KR100372931B1 - 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법 - Google Patents
팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100372931B1 KR100372931B1 KR10-2000-0081953A KR20000081953A KR100372931B1 KR 100372931 B1 KR100372931 B1 KR 100372931B1 KR 20000081953 A KR20000081953 A KR 20000081953A KR 100372931 B1 KR100372931 B1 KR 100372931B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gel
- bacteriocin
- ion exchange
- column
- purification
- Prior art date
Links
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 title claims abstract description 100
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims description 10
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 16
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 abstract description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 80
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 4
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000191953 Kocuria varians Species 0.000 description 2
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 2
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 1
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 1
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23B—PRESERVATION OF FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES
- A23B2/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general
- A23B2/70—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals
- A23B2/725—Preservation of foods or foodstuffs, in general by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23B2/729—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23B2/7295—Antibiotics
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법(expanded bed adsorption-ion exchange chromatography)을 이용한 락토코크스 락티스 발효 배양액 가운데 존재하는 항균단백질인 박테리오신의 정제방법에 관한 것으로 더 상세하게는 박테리오신이 존재하는 발효배양액을 원심분리 또는 단백질 침전 등의 어떠한 전처리 없이 바로 컬럼에 흘려줌으로서 목적하는 박테리오신을 선택적으로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법은, 락토스를 함유한 배지에서 락토코크스 락티스 균주를 전치 배양한 후 배양기에서 교반 시키면서 통기 없이 배양하는 배양액 조성단계; 상기 단계에서 배양된 배양액중의 박테리오신을 분류하기 위하여 팽창층 이온교환겔이 채워진 컬럼에 유로를 아래에서 위 방향으로 배양액을 전처리 없이 투입하는 단계; 배양액을 모두 이온교환겔에 투입한 후 겔세척 용매인 물로 이온교환겔에 결합하지 않고 남아있는 다른 입자들을 제거하는 단계; 세척이 끝난 겔을 침강시키고 컬럼의 어뎁터를 겔의 윗표면 까지 내리고 유로의 방향을 컬럼의 위에서 아래로 잡아 일반 충진 컬럼처럼 사용하는 단계; 이온교환 겔에 결합한 박테리오신을 유리시키기 위해 염화나트륨을 일정한 유속으로 하여 등용매를 이용하여 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이에 따라 실험 방법이 간단해지고, 공정의 단순화를 통한 박테리오신의 분리 정제 효율을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 락토코크스 락티스(Lactococcus lactis) 발효 배양액 가운데 존재하는 항균 단백질인 박테리오신(Bacteriocin)의 정제방법에 관한 것으로 더 상세하게는 박테리오신이 존재하는 발효 배양액을 원심분리 또는 단백질 침전 등의 어떠한 전처리 없이 바로 컬럼에 흘려줌으로서 목적하는 박테리오신을 선택적으로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
박테리오신(Bacteriocin)은 균주(박테리아)에 의해 합성되는 단백질성 항균 물질의 총칭으로서, 락트산 균주에 의해 생산되어 특히 식품 보존제로 광범위하게 사용되며, 식품산업 및 화학공업 등에서 여러 가지 산업적 형태로 활용되고 있는 유용한 자원이다.
식품보존제로서의 박테리오신을 생성하는 젖산균은 다양한 식품의 발효에 관여하여 독특한 풍미를 부여할 뿐만 아니라, 항균성 물질을 생산하여 식품의 저장성 및 안정성을 증대시키는 효과가 있다. 이러한 젖산균이 생산하는 항균성 물질로는 젖산 등의 유기산 이외에 과산화수소, 디아세틸, 박테리오신 등이 알려져 있다.
젖산균에 의해 생성되는 박테리오신은 항균성 펩티드(Peptide) 또는 단백질로서 소화계의 여러 단백질 분해효소에 의해 분해되므로 인체에 무해하고 잔류성이없으며, 직접적인 유전자 조작 등에 의한 생물학적 응용이 용이하다는 점에서 기존의 화학적 식품보존제를 대체할 수 있는 새로운 생물학적 보존제로서 주목 받고 있다. 인류가 오랫동안 섭취해 왔고 미국 식품 의약품 안전국(FDA)에 의해 안전하다고 인정된 젖산균과 젖산균이 생산하는 박테리오신은 식품에서 화학 첨가제 사용없이 열처리를 최소화 시켜 식품 안정성 확보에 유용하다.
