制工艺才可获得目标蛋白原液。
碟片离心机广泛应用于果汁饮料、茶饮料、酒酿造、调味品、食用油、植物蛋白、动物蛋白、鱼类加工、生物制药、淀粉加工、工业发酵、酵母抽提、天然提取等领域，在大规模工业化生产中应用广泛，其所具有的连续处理的工作方式十分适用于生物制药领域大规模细胞发酵生产。
深层过滤发酵液澄清是指在发酵终点时经过碟片离心机对深层过滤发酵液离心澄清处理的操作，澄清后的上清液中依然会有很多成分，比如少许细胞、胶体物质、细胞碎片等，这些成分可以经过深层过滤系统有效的拦截。通过实践表明，深层过滤系统有着较高的通量，几乎可以过滤掉所有的细胞，部分的细胞碎片、HCP、宿主DNA等，当然这也取决于粗分离的效果，即碟片离心机要去除大部分的细胞，而且残留细胞完整不破碎，如果离心效果很差，即有大量细胞未去除，或者细胞发生破碎，深层过滤的压力就会迅速升高，处理量就会大大减小。因此众多的研究者不断的探究能够高效处理发酵液的方法。目前使用5层以上深层滤膜的深层过滤系统联用处理细胞发酵液的方法可以获得相对较好的发酵澄清液，但是该方法处理量有限且成本较高，极大的限制了深层过滤系统在生产上的大规模应用。虽然也有文献披露碟片离心机和深层过滤系统联用的方法，但是其联用效果及处理能力和生产实用性仍然需要不断的研究探索。
发明内容
针对目前发酵液预处理澄清过程中存在的处理量较低、浊度高、深层滤膜用量大、处理成本较高的问题，本发明旨在提供一种碟片离心机和深层过滤系统联用处理CHO细胞发酵液的方法，以去除发酵液中的细胞碎片、HCP、宿主DNA、高分子聚合物等众多杂质，得到含有目的蛋白的澄清发酵液，继而简化下游纯化蛋白所需的工艺步骤，降低工艺生产成本。
本发明的具体技术内容如下：
一种处理CHO细胞发酵液的方法，具体为一种碟片离心机和深层过滤系统联用处理CHO细胞发酵液的方法，其主要步骤为：
1)当CHO细胞发酵液到达发酵终点时，将发酵液温度降至10-25℃，调节发酵罐的压力保持在300-1000mba之间，同时调节缓冲液罐压力与发酵罐压力相同；
2)将发酵液输送至碟片离心机进行离心处理，收集离心上清液，碟片离心机操作水压力保持在2.0ba以上；
3)收集的离心上清液经深层过滤系统进行深层过滤处理，得到发酵澄清液；
4)在深层过滤系统后加装0.22微米的无菌过滤器，对澄清液做除菌过滤，获得含有目标蛋白的无菌发酵澄清液。
优选的，步骤1)中所述的CHO细胞发酵液到达终点时的相关参数为：细胞密度在1*107-3*107cell/ml，细胞活率在80％以上，细胞液浊度在1500-3000NTU。
优选的，步骤1)中所述的CHO细胞发酵液为表达抗体或融合蛋白的CHO细胞发酵液。
优选的，所述的表达抗体可以是免疫球蛋白G抗体、人源化的免疫球蛋白G抗体、重组免疫球蛋白G抗体。
优选的，所述的表达蛋白可以是FC融合蛋白。
优选的，步骤2中所述的离心机处理细胞发酵液的参数为：
Figure BDA0001876583960000031
优选的，步骤2中所述的离心机处理细胞发酵液的参数为：
Figure BDA0001876583960000032
优选的，步骤2中所述的碟片离心机为Alfa-Laval MBPX404。
优选的，步骤3中所述的深层过滤系统由一块深层滤膜组成。
优选的，步骤3中所述的深层过滤系统的滤芯型号为SXLPDE2408SP，有效过滤面积为1m2。
优选的，步骤4中所述的除菌过滤使用的滤芯型号为Sartorius stedimSARTOPRE25442507H1，有效过滤面积为0.6m2。
与现有技术相比，本发明取得的技术效果是：
1、在本发明的技术路线中离心机正常运行状态下，通过降低进料压力来降低细胞破碎的风险，同时，通过降低CHO细胞发酵液的温度达到降低碟片离心机转鼓温度的效果，保证了发酵液中细胞的完整性，从而降低了发酵澄清液的浊度、宿主DNA含量和HCP含量。
2、本发明的技术路线中，发酵液经碟片离心机处理后，其浊度值和LDH含量均较低，说明该工艺路线细胞破碎较少，细胞完整度较高，从而减少了后续深层过滤的处理难度，仅需要一块深层滤膜即可完成一批发酵液的澄清。
3、本发明的技术路线中处理的发酵液经碟片离心机和深层过滤后获得的发酵澄清液中宿主DNA含量和HCP含量都有大幅度的降低，从而可以大大减轻后续蛋白纯化工艺的压力。
附图说明
图1.实施例1-7离心处理后CHO细胞发酵液浊度变化趋势图。
图2.实施例1-7深层过滤系统进料口压力变化趋势图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，应该正确理解的是：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。
本发明实施例中使用的CHO细胞细胞株购自BeNa Culture Collection，表达抗体(如重组免疫球蛋白G抗体)或融合蛋白(如肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白)所用的细胞株为自己制备。
实施例1
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表1待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000041
将CHO细胞发酵液降温至20℃，调节发酵罐压力保持在500mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa-Laval，MBPX404)进料口，离心机以7000rpm的转速和230L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为60s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为260s，碟片离心机背压保持在100kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为130分钟。
实施例2
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表2待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000042
将CHO细胞发酵液降温至25℃，调节发酵罐压力保持在300mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa–Laval，MBPX404)进料口，离心机以5000rpm的转速和150L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为40s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为200s，碟片离心机背压保持在60kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为160分钟。
实施例3
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表3待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000051
