JPS61502585A - 醗酵ブイヨンからポリペプチドを回収するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１ｉ１酵ブイヨンからポリペプチドを回収するための方法および装置 明細書 醗酵ブイヨンからポリペプチドを回収するための方法および装置 本発明ハ醗酵７　イ３ン（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ）からポリペ プチドを回収するための方法および装置に関する。

動物の組織又は器官から例えば抽出により前もって回収さ物として形成するよう な方法でエンジニアリングによりトランスフオームされた微生物例えばバクテリ ア又は酵母細胞を用いるバイオテクニカルな方法により、ますます産生されてい る。

この方法で、生合成インシュリン、ｈＧｌ−（、インターフェロン、ソーマドＯ ピン、ブＯラクチンおよびその他の多くの所望のポリペプチドを製造することが 可能となった。

トランスフオームされた微生物の方法による基質の醗酵において、所望のポリペ プチドは、ある場合、培地に分泌される。ここでポリペプチドは低濃度例えば１ ０−０−２Ｏ０／１で生じ、同時に微生物から分泌されていたタンパク分解酵素 と混合される。醗酵は通常比較的高温度例えば２５−４０℃で行われ、必然的に タンパクの分解およびポリペプチドの変性の危険を伴う。したがって精製そのも の（ｐｕｒ；ｒｒｃａｔｒｏｎｐｒｏｐｅｒ　）が行われる前に低温度の発生状 態の醗酵ブイヨンからポリペプチドを単離することが好ましい。しかし＃Ｊ酵ブ イヨンの組成（高導電率、微生物の存在）により、精製そのものは、微生物が除 去されバッファ変化が起こるまで公知の方法においては開始することができない 。所望のポリペプチドが比較的低濃度であることにより、工業スケールにおいて は、著しく人聞の液体を処理することが必要で、したがって小スケールに使用さ れる多くの方法は適用できない又は高価すぎる。

所望のポリペプチドを含む醗酵ブイヨンを微生物から、遠心分離、ろ過、又は水 性二相抽出により単離することは公知ブチド感を得る。随意なバッファ変化が中 間工程として行われた場合、精製そのものは、ゲルろ過、アフイニテイクロマト グラフイ、疎水クロマトグラフィ又はクロマトフオーカシングのいずれかにより 開始することができる。

これらの方法は全て生物学的物質の精製のために広くに使用される。しかし大規 模においては経流学が重要な役割をもち、単位操作の数は最小にされるべきであ る。

したがって醗酵ブイヨンからの所望のポリペプチドの単離は、好ましくは、最少 の単位操作を具備した連続的および温和な方法により、そして単離された生成物 がそれ自身、別の精製に寄与する形で存在することが好ましい。

本発明は、特定の条件下で醗酵ブイヨンからポリペプチドを、所望によりべり− （ｖｅｒｙ）醗酵の間でも直接抽出できることを見出だしたことに基づく。

したがって、本発明はポリペプチドをＦＢＨブイヨンから回収する方法であって 、前記ポリペプチドは微生物での１１１１酵により産生されたもので、前記醗酵 ブイヨンを、疎水基を含み醗酵ブイヨン中に含まれるポリペプチドを吸着するク ロマトグラフ物質で処理する方法に関し、該方法は、該醗酵ブイヨンをそのポリ ペプチド成分および場合により該微生物と共に、疎水基を含む前記クロマトグラ フィ物質床に直接通すこと、および該クロマトグラフ物質に吸着されたポリペプ チドを、所望により水混和性有機汀媒を含有することのできる水性媒質（ｍｅｄ ｉｕｍ）で溶出すること、を特徴とする。

該方法を上記のように実施すると、単一工程で所望のポリペプチドを直接、高収 率および高い濃縮率（ｃｏｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ　）で回収するこ とができる。そのプロセス技術の単純性により、この方法は非常に効果的である 。したがって所望のポリペプチドは溶出物中に高収率および優れた純度で得られ 、したがって後の精製は、複雑でなく行うことができる。

本発明の好ましい態様によると、１ｇ１Ｉ酵ブイヨンは懸濁状態の微生物と共に べり一醗酵の間、連続的に処理され、醗酵ブイヨンは、好ましくは流動状態のク ロマトグラフィ物質床を通して循環され、そして別の醗酵のために再循環される 。醗酵生成物即ち所望のポリペプチドの連続的除去は分解の危険を低減し、した がって最適な収率を与える。この効果は循環の間ブイヨンを１−１２℃好ましく は４−６℃に冷し保つ場合に高められる。

