CN1876674A - 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸链球菌素工业化纯化工艺,建立了简单快速的方法从含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清中纯化乳酸链球菌素。该方法包括离子交换和反向高效液相色谱层析,处理45升样品只需2个工作日,总回收率为50%以上,HPLC结果显示纯度在98%以上。得率提高了10倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然防腐剂纯化工艺,具体的说涉及乳酸链球菌素工业化纯化工艺。
背景技术
乳酸链球菌素又称乳球菌肽或乳链菌肽,英文名为Nisin,是N型血清的某些乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小肽。Nisin能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖,如葡萄球菌属、链球菌属、梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌,特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。另外,Nisin还可以和某些络合剂(如EDTA或柠檬酸)等一起作用,可是只有部分革兰氏阴性菌对之敏感。Nisin的在食品防腐和化妆品中都有应用,但其纯度较低。如果要进一步药用就必须解决其纯度的问题。
J.Meghrous等研究了Nisin的纯化工艺,文章发表于Journal of AppliedMicrobiology 1997,83,133-138,但是他的纯化工艺步骤多,总共需要4步纯化,而且纯化得率太低,纯化总得率仅为3-6%。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种乳酸链球菌素纯化工艺,以克服现有技术存在的纯化得率低的缺陷,满足有关下游产品开发的需要。
本发明的方法包括如下步骤:
(1)上样:将用预冷的无菌水稀释至电导为3~4ms/cm、pH为3.5~4.5的样品以每小时200~400厘米的流速通过预先用缓冲液平衡好层析柱;
所说的样品为含乳酸链球菌素(nisin)的乳酸链球菌培养上清;
所说的层析柱采用的介质是颗粒大小为100~300μm的强阳离子琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产,商品名为SP Sepharose BigBead);
(2)清洗:用10~50mmol/L pH为3.5~4.5的醋酸缓冲液,以每小时80~200厘米的流速清洗层析柱,通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线;
(3)洗脱:用含0.5~1mol/L氯化钠的10~15mmol/L pH为3.5~4.5的醋酸缓冲液,以每小时8~20厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
上述步骤亦称为离子交换层析,其中:缓冲液平衡层析柱包括如下步骤:用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液平衡装有适量体积的SP Sepharose BigBead介质的层析柱,以每小时80~200厘米的流速平衡5~10个柱体积,通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
上述步骤的活性多肽回收率为75%~85%;纯化后样品的纯度可以达到68.83%,多肽纯化倍数为14以上,此方法的优点是:处理速度快、处理量大、凝胶载样量大、浓缩效果好、回收率高及重复性好等,含一定量的色素。因此按照本发明优选的方案,还包括如下的反向高效液相色谱的纯化步骤:
(1)样品预处理:在上述的层析洗脱液中加入等体积的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液,使得稀释后的样品可以直接上样;
所说的层析洗脱液为离子交换层析过程中洗脱并收集到的洗脱峰所得到的液体。
(2)上样:以每小时20~60厘米的流速将预处理后的洗脱液通过预先用0.1%TFA平衡好的高效液相色谱柱;
所说的高效液相色谱柱采用的介质是颗粒大小为10μm,孔径为100A的C18硅胶填料(富士公司提供);
(3)清洗:用含有浓度为0.1%TFA的水溶液,以每小时20~60厘米的流速清洗层析柱,通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线;
(4)洗脱:用含有浓度为50%乙腈的0.1%TFA的水溶液,以每小时20~60厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来,并收集洗脱峰。
离子交换层析洗脱液通过反向高效液相色谱层析,可以很好的去除色素和其他多肽,产品纯度达到98%以上。
反向高效液相色谱层析的多肽回收率为65%~75%,多肽纯化倍数为3以上;
本发明建立了简单快速的方法从含nisin的乳酸链球菌培养上清中纯化nisin。该方法包括离子交换和反向高效液相色谱层析,处理45升样品只需2个工作日,总回收率为50%以上,HPLC结果显示纯度在98%以上。比所公开的现有技术得率提高了10倍以上。
附图说明
图1为10毫升阳离子交换柱SP Sepharose BigBead层析图谱。
图2为SP Sepharose BigBead阳离子交换层析后产品的纯度分析结果。
图3为C18,100A,10um填料的HPLC层析图谱。
图4HPLC纯化后产品的纯度分析结果。
具体实施方式
实施例1
离子交换层析:
装有10ml颗粒大小为100~300μm的强阳离子琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产,商品名为SP Sepharose BigBead介质的层析柱,层析柱直径为2.5厘米。
样品:含nisin的乳酸杆菌培养上清100毫升;含85300单位nisin。
层析设备:安玛西亚生物技术有限公司生产的AKTA explorer 100;
平衡、清洗缓冲液:15mmol/L pH 4.5的醋酸缓冲液;
洗脱缓冲液:含1mol/L NaCl的15mmol/L pH 4.5的醋酸缓冲液。
平衡:用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液平衡装有10毫升体积的SPSepharose BigBead介质的层析柱,以每小时120厘米的流速平衡8个柱体积,通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线;
样品预处理:将100毫升样品(含nisin的乳酸链球菌培养上清)用预冷的无菌水稀释至电导为3.5ms/cm,并用磷酸调节pH至4.5。
上样:以每小时300厘米的流速使样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
清洗:上样完,用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液,以每小时150厘米的流速清洗层析柱,通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。