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)가 생산하는 박테리오신인 니신(nisin)은 1947년 발견된 이래 많은 연구가 이루어져 왔고, 광범위한 항균 범위 때문에 이미 오래 전부터 사용이 허용되었고, 미국에서도 1988년부터 FDA가 GRAS(generally recognized as safe) 식품 첨가물로 인정하게 되었다.
한편, 마이크로코쿠스 바리안스(Micrococcus varians) 균주로부터의 박테리오신, 상기 박테리오신을 생성하는 균주, 상기 박테리오신의 병원성 세균에 대항하는 활성이 있는 제제 및 상기 박테리오신을 이용한 식품 및 화장품의 제조에서 박테리오신의 용도등에 관하여 국내 특허 공개번호 97-0010970에 소개되어 있으며, 그 제조방법은 박테리오신을 생산하는 마이크로코쿠스 바리안스 균주를 성장에 적합한 조건하에서 배지중에 배양하여, ml당 107~1011 개체의 상기 균주를 함유하는 배양 배지를 수득한 후, 생성된 배양액을 원심 분리하여 상기 박테리오신을 함유하는 상층액 추출물을 제조하여 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 나타내는 마이크로코쿠스 바리안스로부터의 박테리오신과 1~4개의 아미노산을 치환, 결실 및 또는 삽입 시킴으로서 상기 아미노산과는 상이한 마이크로코쿠스 바리안스로부터의 박테리오신을 제조하는 것이다.
국내 특허 공개번호 91-0018553호에는 페디오코커스 엑시디오락티스 NRRL-B18050.5627과 같은 발효된 페디오코커스 균주에 의한 박테리오신의 활성과 정제와 관련하여 소개되어 있다.
국내 특허 공개번호 2000-0047065호에는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) MT-1077 균주에 의한 박테리오신의 활성과 정제와 관련하여 소개되어 있다.
일반적으로 박테리오신의 정제와 관련하여 박테리오신 생산 균주인 락토코크스 락티스의 발효 배양액으로부터 박테리오신을 생산할 경우, 박테리오신의 정제 및 분석방법은, 균주의 분리 및 보존과 박테리오신 생산 균주의 탐색 및 선발 단계, 형태 및 배양학적 특성과 생리학적 특성으로 구분되는 분리된 균주의 특성 조사 단계, 균의 배양과 침전 및 이온교환 크로마토그래피 그리고 친화성 크로마토그래피 및 역상크로마토그래피 등의 방법을 복합적으로 이용하는 박테리오신의 분리 및 정제 단계, 상기 분리 및 정제 단계로부터 얻어진 박테리오신의 특성 측정 단계, 상기 박테리오신의 아미노산 조성 및 아미노산 서열 분석 단계 등을 차례로 거쳐 박테리오신의 정제와 정제된 박테리오신에 대한 시험 및 분석을 실시한다.
국내 특허 공개번호 2000-0047065호에 소개된 박테리오신의 정제방법은, 박테리오신을 생산하는 균주로서 락토바실러스 속 MT-1077을 사용하는 조건이 있으나, 정제방법은 락토바실러스 속 MT-1077 균주의 배양액에 황산암모늄을 첨가하는 황산암모늄 침전단계; 상기 단계에서 수득한 단백질 침전물의 양이온교환 크로마토그래피 단계; 상기 단계에서 수득한 용출액의 소수성 흡착 크로마토그래피 단계; 그리고, 상기 단계에서 수득한 용출액의 고속 액체크로마토그래피 단계를 포함하는방법이다.
그러나, 균의 배양과 침전 및 이온교환 크로마토그래피 그리고 고속액체크로마토그래피 및 역상크로마토그래피 등의 방법을 복합적으로 이용하는 박테리오신의 분리 및 정제 방법이나 황산암모늄 침전 그리고 양이온교환 크로마토그래피 그리고 소수성 흡착 크로마토그래피 및 고속액체크로마토그래피 방법들을 선택 복합적으로 이용하는 박테리오신의 분리 정제 농축방법은 실험 방법이 복잡하며, 장시간의 실험 시간을 필요로 하여 박테리오신의 상용화에 어려움이 있었다. 또한, 다단계 처리로 인한 공정의 복잡성이 있고 그 만큼 분리 효율도 떨어졌다.
