CN117024567A - 一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，属于生物工程发酵技术领域，本申请离心收率提高工艺包括以下步骤：（1）将发酵液与稀释液混合，并调整发酵液的固含为25~35%；（2）使用碟片离心机对发酵液进行高速离心去除菌体，获得含有人血清白蛋白的上清液；高速离心的条件为：转速8000~14000rpm，进液压力0.005~0.025MPa，进液流量500~800L/h，清液压力0.2~0.6MPa，清液流量300~600L/h，控制浓液终固含70~85%。本申请提供的离心收率提高工艺，能够解决现有技术中重组人血清白蛋白发酵液离心工序中目的蛋白收率不高的问题，使得目的蛋白的回收率显著提高，使得发酵收益大幅提高，具有非常重要的经济意义。
Description
技术领域
本申请涉及一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术
人血白蛋白（HSA）是人体循环系统内含量最多的可溶性蛋白，占健康人体血清蛋白的50%以上，在调节血浆渗透压、营养、解毒和促进伤口愈合中起着关键作用。由于人血白蛋白无免疫原性、人体相容性好、组织分布广、无酶活和半衰期长的优点，使其成为运输各种内源性和外源性配体的多功能蛋白质载体，临床上适用于低蛋白血症、休克、烧伤、糖尿病和急性肝衰竭等的治疗，在新技术研发过程中可作为细胞培养补充剂、药物载体和蛋白质/药物稳定剂。总之，人血白蛋白用途广泛，且用量巨大。目前广泛使用的人血白蛋白主要是从人血浆或胎盘血中通过低温乙醇法（Cohn法）结合柱层析法进行提取制备的，这种方式原料分散，血浆容易被病原体，如肝炎病毒、艾滋病毒等污染，而且原料供应日益紧张，因此制备价格也在逐年上升。
随着人血白蛋白供需矛盾的加剧和质量控制方面要求的提高，基因重组人血白蛋白（Recombinant Human serum albmin，rHSA）逐渐成为人血白蛋白制药工业发展的方向和潮流。rHSA采用现代生物技术生产，不受人血白蛋白的上述因素制约，不仅具有同样的适用范围，还具有纯度更高、无动物组分、无病毒残留等优势，其市场前景十分广阔。近些年，国际上许多实验室和公司都尝试通过基因工程手段，运用各种表达体系开发rHSA，把人血白蛋白基因克隆到细菌、真菌、植物及动物中进行表达。由于应用大肠杆菌表达系统制得的rHSA存在于细胞质中并形成有包涵体，操作步骤繁琐，难以正确复性，且在原核生物中表达量很低，仅为毫克级，使得其工业化价值不高；通过重组转基因技术，rHSA在动植物中也有成功的表达，其中转基因动物具有表达量高、容易加工处理等优势，但转基因动物来源的rHSA质量难以控制，并且存在被病毒污染的风险，技术也不够成熟；转基因植物表达量低，如Yang He等人利用转基因水稻种子大规模生产水稻重组HSA（OsrHSA）时产率为2.75g/kg糙米。因此，大剂量rHSA生产技术和质量控制技术及收率成本仍是制药行业里的一个世界性技术难题。
目前采用毕赤酵母进行重组人血清白蛋白的发酵则是目前备受关注的方式，现有技术对于利用毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的研究多集中于毕赤酵母的基因工程研究、发酵过程的研究和白蛋白的提纯过程，少有关注到离心工艺对重组人血清白蛋白收率的巨大影响，并且现有技术白蛋白分离过程中，普遍存在不合适的离心工艺所导致的白蛋白收率低的问题，导致重组人血清白蛋白的生产收益低，因此目前亟需一种毕赤酵母发酵表达重组白蛋白过程中提高发酵液离心收率的工艺，以进一步提高毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的收益。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，该离心工艺重点关注现有技术鲜有关注的离心工序，对稀释液、稀释固含、浓液终固含以及高速离心的条件进行优化，解决了现有技术中离心工序导致的目的蛋白的收率低的问题，从而提高了毕赤酵母发酵生产人血清白蛋白的生产总收率，明显提高了经济收益，具有非常重要的实际生产应用价值。
根据本申请的一个方面，提供了一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，所述工艺包括以下步骤：
