CN112957771A - 一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然食品防腐剂的分离技术领域，具体涉及一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法。所述色谱系统包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统；本发明基于乳酸链球菌发酵液中不同组分和疏水基团之间作用力不同实现分离，先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，采用高流速动力使吸附作用力弱的Nisin快速流出色谱柱，而色素和异味物质吸附于介质表面，通过再生液洗脱进行解离。本发明方法克服了传统工艺的缺点，提高了食品级乳酸链球菌素的口感和质量，可实现快速和高效的分离，且无有机溶剂的残留，绿色环保，色谱柱使用寿命长，生产成本低。

Description

一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法

技术领域

本发明涉及天然食品防腐剂的分离技术领域，具体涉及一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin，尼辛)亦称乳酸链球菌肽，是乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的多肽类化合物，由34个氨基酸残基组成，其分子末端有氨基和羧基，氨基末端为异亮氨酸，羧基末端为赖氨酸，分子量约为3500Da。乳酸链球菌具有稳定、高效的抗菌活性，可被人体吸收利用，不会改变人体肠道内正常菌群，且不会产生如其他抗菌素出现的耐药性问题或交叉抗性。乳酸链球菌素能有效抑制食品腐败的多种革兰氏阳性菌，是食品保鲜防腐、延长货架期的良品，到目前为止，全世界已有五十多个国家和地区批准将乳酸链球菌素作为食品防腐剂，现已广泛应用于乳制品、罐头、海产品、肉制品等。此外，乳酸链球菌素在医疗卫生领域也有较大的应用前景，如高纯度的乳酸链球菌素对治疗母牛乳腺炎就有很好的疗效。

目前，乳酸链球菌的发酵生产是获得乳酸链球菌素的唯一途径，但发酵产物组分复杂，对分离和纯化工艺有极高的要求，很难实现高纯度乳酸链球菌素的制备。并且，乳酸链球菌发酵产物通常会伴随令人不快的异味，加入到食品中也会影响食品的味道和口感，降低食用者接受度。同时乳酸链球菌发酵液中的色素若去除不完全，也会影响产品色泽和品质。因此，如何去除乳酸链球菌素的色素和异味也是其生产制备过程中十分重要的环节。

但是另一方面，多肽类化合物在分离纯化后还存在回收率低的问题，一般多肽或蛋白质在纯化过程中容易受温度、pH值、缓冲液离子强度、溶剂等因素的影响，导致自身活性丧失。如公告号为CN100554276C的专利文献中建立了从含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清液中纯化乳酸链球菌素，虽然提高了纯度和得率，但活性多肽的总回收率仅能达到57％左右，可见其乳酸链球菌素在纯化操作中丧失了部分活性。而传统去除乳酸链球菌素色素和异味的工艺也存在较多缺点，如泡沫吸附法的活性回收率低，溶剂萃取法对环境污染较大且容易有溶剂残留，盐析法去除杂质不完全，仍有大量杂蛋白和色素残留。因此，在完全去除色素和异味的基础上保证多肽的活性和稳定性，仍然是乳酸链球菌素纯化工艺面临的难题。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供一种快速高效、绿色环保的去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法，同时使得到的乳酸链球菌素具有较高的活性回收率。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统，其中，色谱柱采用苯基键合硅胶介质。

作为优选，本发明色谱柱的介质采用高压匀浆法进行填充。

作为优选，本发明的可再生色谱系统中，进液系统包括进样管、进样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门，出液系统包括出样管、出样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门。

本发明的可再生色谱系统可利用吸附-穿透法分离Nisin与其发酵液中的色素、异味等杂质。先通过高压匀浆法将苯基键合硅胶介质填充于色谱柱中，作为疏水作用色谱的固定相，进样后由于乳酸链球菌素在该介质上的吸附作用力弱，可优先穿出色谱柱，而疏水作用力强的杂蛋白、色素、异味成分等杂质组分吸附于色谱柱介质表面，则需在完成分离后用再生液进行清洗解离，从而实现高效分离。