따라서 본 발명의 목적은 배양액 속에 들어 있는 항균 단백질인 박테리오신을 전처리 없이 일단계로 정제하는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피를 이용한 배양액 가운데의 박테리오신의 정제방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위한 상기 박테리오신의 분리 및 정제방법인 본 발명의 특징은, 락토스를 함유한 배지에서 락토코크스 락티스 균주를 전치 배양한 후 전치 배양액을 이용하여 배양기에서 산도를 일정하게 유지시키며 통기없이 교반 배양하는 배양액 조성단계와, 상기 단계에서 배양된 배양액중의 박테리오신을 분류하기 위하여 팽창층 이온 교환겔이 채워진 컬럼에 유로를 아래에서 위 방향으로 배양액을 전처리 없이 투입하는 단계와, 배양액을 모두 이온교환겔에 투입한 후 겔세척 용매인 물로 이온교환겔에 결합하지 않고 남아있는 다른 입자들을 제거하는 단계와, 세척이 끝난 겔을 침강시키고 컬럼의 어덥터를 겔의 윗표면 까지 내리고 유로의 방향을 컬럼의 위에서 아래로 잡아 일반 충진 컬럼처럼 사용하는 단계와, 이온교환 겔에 결합한 박테리오신을 유리시키기 위해 염화나트륨을 일정한 유속으로 하여 등용매를 이용하여 분리하는 단계로 이루어지는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법을 특징으로 한다.
도 1은 본 발명에 이용되는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피 장치의 개략도
도 2는 본 발명에 따른 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법 칼럼에 의한 정제 공정도
도 3는 박테리오신의 정제 과정 중 시료의 흐름속도에 따른 겔의 팽창층 정도와 박테리오신의 결합정도를 나타낸 그래프
도 4는 락토코크스 락티스 발효 배양액을 겔에 적용시킬 때 사용할 겔의 적정량 및 적용 배양액의 적정량을 측정한 그래프
도 5는 락토코크스 락티스 발효 배양액 중의 박테리오신 정제의 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그램
도 6은 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피를 이용해 분리 정제된 박테리오신의 Tricine-SDS-PAGE와 Silver staining 사진
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*
10:크로마토그래피 장치 20:발효기(Fermentor)
30:펌프시스템 40:용리액 용기
50:밸브 60:컬럼 (Column)
이하, 본 발명의 실시 예를 도면을 참고로 설명하면 다음과 같다.
일반적인 박테리오신의 정제 방법은 침전법, 추출법, 이온교환 크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 및 역상크로마토그래피 등의 방법을 복합적으로 사용하여 분리 정제 농축을 시행하여 왔다. 이들 방법의 문제점은 실험 방법의 복잡함과, 정제 공정의 복잡함 그리고 실험 시간 등의 과다 소요에 있다.
본 발명은 이러한 박테리오신의 정제에 관하여 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용하는 것으로 일반적인 겔충진 크로마토그래피법이 아닌 겔팽창 컬럼에 팽창층 겔 흡착-이온교환겔을 사용한다. 컬럼어뎁터를 충분히 올려주고 이동상의 흐름방향을 아래에서 위로 흘려 주어 겔을 최대한 팽창시킨 다음 락토코크스 락티스(일명 A164) 발효 배양액을 전처리 없이 직접 팽창층 겔의 아래에서 위의 방향으로 흘려주어 이온교환 겔에 발효 배양액 가운데 박테리오신을 포함한 단백질을 선택적으로 결합시킨다.
그 후 칼럼에 발효 배양액 중 이 이온교환겔과 결합하지 않고 남아있는 다른 성분들로부터 팽창층 겔 흡착-이온교환겔을 충분히 세척용매인 물로 세척하여 준다. 세척이 끝난 겔은 세척용매의 흐름을 멈추게 하고 정치하여 겔의 팽창을 멈추어 주고 겔을 침강시킨다. 겔이 완전히 침강되면 컬럼 어뎁터를 겔의 윗표면으로 내려 일반 충진컬럼과 같이 만든다. 이때 겔에 결합되어 있는 배양시료 가운데 박테리오신을 선택적으로 용리 시키기 위해 0.15M 염화나트륨을 사용하여 겔로부터 박테리오신만을 용리 시킨다.