本発明の方法は、プロインシュリン又は他のインシュリン様物質、いわゆるＩＬ Ｍを、それぞれに対応してトランスフオームされた酵母細胞の培養により形成さ れた醗酵ブイヨンから回収するのに有用であることが見出だされた。

非常に低温度の歩出のＩＬＭでさえ、醗酵培地の特別な必要条件なしで、高収率 および高濃縮率で単離することができる。本方法において、１００以上、例えば 典型的には１００−ｉｏｏｏの濃縮率が得られることが見出だされた。これは、 醗酵ブイヨンの他の構成成分を目立つほど含まないないＩＬＭの溶液を与える。

加えてｐＨ＜４での適用が可能で、したがってタンパク分解酵素の活性は妨害さ れる。

好ましくは、クロマトグラフィ物質での処理の前に、醗酵ブイヨンを、０．０１ −１モル、好ましくは０．０５−０．４モル濃度で高タンパク塩析効果を有する イオンと混合する。

適当なイオンの例は、ｐ　０４３−１５０４２−１ＣＨ３ＣＯＯ−、ＮＨ４”　 、Ｎａ”およびに＋である。これらのイオンを放出する好ましい塩は、（Ｎ＋− １４）　２８０４お、ｊ：Ｕ　（ＮＨ４）３　ＰＯ４おＪ：びに３ＰＯ４、ＣＨ ３ＣＯＯＮＨ４Ｔある。

ヒト成長ホルモン、ｈＧＨは、微生物を伴う基質の培養により産生された醗酵ブ イヨンから対応する方法で回収された。

クロマトグラフィ物質は、所望のポリペプチドに対して適当な特定の親和性を有 していなければならない。ＩＬＭ又はｈＧＨに関連して適当なりロマトグラフィ 物質の例は、アリール又はアルキル基含有セファロース例えばオクチルセファ０ −スおよびフェニルセファロースである。ＩＬＭはこれらのゲルに非常に強く結 合するので、タンパク塩析効果を有するイオンを醗酵ブイヨンに添加する必要が ない。フェニルセフ７０−スは、ＩＬＭの回収に適当なりロマトグラフィ物質で ある。このタンパクは適度に強く結合し、後の溶出を困難にしないからである。

本発明の方法において溶出物が製造される。これはポリペプチドを濃縮された形 で含有し、所望のポリペプチドは該溶出物からそれ自体公知の方法により純粋な 状態で単離することができる。

本発明は本発明の方法を実施するための装置にも関し、前記装置は、請求の範囲 第１０項の特徴部分に定義された点を特徴とする。

本発明は図面の参照によって以下により充分に説明されるだろう。図面は処理図 すなわち醗酵ブイヨンからポリペプチドを単離するためのシステムを示す。

該装置は醗酵器１を備える。これには、基質又は養分液が供給タンク１５から供 給管１６を通して供給される。供給される養分液の量はバルブ１６ａによって調 節することができる。管２はＢ１からポンプ３を通って限外ろ過装置５まで延び る。

リチンティト（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ　）のための導管６はタンク１へ戻り、ろ液 のための導管７は、クロマトグラフィ物質を含む２つのカラム８．９まで延びる 。限外ろ過装ｕ５の温度が器１のｓｉｐミルブイヨン度よりもかなり低く調整さ れた場合には、熱回復のために（図示しない）熱交換器を導管２と６に挿入して もよい。

醗酵ブイヨン器１中で産生された過剰な酵母細胞を除去するために、導管１７． １９．２２により、該器をポンプ１８および遠心分離器２０に接続する。遠心分 離器２０には酵Ｆｆｉ濃縮物のための排出管２１が設けられている。

カラム８．９は、平衡液又は溶出液のためのタンク１１に接続されている。これ らの液は、切換えバルブ１２およびバルブ１２ａおよび１２ｂの調整により、カ ラム８．９の１つ又は他方に導かれることができる。バルブ１３ａ又は１３ｂを 開くことにより、溶出物はパイプ１３を通って溶出物用の貯蔵タンク１４に尋か れることができる。

本発明は以下の例により説明される。ここで例１および２は図面に示された本発 明の装置の態様の操作に関する。

例１ １０１のヒト　プロインシュリン−産生酵母培養物（サツカロミセス　セルビシ エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）ＡＢ　１０３−１ 、ブ５スミドｐＶ−ＢＣ’Ａ５含有）を、醗酵器１内で光学密度３．５　（６１ ０ｎｍで測定）まで培養した。