而目前普遍采用盐析、泡沫吸附法等对乳酸链球菌素进行粗分离，但盐析法往往残留大量杂蛋白及色素成分，泡沫吸附法不仅分离效率低，还会导致Nisin的活性回收率偏低，表面活性剂的用量较大，材料回收和再利用存在问题，不适于绿色经济的工业生产。

此外，用C18色谱柱作为固定相进行反相层析分离也是Nisin纯化常用工艺，但C18硅胶柱介质表面的烷基链长度对蛋白质、多肽类物质的吸附保留和活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，蛋白质和多肽与固定相的结合力越强，Nisin易被吸附无法直接穿出色谱柱，需增加流动相有机溶剂的洗脱浓度才能使Nisin顺利洗脱，而有机溶剂会引起多肽链聚集，导致蛋白分子生物活性丧失并不可逆吸附。而本发明采用了表面键合苯基的硅胶基质，其疏水性相对C18柱较弱，因而在分离时Nisin几乎不吸附于色谱柱介质表面，可减少有机溶剂的使用，避免Nisin失活和溶剂残留，保证产品质量的同时有利于节约资源和成本，减少环境污染。并且，Nisin和色素等杂质组分在疏水层析作用中有较大的选择性差异，采用苯基键合硅胶色谱柱比C18柱分离的效果更好，提纯比活性和回收率也更高。

作为优选，本发明的检测器为UV检测器。

本发明还提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，采用上述的可再生色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，依次包括前处理、进样、收集、柱再生。

作为优选，本发明现对样品进行前处理，具体操作为：将用于分离的乳酸链球菌发酵液先调节pH值至2.0～4.0，再离心，弃去沉淀，得到上清液。

作为优选，本发明的乳酸链球菌发酵液进样的流速为250～330mL/min。

本发明采用苯基键合硅胶填料作为疏水层析的分离介质，基于乳酸链球菌发酵液中不同组分与疏水基团的作用力不同进行分离。先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，进样洗脱时，作用力弱的Nisin基本不保留，在高流速动力下直接穿出色谱柱，而发酵液中作用力强的蛋白类杂质、色素及异味物质则吸附于介质表面，在完成分离后通过再生液洗脱解离。本发明采用高流速进样，可使进样后Nisin快速穿出色谱柱，大大缩短分离工艺流程和制备周期，有利于实现工业化快速生产。但若进样流速较低，增加样品溶液在在色谱柱中的停留时间，可能增加Nisin在分离介质表面的吸附，减少其穿出量，降低活性回收率；而同时，进样流速不宜过高，当流速超过330mL/min时，色素和异味物质在色谱柱内停留时间较短，可能造成在分离介质上吸附不完全的问题，影响分离效果，得到的Nisin溶液中色素和异味去除不完全。

作为优选，本发明中分离样品的收集为：用pH值为2.0～4.0的平衡液进行洗脱。

进一步优选，本发明所述的平衡液为乙酸钠-乙酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、乳酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的至少一种。

作为优选，本发明中柱再生使用的再生液为pH值为2.0～4.0的50～70％乙醇。

作为优选，采用本发明的色谱系统和方法进行除杂，分离得到的Nisin溶液澄清透明，且无异味，活性回收率≥95％。

本发明相比于现有技术，具有如下有益效果：

(1)本发明采用一种高效疏水层析色谱系统，以苯基键合硅胶作为色谱柱介质，基于不同组分与疏水基团之间的不同作用力，先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，作用力弱的Nisin基本不保留优先穿出色谱柱，而作用力强的色素和异味成分吸附于介质表面，从而有效去除乳酸链球菌素中的色素和异味杂质；

(2)本发明采用高流速动力穿出的方法，使Nisin快速流出色谱柱，大大缩短分离工艺流程和制备周期，有利于实现工业化快速生产；

(3)本发明仅通过一次色谱分离，就能有效去除乳酸链球菌发酵液中的异味和色素，并且使乳酸链球菌素活性回收率达到95％，比活性比分离前提高约3-5倍，相比传统的工艺具有更高的分离效率和回收率；