（1）将发酵液与稀释液混合，并调整发酵液的固含为25~35%；
（2）使用碟片离心机对发酵液进行高速离心去除菌体，获得含有人血清白蛋白的上清液；
所述高速离心的条件为：转速8000~14000rpm，进液压力0.005~0.025MPa，进液流量500~800L/h，清液压力0.2~0.6MPa，清液流量300~600L/h，控制浓液终固含70~85%。
离心过程中，如果进液流量和压力过高会导致料液在碟片内的滞留时间太短，分离不彻底，导致清液浑浊；而如果清液压力过高，导致清液流量小，浓液固含低，保证不了离心收率；清液压力过低，清液流量过大，离心清液会浑浊，固液分离不彻底，影响进一步处理。
可选的，所述高速离心的条件为：转速10000~14000rpm，进液压力0.008~0.02MPa，进液流量600~700L/h，清液压力0.3~0.5MPa，清液流量350~450L/h。
可选的，所述步骤（1）中调整发酵液的固含为25~30%，既能降低发酵液的粘度，又可以调节发酵液菌体的渗透压，防止菌体破碎释放更多的杂蛋白影响纯化过程；和/或，
所述控制浓液终固含75~80%。
可选的，所述稀释液包括磷酸二氢钾、氯化钠和氢氧化钠。
可选的，所述稀释液电导率为21.5~34ms/cm，pH为6.5~8.0；优选的，电导率为28.5~30ms/cm，pH为7.0~7.3。
可选的，所述稀释液的制备方法包括：
在水中加入磷酸二氢钾和氯化钠，再添加氢氧化钠调节pH、电导率制成所述稀释液，其中磷酸二氢钾、氯化钠和氢氧化钠可以根据实际需要选择固体、粉末或溶液均可，本领域技术人员可知上述选择不会影响稀释液的制备以及其发挥作用。
本申请中上述稀释液除了能够对发酵液进行稀释，方便后续离心并提高离心收率外，还能作为保护剂，起到防止目的蛋白降解的效果，从而也能提高目的蛋白的收率。
可选的，所述步骤（2）中碟片离心机中喷嘴直径为1.0~2.0mm，优选的，为1.0mm。
可选的，所述步骤（1）调整发酵液的固含量之后，还包括将混合后的发酵液降温2~8℃的步骤。
可选的，所述步骤（2）高速离心过程中连续排渣，发明人在离心过程中进行间歇排渣、排渣次数1~10次不等，发现容易出现排渣不及时，导致喷嘴堵塞而浪费发酵料液的情况，发明人发现在操作过程中把排渣次数设置成连续排渣，能够避免浪费发酵料液的情况，使得目的蛋白的损失率减少，最终提高了离心收率。
根据本申请的另一个方面，提供了任一上述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺在重组人血清白蛋白分离提纯中的应用。
本申请的有益效果包括但不限于：
1．根据本申请的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，通过对离心工序中离心机的选型，选择碟片离心机，能够明显提高目的蛋白收率的同时，离心时间短，且操作方便、容易清洗，具有非常好的分离效果。
2．根据本申请的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，通过对离心工艺中重要的控制参数，即进液流量、进液压力、清液流量和清液压力进行优化，能够明显提高人血清白蛋白的收率。
3．根据本申请的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，对发酵液稀释用稀释液的pH和电导率对目的蛋白的收率进行探究，获得了能够稳定提高目的蛋白收率的稀释液。
4．根据本申请的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，探索出了一整套全面的离心处理工艺，能够明显提高人血清白蛋白的离心收率从而使得终蛋白的收率提高，使得生产收益提高，具有非常重要的生产应用价值。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请实施例一涉及的离心前发酵液液相图；
图2为本申请实施例一涉及的离心后离心清液液相图；
图3为本申请实施例二涉及的离心前发酵液液相图；
图4为本申请实施例二涉及的离心后离心清液液相图；
图5为本申请实施例三涉及的离心前发酵液液相图；
