CN1876674A - 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺 - Google Patents

一种天然防腐剂的工业化纯化工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN1876674A
CN1876674A CN 200510026513 CN200510026513A CN1876674A CN 1876674 A CN1876674 A CN 1876674A CN 200510026513 CN200510026513 CN 200510026513 CN 200510026513 A CN200510026513 A CN 200510026513A CN 1876674 A CN1876674 A CN 1876674A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chromatography
chromatography column
sample
flow velocity
per hour
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 200510026513
Other languages
English (en)
Other versions
CN100554276C (zh
Inventor
黄青山
李国栋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Gaoke Bio-engineering Co., Ltd.
Original Assignee
SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd filed Critical SHANGHAI GAOKE UNION BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Priority to CNB2005100265130A priority Critical patent/CN100554276C/zh
Publication of CN1876674A publication Critical patent/CN1876674A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100554276C publication Critical patent/CN100554276C/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种乳酸链球菌素工业化纯化工艺，建立了简单快速的方法从含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清中纯化乳酸链球菌素。该方法包括离子交换和反向高效液相色谱层析，处理45升样品只需2个工作日，总回收率为50％以上，HPLC结果显示纯度在98％以上。得率提高了10倍以上。

Description

一种天然防腐剂的工业化纯化工艺
技术领域
本发明涉及一种天然防腐剂纯化工艺，具体的说涉及乳酸链球菌素工业化纯化工艺。
背景技术
乳酸链球菌素又称乳球菌肽或乳链菌肽，英文名为Nisin，是N型血清的某些乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小肽。Nisin能抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。另外，Nisin还可以和某些络合剂(如EDTA或柠檬酸)等一起作用，可是只有部分革兰氏阴性菌对之敏感。Nisin的在食品防腐和化妆品中都有应用，但其纯度较低。如果要进一步药用就必须解决其纯度的问题。
J.Meghrous等研究了Nisin的纯化工艺，文章发表于Journal of AppliedMicrobiology 1997，83，133-138，但是他的纯化工艺步骤多，总共需要4步纯化，而且纯化得率太低，纯化总得率仅为3-6％。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种乳酸链球菌素纯化工艺，以克服现有技术存在的纯化得率低的缺陷，满足有关下游产品开发的需要。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)上样：将用预冷的无菌水稀释至电导为3～4ms/cm、pH为3.5～4.5的样品以每小时200～400厘米的流速通过预先用缓冲液平衡好层析柱；
所说的样品为含乳酸链球菌素(nisin)的乳酸链球菌培养上清；
所说的层析柱采用的介质是颗粒大小为100～300μm的强阳离子琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产，商品名为SP Sepharose BigBead)；
(2)清洗：用10～50mmol/L pH为3.5～4.5的醋酸缓冲液，以每小时80～200厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线；
(3)洗脱：用含0.5～1mol/L氯化钠的10～15mmol/L pH为3.5～4.5的醋酸缓冲液，以每小时8～20厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
上述步骤亦称为离子交换层析，其中：缓冲液平衡层析柱包括如下步骤：用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液平衡装有适量体积的SP Sepharose BigBead介质的层析柱，以每小时80～200厘米的流速平衡5～10个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
上述步骤的活性多肽回收率为75％～85％；纯化后样品的纯度可以达到68.83％，多肽纯化倍数为14以上，此方法的优点是：处理速度快、处理量大、凝胶载样量大、浓缩效果好、回收率高及重复性好等，含一定量的色素。因此按照本发明优选的方案，还包括如下的反向高效液相色谱的纯化步骤：
(1)样品预处理：在上述的层析洗脱液中加入等体积的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液，使得稀释后的样品可以直接上样；
所说的层析洗脱液为离子交换层析过程中洗脱并收集到的洗脱峰所得到的液体。
(2)上样：以每小时20～60厘米的流速将预处理后的洗脱液通过预先用0.1％TFA平衡好的高效液相色谱柱；
所说的高效液相色谱柱采用的介质是颗粒大小为10μm，孔径为100A的C18硅胶填料(富士公司提供)；