(4)本发明在完成乳酸链球素与杂质的分离后，通过再生液进行色谱柱的再生，延长了色谱柱的使用寿命，可大幅降低生产成本，更适合工业化生产；

(5)本发明方法克服了传统工艺的缺点，提高了食品级乳酸链球菌素的口感和质量，可实现快速和高效的分离，且无有机溶剂的残留，绿色环保，扩大了Nisin的应用范围。

附图说明

图1为本发明实施例1中的色谱系统；

图2为本发明实施例2中样品分离前后的对比照片。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述说明。如果无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法均为本领域的常规方法。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于帮助理解本发明，不用于本发明的具体限制。

本发明提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法，所述色谱系统包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统，其中，色谱柱通过高压匀浆法填充苯基键合硅胶介质，进液系统包括进样管、进样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门，出液系统包括出样管、出样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门。本发明基于乳酸链球菌发酵液中不同组分和疏水基团之间不同的疏水作用力实现分离，先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，采用高流速动力使吸附作用力弱的Nisin快速流出色谱柱，而作用力强的杂质蛋白、色素和异味物质吸附于介质表面，通过再生液洗脱进行解离，从而有效去除乳酸链球菌素中的色素和异味，同时完成色谱柱的再生，延长色谱填料的使用寿命。

本发明色谱系统还可实现自动控制，自动完成进液、液体切换、分离样品的收集和色谱柱的再生等步骤。具体流程包括：

前处理：先将乳酸链球菌发酵液的pH值调节至2.0～4.0，再离心，弃去沉淀，取上清液备用；

进样：自动打开进液系统中的进样管阀门和出液系统中的平衡液管阀门，以250～330mL/min的流速进样；

收集：设定UV检测器波长为220nm，当检测器显示UV基线开始上升时，出液系统自动关闭平衡液阀门，同时出液系统中的出样阀门打开，从出样管中收集Nisin样品，进样结束后关闭进样管阀门，进液系统自动打开平衡液阀门，用平衡液进行洗脱，当UV吸收峰下降至基线时，关闭出样阀门，结束样品收集；

柱再生：系统自动开启色谱柱再生模式，进液系统打开再生液阀门，出液系统打开平衡液阀门，当UV基线开始上升时，出液系统关闭平衡液阀门，同时打开出液系统中的再生液阀门，设定再生液用量为4～6倍柱体积进行洗脱，结束后打开进液系统中的平衡液阀门，待再生液收集结束后关闭出液系统中的再生液阀门，打开出液系统的平衡液阀门，再设定4～6倍柱体积的平衡液进行清洗，完成色谱柱再生。

其中，所用的平衡液为浓度为30～60mmol/L、pH值为2.0～4.0的乙酸钠-乙酸缓冲液，再生液为pH值为2.0～4.0的50～70％乙醇。

上述乙酸钠-乙酸缓冲液还可以用柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、乳酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或其他同类缓冲液替换。上述再生液也可用相同pH值的其他溶剂替换，如不同浓度的甲醇、乙腈等。

本发明经分离去除色素和异味后得到的Nisin中，活性回收率≥95％，比活性比分离前提高约3-5倍。

上述乙酸钠-乙酸缓冲液还可以用柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、乳酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液或其他同类缓冲液替换；盐析所用钠盐也可用其他无机盐替换，如钾盐或、铵盐等。

本发明在硅胶表面键合苯基作为疏水层析介质，先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调节至酸性，Nisin在高流速动力作用下快速穿出色谱柱，实现Nisin和色素、异味杂质的高效分离，缩短制备周期，减少Nisin失活率，同时可用弱酸性的有机溶液进行柱再生，减少强酸或强碱的使用，既可延长色谱柱使用寿命，又有利于节约资源和成本，减少环境污染，更适于工业化生产。