１［ブイヨンを、ミリボア　ペリカン　カセット　システムの０．５μ隔板（ｄ 　ｉａｐｈｒａｇｍ　）の限外ろ過システム５に通した。酵母細胞の濃縮された 懸濁物からなるリチンティトを管６を通して醗酵器１に再循環した。

ろ液、インシュリン様物質を含む澄んだ黄色がかった液体（Ｃ＝５μＱ／ｍ＋＞ を、４℃で管７を通してカラム８へ移した。カラムは、ファーマシアの、直径２ ．５ｃｍ、高さ１００ｍ１フェニルセファロース　０Ｌ６Ｂ充填で、バッファ、 ｐＨ８，０に調整されたＯ、ＩＭ　（ＮＨ４）２５０４で平衡にされていた。カ ラム８からの溶出物は、廃物として管１３を通して排出した。該溶出物中にイン シュリン様物質は検出されなかった。醗酵ブイヨンの容積を０．５１まで減少し た後、ポンプ３を停止し、タンク１１からの２カラム容量のバッフ？でカラム８ をフラッシュ（ｆｌｕｓｈ　）　した。

５０％Ｖ／Ｖ　エタノールをタンク１１に導入し、総計で２カラム容量のこのバ ッファでカラム８を溶出した。溶出物を貯蔵タンク１４に集めた。

収率８７％ｗ／ｗ、濃縮率１００゜ 例２ ２５１のヒト　プロインシュリン−産生酵母培養物（サツカロミセス　セルピシ エ　ＡＢ　１０３−１、プラスミドｐｙ−ＢＣＡ５含有）を、醗酵器１内で光学 密度４．３（６１０ｎｍで測定）３７℃で培養した。ＷＵ醇ブイヨンは、ヒト　 半合成インシュリンを濃度１００ｍにｌ／Ｉで含んでいた。連続操作の、間およ び４℃まで冷却した後、酵母細胞およびインシュリンを含めてｆｆ１ｉ酵ブイヨ ンを、０．５μ隔板のミリボア　ペリコン　カセット　システム　タイプの限外 ろ過装置５を通し、醗酵器１に再循環した。

半合成　ヒト　インシュリンを濃度１００ｍｑ／　Ｉで含むろ液を、導管７を介 して、フェニルセファロース　ｃＬ′６Ｂ充填のフ？−マシアのカラム８　（２ ，５ｘ１０ｃｍ）へ導いた。該カラムは前もって、バッファ、４℃、ｐＨ＝８． ０の０．０５Ｍ　（ＮＨ４）３　ＰＯ４で平衡してＪ３いた。

カラム８からの溶出物を、導管１０を介して醗酵器１へ再循環した。

５時間の循環操作の後、今度はカラム９を挿入して該方法を繰返した。このカラ ムはカラム８と全ての点で同様に設計され平衡にされていた。カラム８をｐＨ８ ，０の０．０５Ｍ（ＮＨ４）３　ＰＯ４の８思でフラッシュし、結合されたタン パクを、全部で１５０ｍ１の４℃の５０％ｖ／Ｖエタノールで溶出した。溶出物 を貯蔵タンク１４に集めた。カラム８を上記のように再び平衡にした。

２つのカラム８および９の間の上記変化を全部で４回繰返した。貯蔵タンク１４ 内の全容量は１．２１と測定され、インシュリン８１度１．８ｍａ／ｍｌで、回 収パーセント８８に対応する。

例３ ５ｍｇの生合成ヒト成長ホルモンを溶解した５２５　ｍｌのサツカロミセス　セ レビシェ　ｐＡＢ１８を、リン酸および２５％アンモニア水で０．３ＭおよびＤ Ｈ−６，８５に調整した。

光学密度１６．６まで培養した酵母懸濁物を、１．６Ｘ５ｃｍのカラム中、下か ら上へ適用した。このカラムは、流動床を形成する懸濁されたフェニルセフ７０ 一ス粒子を含む。

流１１１４００ｍｌ／ｖ１．１度２０℃。カラムは前もってｐＨ８，０，０，３ Ｍリン酸アンモニアで平衡にされていた。適用は循環プロセスとして１６時間実 施し、そして６５ｍ１の平衡バッファでフラッシュを実施した。トップピストン をゲルの表面まで押下げ、溶出を１００　ｍｌのＨ２Ｏで上から下の方向に実施 した。

適用液、フラッシュ液および溶出物中の１１ＧＨのｍを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより 決定した。