(3)清洗：用含有浓度为0.1％TFA的水溶液，以每小时20～60厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线；
(4)洗脱：用含有浓度为50％乙腈的0.1％TFA的水溶液，以每小时20～60厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰。
离子交换层析洗脱液通过反向高效液相色谱层析，可以很好的去除色素和其他多肽，产品纯度达到98％以上。
反向高效液相色谱层析的多肽回收率为65％～75％，多肽纯化倍数为3以上；
本发明建立了简单快速的方法从含nisin的乳酸链球菌培养上清中纯化nisin。该方法包括离子交换和反向高效液相色谱层析，处理45升样品只需2个工作日，总回收率为50％以上，HPLC结果显示纯度在98％以上。比所公开的现有技术得率提高了10倍以上。
附图说明
图1为10毫升阳离子交换柱SP Sepharose BigBead层析图谱。
图2为SP Sepharose BigBead阳离子交换层析后产品的纯度分析结果。
图3为C18，100A，10um填料的HPLC层析图谱。
图4HPLC纯化后产品的纯度分析结果。
具体实施方式
                        实施例1
离子交换层析：
装有10ml颗粒大小为100～300μm的强阳离子琼脂糖凝胶(由安玛西亚生物技术有限公司生产，商品名为SP Sepharose BigBead介质的层析柱，层析柱直径为2.5厘米。
样品：含nisin的乳酸杆菌培养上清100毫升；含85300单位nisin。
层析设备：安玛西亚生物技术有限公司生产的AKTA explorer 100；
平衡、清洗缓冲液：15mmol/L pH 4.5的醋酸缓冲液；
洗脱缓冲液：含1mol/L NaCl的15mmol/L pH 4.5的醋酸缓冲液。
平衡：用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液平衡装有10毫升体积的SPSepharose BigBead介质的层析柱，以每小时120厘米的流速平衡8个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线；
样品预处理：将100毫升样品(含nisin的乳酸链球菌培养上清)用预冷的无菌水稀释至电导为3.5ms/cm，并用磷酸调节pH至4.5。
上样：以每小时300厘米的流速使样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
清洗：上样完，用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液，以每小时150厘米的流速清洗层析柱，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。
洗脱：清洗至基线后，用含1mol/L氯化钠的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液，以每小时15厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰10毫升。试验结果如表1和图1 SP Sepharose BigBead纯化nisin结果。图1中1为280nm波长下的吸收曲线，2为254nm波长下的吸收曲线，3为215nm波长下的吸收曲线，4为洗脱梯度曲线。1，2，3都反映了洗脱液中不同吸收波长的产品的含量的高低。4反映了不同时间内流过层析柱的洗脱液和平衡缓冲液的比例。
             表1SP Sepharose BigBead纯化nisin结果
                各组分nisin活性   回收率％
  样品上样液200毫升   流穿液   洗脱峰10毫升   82.5
  85300U   14927.5U   70372.5U
离子交换层析处理速度快、浓缩效果好，层析规模很容易放大，多肽活性回收率好；多肽纯化倍数为14以上；多肽纯度达到68.83％；但含一定量的色素。
经过SP Sepharose BigBead离子交换纯化后样品的纯度可以达到68.83％，结果如图2(经过SP Sepharose BigBead阳离子交换层析后产品的纯度结果)及表2(对图2的分析结果)。
                   表2对图2的分析结果的说明
  保留时间   峰面积   峰面积％   峰高   峰高％
  23.13324.60025.43325.983   3593201973232199443334955   12.5368.836.9611.68   8947803311009416467   7.7269.358.7114.22
总计 2866950 100.00 115839 100.00
分析结果表明，含有nisin的乳酸链球菌发酵液经过SP SepharoseBigBead阳离子交换层析后，纯度可以达到68.83％(峰面积的百分比)。
                    实施例2
反向HPLC纯化
所说的高效液相色谱柱采用的介质是颗粒大小为10μm，孔径为100A的C18硅胶填料(富士公司提供)，层析柱直径为2.5厘米。
样品：在上述的层析洗脱液中加入等体积的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液，含nisin 70372.5U；
层析设备：Varian公司生产的SD-1；
平衡、清洗缓冲液：0.1％TFA水溶液；
洗脱缓冲液：含50％乙腈的0.1％TFA水溶液。
洗脱：清洗至基线后，用含50％乙腈的0.1％TFA水溶液，以每小时250厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰。离子交换层析洗脱液通过反向高效液相色谱层析，可以很好的去除色素和其他多肽，产品纯度达到98％以上，多肽回收率为65％～75％，多肽纯化倍数为3以上。试验结果如表2和图3经过阳离子交换层析后的样品经过反向HPLC纯化结果。
       表3经过阳离子交换层析后的样品经过反向HPLC纯化结果
  各组分nisin活性   回收率％
  样品上样液200毫升   流穿液   洗脱峰10毫升   70.3
  70372U   20900   49472
离子交换层析洗脱液通过反向高效液相色谱层析，可以很好的去除色素和其他多肽，产品纯度达到98％(峰面积的百分比)以上，如图4(nisin经过反向HPLC层析后纯度结果)及表4(对图4的分析结果)。
                        表4对图4的分析结果
  保留时间   峰面积   峰面积％   峰高   峰高％
  24.06726.033   26808162527813   98.071.93   96935432773   96.733.27
总计 27335975 100.00 1002127 100.00