实施例1

本实施例提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，如图1所示，包括进液系统1、高压输液泵、混合器(图中未示出)、过滤保护柱2、色谱柱3、检测器4、出液系统5，其中，进液系统1包括进样管11、进样阀门101、平衡液管12、平衡液阀门102、再生液管13和再生液阀门103，出液系统5包括出样管51、出样阀门501、平衡液管52、平衡液阀门502、再生液管53和再生液阀门503；色谱柱的介质采用苯基键合硅胶(粒径5μm，孔径120埃)，采用的色谱柱尺寸为：直径100mm×长1000mm。

本实施例所用色谱柱的介质填料为宁波博睿瀚达生物科技有限公司自行生产。

实施例2

本实施例提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，采用实施例1的色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，具体包括如下步骤：

前处理：先将乳酸链球菌发酵液的pH值调节至3.5，再离心，弃去沉淀，取上清液备用；

进样：自动打开进液系统中的进样管阀门和出液系统中的平衡液管阀门，以300mL/min的流速进样；

收集：设定UV检测器波长为220nm，当检测器显示UV基线开始上升时，出液系统自动关闭平衡液阀门，同时出液系统中的出样阀门打开，从出样管中收集Nisin样品，进样结束后关闭进样管阀门，进液系统自动打开平衡液阀门，用浓度为50mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液进行洗脱，当UV吸收峰下降至基线时，关闭出样阀门，结束样品收集；

柱再生：系统自动开启色谱柱再生模式，进液系统打开再生液阀门，出液系统打开平衡液阀门，当UV基线开始上升时，出液系统关闭平衡液阀门，同时打开出液系统中的再生液阀门，设定再生液用量为5倍柱体积进行洗脱，再生液为pH值为3.6的60％乙醇，结束后打开进液系统中的平衡液阀门，待再生液收集结束后关闭出液系统中的再生液阀门，打开出液系统的平衡液阀门，再设定5倍柱体积的平衡液进行清洗，完成色谱柱再生。

图2为样品分离前后的对比图，其中，从左至右依次为进样前乳酸链球菌发酵液、出样管收集的Nisin溶液和再生液管收集的柱再生液。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法对乳酸链球菌素发酵液、分离收集得到的Nisin溶液进行生物活性测定，结果如表1所示。

表1实施例2中样品的生物活性测定结果

实施例3

本实施例提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，采用实施例1的色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，具体包括如下步骤：

前处理：先将乳酸链球菌发酵液的pH值调节至3.5，再离心，弃去沉淀，取上清液备用；

进样：自动打开进液系统中的进样管阀门和出液系统中的平衡液管阀门，以200mL/min的流速进样；

收集：设定UV检测器波长为220nm，当检测器显示UV基线开始上升时，出液系统自动关闭平衡液阀门，同时出液系统中的出样阀门打开，从出样管中收集Nisin样品，进样结束后关闭进样管阀门，进液系统自动打开平衡液阀门，用浓度为50mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液进行洗脱，当UV吸收峰下降至基线时，关闭出样阀门，结束样品收集；

柱再生：系统自动开启色谱柱再生模式，进液系统打开再生液阀门，出液系统打开平衡液阀门，当UV基线开始上升时，出液系统关闭平衡液阀门，同时打开出液系统中的再生液阀门，设定再生液用量为5倍柱体积进行洗脱，再生液为pH值为3.6的60％乙醇，结束后打开进液系统中的平衡液阀门，待再生液收集结束后关闭出液系统中的再生液阀门，打开出液系统的平衡液阀门，再设定5倍柱体积的平衡液进行清洗，完成色谱柱再生。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法进行检测，对乳酸链球菌素发酵液、分离收集得到的Nisin溶液进行生物活性测定，结果如表2所示。

表2实施例3中样品的生物活性测定结果

实施例4

本实施例提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，采用实施例1的色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，具体包括如下步骤：