適用液は５ｍａのＢｈＧＨを含んでおり、フラッシュ液は０．２ｍｑのｈＧＨを 含んでおり、溶出物は４．８ｒｒｌの１１Ｇ）−１を含んでいた。存在する１− ＩＧ）−１の９６％はこうして酵母細胞を含まない水性液に溶出され、濃縮率は ５であった。

例４ ４１のＥＬＭ−産生Ｍ母培養物（サツカロミセス　セレビシェ　ＡＳ　１０３− １、プラスミド　ｐｙ−ＢＣＡ５含有）を光学密度３．５　（６１０ｎｍで測定 ）まで培養した。

０．５μ隔板のベリコン　カセット　システムのミリボア限外ろ過装置で、限外 ろ過を実施した。インシュリン様物質を含有する澄んだ黄色がかった醗酵ブイヨ ン（ｃ−０，５μｇ／ｍ１）を、４℃でＯ，ＩＭ　（ＮＨ４）２８０４まで調整 し、ｐ）−１７，２に調整した。

該ブイヨンを、ｐＨ７，２に調整された０、１Ｍ　（ＮＨ４）２　ＳＯ４のバッ ファで平衡にされたセファロース　ＣＬ　４８■充填の直径５．Ｑｃｍ、高さ１ ５ｃｍの７？−マシアのカラムに適用した。適用の間、インシュリン様物質の溶 出は検出されなかった。適用完了後、３カラム容最の平衡バッフ７Ｆでフラッシ ュ実施し、次いでＨ２Ｏでインシュリン様物質を溶出した。

収率８５川聞％、濃縮率１００゜ 例５ ｌ−１＝８．２の０．０５Ｍリン酸アンモニウムに溶解した２００μＩのボーク インシュリン（ｃ−０，９４ｍ０／ｍ　Ｉ　）を、ｐＨ＝８．２．０．０５Ｍリ ン酸アンモニウムで平衡にしたフェニルセファロース　ＣＬ　−６８Ｆ　ＦＣ） 充填のＱ、５Ｘ５Ｃｍのカラムに適用した。

適用完了後、５カラム容積の平衡バッファでフラッシュを行ない、インシュリン を７Ｍ尿素で溶出した。収率９２重量％。

例６ Ｃ−２０μ／ｍｌでボーク　インシュリンを含有する１０．２ｍｌの＃１酵ブイ ヨン　ｐｙ−ＢＣＡ５を、１５０μｍの１−（３ＰＯ４（オルト−）とＩ）ｌ− （−２，０まで混合した。

該溶液を、ｐＨ＝８．２．０．０５Ｍリン酸アンモニウム−ｒ、。、工。え７、 ユ２．７ア。−ユの。１４８□４゜Ｏ０６×５ｃｍのカラムに適用した。

適用後、５カラム容量の平衡バッファでフラッシュを実施し、それからＨ２Ｏで インシュリンを溶出した。

例７ Ｃ−１０μＱ／ｍｌでボーク　インシュリンを含有する１０．２ｍｌの醗酵ブイ ヨン　ｐＶＢＣＡ５　を、１５０μｍのＨ３ＰＯ４とｐＨ−２，１まで混合した 。

０．６Ｘ５Ｃｍカラムに適用した。

適用完了後、５カラム容量の平衡バッファでフラッシュを行ない、Ｈ２Ｏでイン シュリンを溶出した。

例８ Ｃ−１０Ｍｇ／Ｉでボーク　インシュリンを含有する１０．１ｍｌの醗酵ブイヨ ン　１）ＶＢＣＡ５を、１５０μｍの酢酸アンモニウムと混合した。１２．５％ ＮＨｉでｐＨを８．０に調整した。

ｘ５ｃｍのカラムに適用した。適用後、５カラム容量の平衡バッファでフラッシ ュを実施し、Ｈ２Ｏでインシュリンを溶出した。

例９ １２．５％ＮＨ３でｐＨ＝３．０．１０ｍ１の０．３゛ＭＨ３ＰＯ４（オルト） に溶解した１ｆｆｌのボークインシュリンヲ、ＤＨ＝Ｂ、Ｏｌｏ、３Ｍ　（Ｎ′ Ｈ＋　）３　ＰＯ４で平衡カラムに適用した。

適用後、５カラム容量の平衡バッフ１でフラッシュを実施し、そしてＨ２Ｏでイ ンシュリンを溶出した。収率９３重Φ％。

例１０ ５０、１ｍｇのボーク　インシュリンの溶解された５００ｍ１の１１Ｍ産生酵母 培養物（サツカロミセス　セレビシよりＡｌ−１１８、プラスミド　ｐＹＢｃＡ ５含有）を、リン酸および２５％アンモニアで濃度０．３ＭおよびＤＨ３，０に 調整した。