이와 같은 팽창층 겔 흡착 방법은 새로운 시료 전처리 방법으로서 그 적용 범위가 점차 확대되고 있다. 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법의 가장 큰 장점은 일반적으로 사용되어 왔던 단백질 정제방법의 다단계 방법에서의 각 단계에서의 목적성분의 손실을 최소화할 수 있으며, 실험 시간의 단축을 가져올 수 있다는 것이다.
그리고 또 일반적인 충진컬럼 크로마토그래피는 배양시료를 직접 컬럼에 적용할 수 없으나 팽창층 겔 크로마토그래피는 배양시료를 직접 시료에 적용하며 시료에 들어 있는 박테리오신을 선택적으로 정제 농축하기 위하여 이온교환겔과 세척용매, 박테리오신을 이온교환겔로부터 유리시키는 용매의 염의 농도를 조절하여 정제된 박테리오신을 얻을 수 있다. 따라서 이러한 방법을 박테리오신의 정제에 응용하면 특성 단백질을 보다 쉽고 빠르게 정제할 수 있다.
따라서 본 발명은 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 락토코크스 락티스 발효 배양액 내에 존재하는 식품보존제인 박테리오신을 효율적으로 분리하는 기술로서, 배양액을 전처리 없이 직접 정제할 수 있는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 시료의 팽창층 겔 컬럼에의 적용 유속을 조절하여 겔의 팽창성 및 락토코크스 락티스 A164 배양액 중의 박테리오신의 겔의 흡착용량을 조절함으로써, 크로마토그래피를 수행할 경우 우수한 박테리오신의 정제가 가능한 것으로 확인되었다.
결국, 본 발명은 배양액 속에 들어있는 항균 단백질인 박테리오신을 전처리 없이 일단계로 정제하는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 배양액 가운데의 박테리오신의 정제 방법을 제공하게 되는 것이다.
락토코크스 락티스 A164 배양액 속의 항균 단백질인 박테리오신 성분을 분리하는 공정을 단계적으로 설명하면 다음과 같다.
(실시예)
박테리오신의 정제 방법에 사용되는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피 장치(10)는 도 1과 같이 발효기(20)와 용리액용기(40)에 있는 배양액과 용액을 펌핑하는 펌프시스템(30) 및 밸브(50) 그리고 컬럼(60) 등으로 구성한다.
이 같은 크로마토그래피 장치(10)를 이용하여 0.5%락토스를 함유한 배지에서 30℃에서 16시간 락토코크스 락티스 A164 균주를 전치 배양한 후 30L 배양기에서 100rpm으로 천천히 교반 시키면서 통기없이 배양한다.
이때 산도를 일정하게 유지시키기 위해 5M 수산화나트륨을 자동적으로 적가한다.
이와 같이 배양한 배양액 중의 박테리오신을 분류하기 위하여 팽창층 겔 흡착-이온교환겔이 채워진 컬럼(60)에 유로를 아래에서 위 방향으로 배양액을 전처리 없이 직접 투입한다.
배양액을 모두 이온교환겔에 투입한 후 겔세척 용매인 물로 이온교환겔과 결합되지 않고 남아있는 다른 입자들을 완전히 제거한다.
세척이 끝난 겔을 가만히 침강시키고 컬럼(60)의 어뎁터를 겔의 윗표면 까지 내리고 유로의 방향을 컬럼의 위에서 아래로 잡아 일반 충진 컬럼처럼 사용한다.
이온교환 겔에 결합한 박테리오신을 유리시키기 위해 0.15M 염화나트륨을 유속 5ml/min의 유속으로 등용매를 이용하여 분리한다.
다시 컬럼의 이온교환겔을 재활성화 시키기 위해 1.0M 염화나트륨을 이용한다.
도 2는 본 발명에서 이용되는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법 칼럼에 의한 겔팽창 이온교환의 도식적 공정순서이다.
컬럼(60)에 팽창층 겔 흡착-이온교환 겔을 넣는다(S10).