前处理：取乳酸链球菌发酵液直接离心，弃去沉淀，取上清液备用；

进样：自动打开进液系统中的进样管阀门和出液系统中的平衡液管阀门，以300mL/min的流速进样；

收集：设定UV检测器波长为220nm，当检测器显示UV基线开始上升时，出液系统自动关闭平衡液阀门，同时出液系统中的出样阀门打开，从出样管中收集Nisin样品，进样结束后关闭进样管阀门，进液系统自动打开平衡液阀门，用浓度为50mmol/L、pH值为3.6的乙酸钠-乙酸缓冲液进行洗脱，当UV吸收峰下降至基线时，关闭出样阀门，结束样品收集；

柱再生：系统自动开启色谱柱再生模式，进液系统打开再生液阀门，出液系统打开平衡液阀门，当UV基线开始上升时，出液系统关闭平衡液阀门，同时打开出液系统中的再生液阀门，设定再生液用量为5倍柱体积进行洗脱，再生液为pH值为3.6的60％乙醇，结束后打开进液系统中的平衡液阀门，待再生液收集结束后关闭出液系统中的再生液阀门，打开出液系统的平衡液阀门，再设定5倍柱体积的平衡液进行清洗，完成色谱柱再生。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法进行检测，对乳酸链球菌素发酵液、分离收集得到的Nisin溶液进行生物活性测定，结果如表3所示。

表3实施例4中样品的生物活性测定结果

对比例1

本对比例提供一种采用泡沫吸附分离去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，具体包括如下步骤：

前处理：先将乳酸链球菌发酵液的pH值调节至3.5，再离心，弃去沉淀，取上清液备用；

泡沫分离：将上清液送入泡沫分离塔，控制温度为25℃，pH值约为3.5，向泡沫分离塔内通入压缩空气和二氧化碳气体，通气速度为0.01m/s，通气时间为2小时；

收集：收集泡沫并进行泡处理，即得到Nisin溶液。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法进行检测，对乳酸链球菌素发酵液、分离收集得到的Nisin溶液进行生物活性测定，结果如表4所示。

表4对比例1中样品的生物活性测定结果

对比例2

本对比例提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其与实施例2的区别仅在于所用色谱柱的介质为自行生产的十八烷基键合硅胶填料(粒径5μm，孔径120埃)，其他操作方法与条件均与实施例2相同。

分别按照QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素琼脂糖扩散法进行检测，对乳酸链球菌素发酵液、分离收集得到的Nisin溶液进行生物活性测定，结果如表5所示。

表5对比例2中样品的生物活性测定结果

通过以上试验发现，实施例3降低进样流速时，会延长乳酸链球菌素在色谱柱中的停留时间，对Nisin的穿出产生影响，使活性回收率略有降低。对比例1采用泡沫吸附分离得到的Nisin溶液活性损失明显，活性回收率也显著降低；而对比例2以C18柱作为分离介质，其与乳酸链球菌素的吸附能力强于苯基键合硅胶，因而使得部分Nisin被保留在色谱中，穿出不完全，从而降低其活性回收率。

以上实施例对本发明要求保护的技术方案参数范围内点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换形成的新的技术方案，同样都在本发明要求的保护范围内，并且本发明方案所有涉及的参数间如无特别说明，则相互之间不存在不可替换的唯一组合。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，并不用于限定本发明的保护范围。本发明所属技术领域的技术人员可以采用等同替换或等效变换的方式获得与本发明相似或相近的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统，其特征在于，色谱柱采用苯基键合硅胶介质。

2.根据权利要求1所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，其特征在于，进液系统包括进样管、进样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门，出液系统包括出样管、出样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门。

3.一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的可再生色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，依次包括前处理、进样、收集、柱再生。

4.一种如权利要求3所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，前处理为将用于分离的乳酸链球菌发酵液先调节pH值至2.0～4.0，再离心，弃去沉淀，得到上清液。

5.一种如权利要求3所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，进样的流速为250～330mL/min。

6.一种如权利要求3所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，收集过程中采用pH值为2.0～4.0的平衡液进行洗脱。

7.一种如权利要求3所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，柱再生使用的再生液为pH值为2.0～4.0的50～70％乙醇。

8.一种如权利要求3所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，Nisin分离后的活性回收率≥95％。

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