洗脱:清洗至基线后,用含1mol/L氯化钠的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液,以每小时15厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来,并收集洗脱峰10毫升。试验结果如表1和图1 SP Sepharose BigBead纯化nisin结果。图1中1为280nm波长下的吸收曲线,2为254nm波长下的吸收曲线,3为215nm波长下的吸收曲线,4为洗脱梯度曲线。1,2,3都反映了洗脱液中不同吸收波长的产品的含量的高低。4反映了不同时间内流过层析柱的洗脱液和平衡缓冲液的比例。
表1SP Sepharose BigBead纯化nisin结果
各组分nisin活性 | 回收率% | ||
样品上样液200毫升 | 流穿液 | 洗脱峰10毫升 | 82.5 |
85300U | 14927.5U | 70372.5U |
离子交换层析处理速度快、浓缩效果好,层析规模很容易放大,多肽活性回收率好;多肽纯化倍数为14以上;多肽纯度达到68.83%;但含一定量的色素。
经过SP Sepharose BigBead离子交换纯化后样品的纯度可以达到68.83%,结果如图2(经过SP Sepharose BigBead阳离子交换层析后产品的纯度结果)及表2(对图2的分析结果)。
表2对图2的分析结果的说明
保留时间 | 峰面积 | 峰面积% | 峰高 | 峰高% |
23.13324.60025.43325.983 | 3593201973232199443334955 | 12.5368.836.9611.68 | 8947803311009416467 | 7.7269.358.7114.22 |
总计 | 2866950 | 100.00 | 115839 | 100.00 |
分析结果表明,含有nisin的乳酸链球菌发酵液经过SP SepharoseBigBead阳离子交换层析后,纯度可以达到68.83%(峰面积的百分比)。
实施例2
反向HPLC纯化
所说的高效液相色谱柱采用的介质是颗粒大小为10μm,孔径为100A的C18硅胶填料(富士公司提供),层析柱直径为2.5厘米。
样品:在上述的层析洗脱液中加入等体积的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液,含nisin 70372.5U;
层析设备:Varian公司生产的SD-1;
平衡、清洗缓冲液:0.1%TFA水溶液;
洗脱缓冲液:含50%乙腈的0.1%TFA水溶液。
洗脱:清洗至基线后,用含50%乙腈的0.1%TFA水溶液,以每小时250厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来,并收集洗脱峰。离子交换层析洗脱液通过反向高效液相色谱层析,可以很好的去除色素和其他多肽,产品纯度达到98%以上,多肽回收率为65%~75%,多肽纯化倍数为3以上。试验结果如表2和图3经过阳离子交换层析后的样品经过反向HPLC纯化结果。
表3经过阳离子交换层析后的样品经过反向HPLC纯化结果
各组分nisin活性 | 回收率% | ||
样品上样液200毫升 | 流穿液 | 洗脱峰10毫升 | 70.3 |
70372U | 20900 | 49472 |
离子交换层析洗脱液通过反向高效液相色谱层析,可以很好的去除色素和其他多肽,产品纯度达到98%(峰面积的百分比)以上,如图4(nisin经过反向HPLC层析后纯度结果)及表4(对图4的分析结果)。
表4对图4的分析结果
保留时间 | 峰面积 | 峰面积% | 峰高 | 峰高% |
24.06726.033 | 26808162527813 | 98.071.93 | 96935432773 | 96.733.27 |
总计 | 27335975 | 100.00 | 1002127 | 100.00 |
Claims (7)
1、一种乳酸链球菌素工业化纯化工艺,其特征在于,包括如下离子交换层析步骤:
(1)上样:将电导为3~4ms/cm、pH为3.5~4.5的样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱;
所说的样品为含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清;
所说的层析柱采用的介质是颗粒大小为100~300μm的强阳离子琼脂糖凝胶;
(2).清洗:用10-50mmol/L pH为3.5~4.5的醋酸缓冲液清洗层析柱;
(3)洗脱:用含0.5~1mol/L氯化钠的10~15mmol/L pH为3.5~4.5的醋酸缓冲液,以每小时8~20厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
2、根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,缓冲液平衡层析柱包括如下步骤:用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液平衡装有适量体积的SP SepharoseBigBead介质的层析柱,以每小时80~200厘米的流速平衡5~10个柱体积,通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
3、根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,将电导为3~4ms/cm、pH为3.5~4.5的样品以每小时200~400厘米的流速通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
4、根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,步骤(2)中,用醋酸缓冲液,以每小时80~200厘米的流速清洗层析柱。
5、根据权利要求1所述的纯化工艺,其特征在于,步骤(3)中,用醋酸缓冲液,以每小时8~20厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
6、根据权利要求1~5任一所述的纯化工艺,其特征在于,还包括如下的反向高效液相色谱的纯化步骤:
(1)样品预处理:在层析洗脱液中加入等体积的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液,使得稀释后的样品可以直接上样;
所说的层析洗脱液为离子交换层析过程中洗脱并收集到的洗脱峰所得到的液体;
(2)上样:将预处理后的洗脱液通过预先用0.1%TFA平衡好的高效液相色谱柱;
所说的高效液相色谱柱采用的介质是颗粒大小为10μm,孔径为100A的C18硅胶填料;
(3)清洗:用含有浓度为0.1%TFA的水溶液,以每小时20~60厘米的流速清洗层析柱;
(4)洗脱:用含有浓度为50%乙腈的0.1%TFA的水溶液,以每小时20~60厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来,并收集洗脱峰。
7、根据权利要求6所述的纯化工艺,其特征在于,步骤(2)中洗脱液通过的流速为每小时20~60厘米。
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