펌프시스템(30)를 이용하여 겔을 팽창시키기 위하여 팽창-용리액(40)을 컬럼(70)의 아래에서 위 방향으로 흘려주면서 팽창층을 형성시킨다.(S20)
발효기(20)의 발효 배양액을 컬럼(70)의 아래에서 위 방향으로 팽창층 겔에 흘려주면서 겔에 목적성분을 결합시킨다.(S30)
세척-용리액(40)을 이용하여 겔에 결합되지 않은 물질을 제거해준다.(S40)
겔을 가만히 침강시키고 컬럼의 어뎁터를 아래로 내려 일반 충진 컬럼으로 만든다.(S50)
분리-용리액(40)을 컬럼의 위에서 아래 방향으로 흘려주어 목적성분을 분리해 낸다.(S70)
겔의 팽창층 정도가 박테리오신의 정제 정도에 영향을 미치므로 유속에 따른팽창층 정도의 유속을 5ml/min씩 변화를 주면서 0~45ml/min까지 측정하였다.
각 단계시 이온교환 겔에 결합된 배양액 가운데의 총 단백질 양을 측정하여 도 3에 나타내었다. 도 3은 박테리오신의 정제 과정 중 시료의 흐름속도에 따른 겔의 팽창정도와 박테리오신의 결합정도에 관한 그래프이다.
유속이 30ml/min일 때 배양액내의 단백질양과 겔에 결합시킨 후 유리된 단백질의 농도의 비가 최대가 되며, 이때의 유속 30ml/min은 완전히 침강한 겔이 2.7배 팽창층을 형성하였을 경우이다. 이는 겔이 충분히 팽창층을 형성하여야만 많은 양의 단백질과 결합될 수 있기 때문이다.
또한 팽창층 겔 흡착-이온교환 수지에 투입하는 배양시료의 적정량을 결정하기 위해 겔에 결합하지 않고 유출되는 A164박테리오신의 양을 측정한 결과는 도 4와 같다.
도 4는 락토코크스 락티스 A164 발효 배양액을 겔에 적용 시킬 때 사용할 겔의 적정량과 발효액의 적정량을 측정하는 그래프이다.
팽창층 겔 흡착-이온교환겔 100ml가 처리할 수 있는 배양액의 적정량은 400ml로 측정되었다. 이로써, 얻은 결과를 통하여 배양액 400ml을 팽창층 겔 흡착-이온교환겔 100ml에 결합시킬 경우 유속을 30ml/min으로 하여 겔과 결합시켜 얻은 데이터 이다.
이를 바탕으로 A164 박테리오신의 정제 크로마토그램을 나타내면 도 5와 같다.
도 5는 락토코크스 락티스 A164 발효 배양액 중의 박테리오신 정제에 대한팽창겔 흡착-이온교환 크로마토그램이며, 도 6은 상기 방법으로부터 0.15M 염화나트륨을 이용하여 분리된 A164 박테리오신의 정제정도를 확인하기 위해 Silver- staining을 이용한 Tricine-SDS-PAGE사진이다.
이를 보면 3.5 KDa위치에서 단일의 밴드를 확인할 수 있으며(A, 3) 이는 기존의 표준품으로 사용되는 밴드(A, 4)와 동일하므로 A164 박테리오신임을 확인할 수 있다. B는 이들 단일 밴드가 박테리오신임을 증명하는 사진으로, A와 동일 한 젤의 반을 지시균주가 분주된 아가플레이트 위에 놓음으로써 박테리오신 밴드의 위치에서 지시균주의 성장억제환이 형성됨을 확인할 수 있다.
상술한 방법에 의해 정제된 A164박테리오신의 정제표를 표 1에 나타내었다.
| 정제단계purification step | 부피(ml) | 총단백질(mg) | 활성도(AU/ml) | 총활성도(AU) | 특이활성도(AU/mg) | 회수율 (%) | 정제배율(Purification fold) |
| 배양기(액)Culture broth | 400 | 3680 | 16,384 | 6.55×106 | 1.78×103 | 100 | 1 |
| A164박테리오신 | 180 | 162 | 32,768 | 5.90×106 | 3.64×104 | 90 | 20.4 |
표 1에서 보면 이 방법의 회수율은 90%이며, 정제배율(purification fold)은 20.4%로 나타났다.
또한, 기존의 일반적인 박테리오신 정제 방법인 황산 암모늄 침전, 소수성 흡착 크로마토그래피, 한외여과법을 시행하여 얻은 본 발명에서 사용한 박테리오신 정제 방법을 표 2에 나타내었다.
| 기존 정제 단계 | 총단백질 (mg) | 총활성도(AU) | 특이활성도(AU/ml) | 회수율 (%) |
| 배양기(액)Culture broth | 75 | 5.2 x 108 | 7.0 x 106 | 100 |
| 1. 황산암모늄 침전2. 소수성흡착 크로마토그래피3. 한외여과법 | 0.9 | 3.2 x 108 | 3.6 x 108 | 61 |
표 2에서 보면 기존 방법의 회수율은 61%로 나타났다.