光学密度１７まで培養した酵母懸濁物を、流動床を形成する懸濁セファ０一ス粒 子を含んだ１．５ｘ５ｃｍカラム中に下から上へ適用した。該カラムは前もって ｐＨ＝０．８．０．３Ｍリン酸アンモニウムで平衡にされていた。適用後、６５ ｍ１の平衡バッファでフラッシュを実施し、その後流れを止めゲルを沈澱させた 。

１−ツブピストンをゲルの表面まで押し下げて、１カラム容量の１−１２０を上 から下の方向に適用した。それから流れを３０分止め、続いて２５ｍ１の８２０ で溶出を行った。溶出物は透明で少し黄色がかったインシュリン溶液であり酵母 細胞を含まなかった。

適用液および溶出物中に存在するインシュリンの旧をＲＰ−ｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ で決定した。適用において、２５．５ｍｇがカラムに止まり、カラムは明らかに 飽和された。フラッシュ９ａ埋の間、２．９ｍａに対応する母が溶出物中に検出 された。そして２５．０ｍａのインシュリンがト（２０で溶出された。

国際調査報告　ＰＣＴ／１）ＫＡ、／ｌ”ｌｏｏ、、２・＋Ｍｍ−−１＾−−呻 −Ｈ・　ＰＣＴ／ＤＫ８５１０００６２

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．醗酵ブイヨンからボリペプチドを回収する方法であって、前記醗酵ブイヨン は微生物での醗酵により製造されており、前記醗酵ブイヨンを疎水基を含み醗酵 ブイヨン中に含まれるボリペプチドを吸着するクロマトグラフ物質で処理する方 法において、該醗酵ブイヨンを、場合により該微生物の分離の後に、疎水基を含 む前記クロマトグラフ材料で処理すること、および該クロマトグラフ材料に吸着 されたポリペプチドを、所望により水混和性有機溶媒を含有することのできる水 性媒質で溶出すること、を特徴とする方法。
2. ２．連続的に醗酵部からの懸濁状態の該微生物と共に該醗酵ブイヨンをクロマト グラフ物質の流動床中を循環させること、およびその後該微生物懸濁物を該醗酵 部に再循環すること、を特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該醗酵ブイヨンを限外ろ過装置を通して循環し該微生物を含有する該リチン テイトを分離すること、該微生物を含有する該リチンテイトを循環すること、お よび該ろ液を該クロマトグラフ物質床を通過させること、および所望によりそれ を基質として再循環すること、を特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．該微生物は、所望のボリペプチドをコーティングする遺伝子の導入によって トランスフォームされた酵母細胞であることを特徴とする請求の範囲第１−３項 記載の方法。
5. ５．該所望のボリペプチドはヒトプロインシュリンであることを特徴とする請求 の範囲第４項記載の方法。
6. ６．該所望のボリペプチドはｈＧＨであることを特徴とする請求の範囲第４項記 載の方法。
7. ７．該クロマトグラフ物質はフェニルセファロースであり、該溶出剤は水および エタノールの混合であることを特徴とする請求の範囲第１−６項記載の方法。
8. ８．０．０１−１モル好ましくは０．０５−０．４モル濃度で高タンパク塩析効 果を伴うイオンを、該醗酵ブイヨンに該クロマトグラフ物質処理の前に添加する ことを特徴とする請求の範囲第１−７項記載の方法。
9. ９．該醗酵ブイヨンのｐＨを３−５に調壁することを特徴とする請求の範囲第８ 項記載の方法。
10. １０．該クロマトグラフ物質処理の間、該醗酵ブイヨンを２−１２℃好ましくは ４−６℃の温度に冷し保つことを特徴とする範囲の方法。
11. １１．醗酵器（１）、および前記醗酵器に接続された少なくとも１つのクロマト ブラフカラム（８，９）、該醗酵ブイヨンが該醗酵器（１）から該１つ又は複数 のクロマトグラフカラム（８，９）中を通って循環する手段（２．７，１０）か らなることを特徴とする請求の範囲第１−１０項記載の方法を実施するための装 置。
12. １２．該微生物懸濁物を該醗酵器（１）に再循環するための手段（６）に接続さ れた限外ろ過装置（５）、およびろ液を該１つ又は複数のクロマトグラフカラム （８，９）に移動させる手段（１）を備えることを特徴とする請求の範囲第１１ 項記載の装置。