图6为本申请实施例三涉及的离心后离心清液液相图。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例，如无特别说明，本申请的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。
对发酵液进行离心工艺之前，利用毕赤酵母发酵表达白蛋白获得发酵液，而发酵完成后的发酵液固含能够达到60%甚至更高，发酵液的粘度较大，对后续的离心预处理具有很大的难度。现有技术利用毕赤酵母进行发酵表达白蛋白的工艺中，多重点关注在发酵工艺中，而没有过多对其中离心工艺有过多的关注，而离心工艺作为难度大、且不可或缺的关键步骤，同样影响白蛋白的纯化过程，从而对白蛋白的产率产生较大的影响。
在本申请中实验人员首先对设备进行了选型研究，针对不同种类的离心机进行对比研究发现，使用管式离心机能够分离发酵液并获得不错的收率，但是离心时间较长，导致目的蛋白易发生降解，并且在操作时难以清洗，不适用于大规模生产，而且内毒素的去除效果不佳，其用陶瓷膜进行过滤，而陶瓷膜会把大部分目的蛋白进行拦截，目的蛋白与陶瓷膜孔径发生缠绕，难以实际应用。
实验人员发现使用碟片式分离机具有较好的分离效果，碟片离心机的工作原理是：其转鼓内有一组互相套叠在一起的碟形零件即碟片，碟片与碟片之间留有很小的间隙，悬浮液（或乳浊液）由位于转鼓中心的进料管加入转鼓；当悬浮液（或乳浊液）流过碟片之间的间隙时，固体颗粒（或液滴）在离心机作用下沉降到碟片上形成沉渣（或液层）；沉渣沿碟片表面滑动而脱离碟片并积聚在转鼓内直径最大的部位，分离后的液体从出液口排出转鼓。碟片能缩短固体颗粒（或液滴）的沉降距离，并扩大转鼓的沉降面积，转鼓中由于安装了碟片而大大提高了分离机的生产能力。积聚在转鼓内的固体在分离机停机后拆开转鼓由人工清除，或通过排渣机构在不停机的情况下从转鼓中排出。
本申请方案中，具体使用的三相离心机，对于分离高密度的毕赤酵母发酵液具有非常好的效果，具有高转速、高分离因数、大沉降面积和连续排渣、连续分离的特点，进一步本方案基于碟片式分离机，提供了进行固液分离提高白蛋白离心收率的方法，该方法在发酵罐停罐后，通过碟片离心机进行固液分离，在离心过程中添加稀释液控制菌体渗透压，降低粘度，并通过控制发酵液的固含比例在25~30%，调节离心机的喷嘴直径为1.0mm，控制清液流量和压力、进液流量和压力，并控制浓液的终固含，通过对离心工艺的优化，能够大大提高离心工艺后目的蛋白的收率，使最终的目的蛋白产量得到明显提高。
在本申请中，细胞浓度的测定方法：取发酵液用无菌水稀释至适当倍数(控制检测值在0.1~0.5之间)，用分光光度计检测600nm下的吸光度(OD)。除菌率的测定方法：在600nm下，分别测定发酵液和固液分离后上清液的OD值，菌体去除率为发酵液和上清液OD值之差与发酵液OD值的比值。蛋白回收率的计算：发酵液总蛋白量=发酵液体积×（1-菌体湿重）×发酵液蛋白浓度，离心清液总蛋白量=离心清液体积×离心清液蛋白浓度，蛋白回收率=离心清液蛋白量/发酵液蛋白量×100%。
下面通过具体实施例和测试例对本申请方案进行说明。
实施例1
A、制备稀释液：在300L纯化水中加入1.5L 的0.5％磷酸二氢钾溶液、3.0L的1％氯化钠溶液，添加1.1L的0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2、电导率28.5ms/cm，制成稀释液；
B、在常温条件下将稀释液与发酵液按一定比例混合均匀，调整发酵液固含28%，混合液降温6℃；
C、将步骤B中制成的混合液高速离心去除菌体，获得含有白蛋白的上清液，在碟片式离心机转速为12000转/分钟的条件下离心；
D、调节进液压力0.01MPa左右，进液流量在600L/h左右，调节清液压力0.4MPa左右，清液流量在450L/h左右；
E、控制浓液压力0.35MPa以上，控制浓液终固含至78%，结束高速离心工序。
如图1~2所示，分别为离心前发酵液的液相图和离心后离心清液的液相图，根据离心前后液相图中峰型一致，可知本实施例离心工艺对产品的结构没有造成影响，产品结构稳定。
实施例2
A、制备稀释液：在300L纯化水中加入1.5L 的0.5％磷酸二氢钾溶液和3.0L 的1％氯化钠溶液，添加0.8L的0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.5、电导率22ms/cm，制成稀释液；
B、在常温条件下将稀释液与发酵液按一定比例混合均匀，调整发酵液固含35%，混合液降温2℃；