이와 같이 본 발명은 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 락토코크스 락티스 발효 배양액 가운데 존재하는 항균단백질인 박테리오신을 정제함으로서 박테리오신이 존재하는 발효 배양액을 원심분리 또는 단백질 침전 등의 어떠한 전처리 없이 바로 컬럼에 흘려줌으로서 목적하는 박테리오신을 선택적으로 분리할 수 있어 종전의 박테리오신의 분리 및 정제에 비해 공정의 단순화 및 처리시간의 단축 그리고 박테리오신의 분리 효율을 향상 시킬 수 있다.
Claims (3)
- 박테리오신의 정제와 관련하여 락토코크스 락티스 발효 배양액을 박테리오신의 정제를 위한 균주로 사용하고, 박테리오신의 정제를 위하여 박테리오신 생산 균주의 탐색 및 선발 단계, 형태 및 배양학적 특성과 생리학적 특성으로 구분되는 분리된 균주의 특성 조사 단계, 균의 배양과 침전 및 이온교환 크로마토그래피 그리고 친화성 크로마토그래피 및 역상크로마토그래피 등의 방법을 복합적으로 이용하는 박테리오신의 분리 및 정제 단계로 이루어지는 박테리로신의 분리 및 정제방법에 있어서,상기 박테리오신의 분리 및 정제방법은,락토스를 함유한 배지에서 락토코크스 락티스 균주를 전치 배양한 후 전치 배양액을 이용하여 배양기에서 산도를 일정하게 유지시키며 통기없이 교반 배양하는 배양액 조성단계;상기 단계에서 배양된 배양액중의 박테리오신을 분류하기 위하여 팽창층 겔 흡착-이온 교환겔이 채워진 컬럼에 유로를 아래에서 위 방향으로 배양액을 투입하는 단계;배양액을 모두 이온교환겔에 투입한 후 겔세척 용매인 물로 이온교환 겔에 결합하지 않고 남아있는 다른 입자들을 제거하는 단계;세척이 끝난 겔을 침강시키고 컬럼의 어덥터를 겔의 윗표면 까지 내리고 유로의 방향을 컬럼의 위에서 아래로 잡아 일반 충진 컬럼처럼 사용하는 단계;이온교환 겔에 결합한 박테리오신을 유리시키기 위해 염화나트륨을 일정한 유속으로 하여 등용매를 이용하여 분리하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법.
- 제1 항에 있어서,상기 배양액조성은 0.5%락토스를 함유한 배지 30℃에서 16시간 락토코크스 락티스 A164 균주를 전치 배양한 후 전치배양액을 이용하여 위와 동일 조건의 30L 배양기에서 100rpm으로 교반시키면서 통기없이 배양하고, 산도를 일정하게 유지시키기 위해 5M 수산화나트륨을 자동적으로 적가하는 것을 특징으로 하는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리정제방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 이온교환 겔에 박테리오신을 결합시키기 위한 최적 유속 30ml/min으로 박테리오신 배양액을 이온교환 겔에 결합시킬 경우 팽창층 겔 흡착-이온교환 겔 100ml당 배양액 400ml의 비율로 적용시키는 것과 이온교환 겔로부터 결합한 박테리오신을 유리시키기 위해 0.15M 염화나트륨을 유속 5ml/min의 등용매 분리를 특징으로 하는 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리정제방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0081953A KR100372931B1 (ko) | 2000-12-26 | 2000-12-26 | 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0081953A KR100372931B1 (ko) | 2000-12-26 | 2000-12-26 | 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020052564A KR20020052564A (ko) | 2002-07-04 |
| KR100372931B1 true KR100372931B1 (ko) | 2003-02-25 |
Family
ID=27685944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2000-0081953A KR100372931B1 (ko) | 2000-12-26 | 2000-12-26 | 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100372931B1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100427174C (zh) * | 2006-11-10 | 2008-10-22 | 清华大学 | 一种集成化提取分离中药有效成分的方法及装置 |
| CN101386815B (zh) * | 2007-09-11 | 2011-06-01 | 中国科学院过程工程研究所 | 扩张床吸附原位提取琥珀酸发酵分离的耦合装置和工艺 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100209787B1 (ko) * | 1997-04-25 | 1999-07-15 | 박원훈 | 신규한 박테리오신을 생산하는 신규 락토코커스 속 미생물 및 그로부터 생산되는 박테리오신 |
| US6027650A (en) * | 1998-02-18 | 2000-02-22 | Genentech, Inc. | Adsorption chromatography |
| KR20000047065A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 박호군 | 신규 락토바실러스 속 (lactobacillus sp.)mt-1077 및 그로부터 생산되는 신규 박테리오신 |
-
2000
- 2000-12-26 KR KR10-2000-0081953A patent/KR100372931B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100209787B1 (ko) * | 1997-04-25 | 1999-07-15 | 박원훈 | 신규한 박테리오신을 생산하는 신규 락토코커스 속 미생물 및 그로부터 생산되는 박테리오신 |
| US6027650A (en) * | 1998-02-18 | 2000-02-22 | Genentech, Inc. | Adsorption chromatography |