将CHO细胞发酵液降温至10℃，调节发酵罐压力保持在1000mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa–Laval，MBPX404)进料口，离心机以9000rpm的转速和350L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为60s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为500s，碟片离心机背压保持在100kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为150分钟。
实施例4
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表4待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000052
将CHO细胞发酵液降温至15℃，调节发酵罐压力保持在1500mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa-Laval，MBPX404)进料口，离心机以7000rpm的转速和230L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为60s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为260s，碟片离心机背压保持在100kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为260分钟。
实施例5
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表5待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000061
将CHO细胞发酵液降温至35℃，调节发酵罐压力保持在500mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa-Laval，MBPX404)进料口，离心机以7000rpm的转速和230L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为60s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为260s，碟片离心机背压保持在100kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为265分钟。
实施例6
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表6待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000071
将CHO细胞发酵液降温至20℃，调节发酵罐压力保持在500mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa-Laval，MBPX404)进料口，离心机以4500rpm的转速和120L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为40s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为370s，碟片离心机背压保持在60kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为270分钟。
实施例7
CHO细胞发酵液在发酵终点时，取样测定一系列的数据见下表：
表7待处理发酵液参数
Figure BDA0001876583960000072
将CHO细胞发酵液降温至20℃，调节发酵罐压力保持在500mba，调节缓冲液罐压力同发酵罐压力相同；将发酵液罐出料口连接至碟片离心机(Alfa-Laval，MBPX404)进料口，离心机以9500rpm的转速和370L/h的进料速度连续处理发酵液，缓冲液置换时间为60s，离心过程中取样检测离心处理后离心上清液浊度值(见图1)，排渣间隔为200s，碟片离心机背压保持在100kpa、操作水压力保持在2.0ba。
预冲水完毕后将深层过滤装置进料口连接至碟片离心机出料口并在管道上加蠕动泵，以提供深层过滤的动力；离心处理过后的发酵液经一块深层滤膜(Pall，SXLPDE2408SP，1m2)组成的深层过滤系统进行过滤处理，处理过程中监测过滤系统进料口的压力变化(见图2)，取样检测经深层过滤后的样品中的宿主DNA残留和HCP残留(见表8)；在深层过滤装置末端加装0.22微米的无菌过滤器(Sartorius stedim，SARTOPRE25442507H1，0.6m2)，对澄清液做无菌处理，获得发酵澄清液储存在无菌储液袋中，处理所需时间为275分钟。
表8 CHO细胞发酵澄清液检测结果
Figure BDA0001876583960000081
通过以上结果可以看出，应用本发明所提供的方法获得的CHO细胞发酵澄清液具有较低的HCP含量、较低的宿主DNA含量和较低的浊度，同时具有较高的收集产率。通过图1和图2也可以看出，本发明提供的处理方法可以保证离心机工作过程处于稳定的状态，并且离心过后的发酵液具有较低的浊度，深层过滤进料压力稳定的趋势可以清晰的表明本方法处理过程的稳定性及高效性，因此本技术方法相对于其它方法具有较高的单位处理量。

Claims (2)

1.一种处理CHO细胞发酵液的方法，其特征在于，具体为一种碟片离心机和深层过滤系统联用处理CHO细胞发酵液的方法，其主要步骤为：
1)当CHO细胞发酵液到达发酵终点时，将发酵液温度降至10-25℃，调节发酵罐的压力保持在300-1000mba之间，同时调节缓冲罐压力使其与发酵罐压力相同；
2)将发酵液输送至碟片离心机进行离心处理，碟片离心机处理细胞发酵液的参数为：
Figure QLYQS_1
收集离心上清液，碟片离心机操作水压力保持在2 .0ba以上；
3)收集的离心上清液经深层过滤系统进行深层过滤处理，得到发酵澄清液，所述的深层过滤系统由一块深层滤膜组成；
4)在深层过滤系统后加装0 .22微米无菌过滤器，对澄清液做除菌过滤，获得含有目标蛋白的无菌发酵澄清液；
其中，步骤1)中所述的CHO细胞发酵液为表达抗体或融合蛋白的CHO细胞发酵液，CHO细胞发酵液到达终点时的相关参数为：细胞密度在1*107 -3*107cell/ml，细胞活率在80％以上，细胞液浊度在1500-3000NTU；
步骤2)中所述的碟片离心机为Alfa-LavalMBPX404；
步骤3)中所述的深层过滤系统滤芯型号为SXLPDE2408SP，有效过滤面积为1平方米；
步骤4)中所述的除菌过滤使用的滤芯型号为Sartorius stedim SARTOPRE25442507H1，有效过滤面积为0 .6平方米。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的碟片离心机处理细胞发酵液的参数为：
Figure QLYQS_2
。
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