C、将步骤B中制成的混合液高速离心去除菌体，获得含有白蛋白的上清液，在碟片式离心机转速为8000转/分钟的条件下离心；
D、调节进液压力0.005MPa左右，进液流量在800L/h左右，调节清液压力0.2MPa左右，清液流量在600L/h左右；
E、控制浓液压力0.4MPa以上，控制浓液终固含至70%，结束高速离心工序。
如图3~4所示，分别为离心前发酵液的液相图和离心后离心清液的液相图，根据离心前后液相图中峰型一致，可知本实施例离心工艺对产品的结构没有造成影响，产品结构稳定。
实施例3
A、制备稀释液：在300L纯化水中加入1.5L 的0.5％磷酸二氢钾溶液和3.0L 的1％氯化钠溶液，用1.3L 的0.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0、电导率35ms/cm，制成稀释液；
B、在常温条件下将稀释液与发酵液按一定比例混合均匀，调整发酵液固含25%，混合液降温8℃；
C、将步骤B中制成的混合液高速离心去除菌体，获得含有白蛋白的上清液，在碟片式离心机转速为14000转/分钟的条件下离心；
D、调节进液压力0.025MPa左右，进液流量在500L/h左右，调节清液压力0.6MPa左右，清液流量在300L/h左右；
E、控制浓液压力0.32MPa以上，控制浓液终固含至85%，结束高速离心工序。
如图5~6所示，分别为离心前发酵液的液相图和离心后离心清液的液相图，根据离心前后液相图中峰型一致，可知本实施例离心工艺对产品的结构没有造成影响，产品结构稳定。
实验例1
1）离心机喷嘴直径的影响
实验人员为了探究离心机中喷嘴直径对收率的影响，主要对1.0mm、1.4mm、2.0mm三种喷嘴的实验进行了探究，结果见表1。
表1 喷嘴直径对比结果
根据表1结果可知，1.0mm的喷嘴能够保证清液的清澈且获得非常高的收率，而1.4mm和2.0mm这两种喷嘴在离心过程中清液不清澈且收率较低。
2）发酵液稀释条件的研究
在确定1.0mm的喷嘴的情况下，收率没有达到预期的目标，发明人继续通过优化发酵液稀释条件相关参数，发现其对提高离心收率有很大的帮助。
在发酵罐停罐后，发酵液的固含在60%左右导致非常难离心，发明人首先对发酵液用纯化水进行了不同梯度的稀释，以确定合适的稀释固含。
表2 发酵液稀释固含对比结果
根据表2结果可知，当把发酵液稀释固含控制在26~30%之间时，能够获得非常高的离心收率，同时清液也能保持清澈，而其他稀释固含存在离心收率低或清液浑浊的问题。
发明人继续对比了三种稀释用液的效果，收率结果见表3。其中稀释液的组成为磷酸二氢钾、氯化钠和氢氧化钠，制备步骤包括：在纯化水中加入0.5％的磷酸二氢钾溶液和1％的氯化钠溶液，用0.5mol/L的氢氧化钠溶液来调节pH、电导率到要求范围，制成所用稀释液，对于本领域技术人员应该可知的是，此处磷酸二氢钾、氯化钠和氢氧化钠也可选择固体或粉末，只需根据需要调整水的用量即可。
表3 纯化水、注射用水、稀释液对比结果
根据表3结果可知，对比所用的纯化水、注射用水，其蛋白收率虽然下降并不是非常大，但是发明人发现经过离心后的清液中杂蛋白比较多，蛋白容易降解，不利于后续的纯化过程，而通过加入稀释液则可以调节发酵液中菌体的渗透压，减少菌体破碎释放杂蛋白情况的发生。
发明人在确定了采用稀释液对收率的提升效果明显更加优异后，最后还对稀释液的pH与电导率对收率的影响进行了探究，以获得能够稳定提升目的蛋白收率的稀释液。发明人对稀释液的pH值和电导率进行了对比实验，pH值调节至7.0以下、电导率调节至25ms/cm以下时，稀释液加入发酵液时，发酵液粘度明显增加，最终通过对比发现稀释液pH值调节至7.0~7.3之间，电导率在28.3~29.8ms/cm时对离心收率影响较小，发酵液的粘度也无明显改变，此时更加利于离心操作。
表4 稀释液pH、电导率对比结果
根据表4结果可知，所采用稀释液的电导率和pH对收率有着较大的影响。其中，电导率19.4~29.8ms/cm、pH 6.0~7.3的稀释液能使得收率不低于86%，而电导率28.3~29.8ms/cm、pH 7.0~7.3的稀释液效果最好，能使得目的蛋白的收率高达90~94%。
3）离心条件参数的优化
发明人在对稀释相关操作进行了实验和研究后，进一步对离心过程中的参数条件进行了研究和优化，具体涉及到离心过程中的进液流量、进液压力、清液流量和清液压力。