| KR20000047065A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 박호군 | 신규 락토바실러스 속 (lactobacillus sp.)mt-1077 및 그로부터 생산되는 신규 박테리오신 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Bioseparation. 1999;8(1-5): 159-68 * |
| Food science and biotechnology Vol.9(4) pp.263-269, 2000 * |
| Journal of microbiology and biotechnology Vol.10(4) pp.539-543, 2000 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20020052564A (ko) | 2002-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pingitore et al. | Different strategies for purification of antimicrobial peptides from lactic acid bacteria (LAB) | |
| Fan et al. | Isolation and identification of novel casein-derived bioactive peptides and potential functions in fermented casein with Lactobacillus helveticus | |
| CA2257271C (en) | Method of isolating cyclosporins | |
| Maqueda et al. | Peptide AS-48: prototype of a new class of cyclic bacteriocins | |
| JPH0231687A (ja) | 血清アルブミンの純化方法 | |
| Boulton et al. | Transferrin-binding protein B isolated from Neisseria meningitidis discriminates between apo and diferric human transferrin | |
| CN111285925B (zh) | 副干酪乳杆菌zfm54细菌素的分离纯化方法 | |
| AU639638B2 (en) | Novel bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis | |
| EP0519726A2 (en) | A process for large-scale production of antimicrobial peptide in high purity | |
| JP4302976B2 (ja) | 抗リステリアバクテリオシン | |
| CN110511896B (zh) | 一株产多细菌素的植物乳杆菌、细菌素及其提取方法和应用 | |
| EP0446582B1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
| KR100372931B1 (ko) | 팽창층 겔 흡착-이온교환 크로마토그래피법을 이용한 박테리오신의 분리 정제 방법 | |
| JPH02167069A (ja) | スタフィロコッカス・エピデルミディスおよび医薬組成物 | |
| Aktypis et al. | Purification and characterization of thermophilin ST-1, a novel bacteriocin produced by Streptococcus thermophilus ACA-DC 0001 | |
| Callewaert et al. | Expanded bed adsorption as a unique unit operation for the isolation of bacteriocins from fermentation media | |
| AU768673B2 (en) | Process for producing peptides from biological fluids and peptides obtainable by said process | |
| JPS61502585A (ja) | 醗酵ブイヨンからポリペプチドを回収するための方法および装置 | |
| Shimazaki et al. | Interacting properties of bovine lactoferrin with immobilized Cibacron blue F3GA in column chromatography | |
| CN112957771A (zh) | 一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法 | |
| CN113480622A (zh) | 一种重组肺炎球菌溶血素制备及纯化的方法 | |
| EP1148064A1 (en) | Lactobacillus johnsonii bacteriocin, active against Helicobacter pylori | |
| Madhusudhan et al. | Aqueous Two-Phase Extraction in Downstream Processing | |
| JPH0499448A (ja) | 油糧種子由来蛋白質 | |
| JP2024522930A (ja) | クロストリジウム・ボツリヌス毒素複合体タンパク質の精製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20001226 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20030121 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20030207 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20030210 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20060206 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20070208 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20080212 Year of fee payment: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20080212 Start annual number: 6 End annual number: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee | ||
| PC1903 | Unpaid annual fee |