表5 进液流量、进液压力、清液流量和清液压力对比结果
根据表5结果可知，进液流量、进液压力、清液流量和清液压力作为高速离心过程中重要的控制参数，对收率的影响较大。控制合适的进液流量、进液压力、清液流量和清液压力参数，能够保证收率高达94%以上，相比表5中其他条件收率明显提高。
4）浓液终固含的影响
在离心主要工艺参数确定的情况下，发明人进一步探究了浓液终固含的影响，通过对比发现浓液固含越低，则目的蛋白的收率也会越低，可能的原因是浓液固含低，说明浓液中含有清液越多，导致目的蛋白收率低。
表6 浓液终固含对比结果
根据表6结果可知，把浓液终固含控制在76%以上，这样能够使目的蛋白的最终收率在97%以上，而浓液终固含过低则收率下降明显，浓液终固含过高则会存在离心耗时过长、不方便转移浓液等问题，当控制浓液终固含在76~78%时能够在缩短离心时长、保证浓液粘稠度较低的情况下，获得非常高的收率。
本申请中，针对现有技术在利用毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白的过程中，离心工艺存在的目的蛋白收率较低的问题，通过对发酵液用稀释液的筛选、稀释固含的选择、高速离心机的选型、高速离心中进液流量、进液压力、清液流量和清液压力的优化、以及离心后浓液固含的选择，探索出了一整套全面的离心处理工艺，能够明显提高人血清白蛋白的收率，提高生产收益，鉴于离心工艺在实际生产过程中必不可少且对提纯具有重要的影响，而现有技术中又缺少重点关注离心这一工艺并对离心工艺进行系统研究的内容，因此本申请方案具有非常重要的生产应用价值。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述工艺包括以下步骤：
（1）将发酵液与稀释液混合，并调整发酵液的固含为25~35%；
（2）使用碟片离心机对发酵液进行高速离心去除菌体，获得含有人血清白蛋白的上清液；
所述高速离心的条件为：转速8000~14000rpm，进液压力0.005~0.025MPa，进液流量500~800L/h，清液压力0.2~0.6MPa，清液流量300~600L/h，控制浓液终固含70~85%。
2.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述高速离心的条件为：转速10000~14000rpm，进液压力0.008~0.02MPa，进液流量600~700L/h，清液压力0.3~0.5MPa，清液流量350~450L/h。
3.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述步骤（1）中调整发酵液的固含为25~30%；和/或，
所述控制浓液终固含75~80%。
4.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述稀释液包括磷酸二氢钾、氯化钠和氢氧化钠。
5.根据权利要求4所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述稀释液电导率为21.5~34ms/cm，pH为6.5~8.0。
6.根据权利要求5所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述稀释液的制备方法包括：
在水中加入磷酸二氢钾和氯化钠，添加氢氧化钠调节pH、电导率制成所述稀释液。
7.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述步骤（2）中碟片离心机中喷嘴直径为1.0~2.0mm。
8.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述步骤（1）调整发酵液的固含量之后，还包括将混合后的发酵液降温2~8℃的步骤。
9.根据权利要求1所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺，其特征在于，所述步骤（2）高速离心过程中连续排渣。
10.如权利要求1~9任一项所述的重组人血清白蛋白发酵液离心收率提高工艺在重组人血清白蛋白分离提纯中的应用。
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