Claims (7)

1、一种乳酸链球菌素工业化纯化工艺，其特征在于，包括如下离子交换层析步骤：
(1)上样：将电导为3～4ms/cm、pH为3.5～4.5的样品通过预先用缓冲液平衡好层析柱；
所说的样品为含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清；
所说的层析柱采用的介质是颗粒大小为100～300μm的强阳离子琼脂糖凝胶；
(2).清洗：用10-50mmol/L pH为3.5～4.5的醋酸缓冲液清洗层析柱；
(3)洗脱：用含0.5～1mol/L氯化钠的10～15mmol/L pH为3.5～4.5的醋酸缓冲液，以每小时8～20厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
2、根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，缓冲液平衡层析柱包括如下步骤：用15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液平衡装有适量体积的SP SepharoseBigBead介质的层析柱，以每小时80～200厘米的流速平衡5～10个柱体积，通过紫外检测保证层析柱已平衡至基线。
3、根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，将电导为3～4ms/cm、pH为3.5～4.5的样品以每小时200～400厘米的流速通过预先用缓冲液平衡好层析柱。
4、根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(2)中，用醋酸缓冲液，以每小时80～200厘米的流速清洗层析柱。
5、根据权利要求1所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(3)中，用醋酸缓冲液，以每小时8～20厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱并收集洗脱峰。
6、根据权利要求1～5任一所述的纯化工艺，其特征在于，还包括如下的反向高效液相色谱的纯化步骤：
(1)样品预处理：在层析洗脱液中加入等体积的15mmol/L pH为4.5的醋酸缓冲液，使得稀释后的样品可以直接上样；
所说的层析洗脱液为离子交换层析过程中洗脱并收集到的洗脱峰所得到的液体；
(2)上样：将预处理后的洗脱液通过预先用0.1％TFA平衡好的高效液相色谱柱；
所说的高效液相色谱柱采用的介质是颗粒大小为10μm，孔径为100A的C18硅胶填料；
(3)清洗：用含有浓度为0.1％TFA的水溶液，以每小时20～60厘米的流速清洗层析柱；
(4)洗脱：用含有浓度为50％乙腈的0.1％TFA的水溶液，以每小时20～60厘米的流速将多肽从层析柱上洗脱下来，并收集洗脱峰。
7、根据权利要求6所述的纯化工艺，其特征在于，步骤(2)中洗脱液通过的流速为每小时20～60厘米。
CNB2005100265130A 2005-06-07 2005-06-07 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺 Active CN100554276C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005100265130A CN100554276C (zh) 2005-06-07 2005-06-07 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005100265130A CN100554276C (zh) 2005-06-07 2005-06-07 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1876674A true CN1876674A (zh) 2006-12-13
CN100554276C CN100554276C (zh) 2009-10-28

Family

ID=37509254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005100265130A Active CN100554276C (zh) 2005-06-07 2005-06-07 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN100554276C (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701034B (zh) * 2009-09-22 2012-06-06 浙江银象生物工程有限公司 一种高纯度乳酸链球菌素的制备方法
CN104095777A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海珍馨化工科技有限公司 一种三色菫营养面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104095778A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海珍馨化工科技有限公司 一种白芨营养面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104095779A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海珍馨化工科技有限公司 一种人参营养面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116657A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 上海珍馨化工科技有限公司 一种茯苓面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116700A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 上海珍馨化工科技有限公司 一种灵芝面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116654A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 上海珍馨化工科技有限公司 一种紫草面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN107056903A (zh) * 2017-07-04 2017-08-18 安泰生物工程股份有限公司 一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取医药级超高纯度乳酸链球菌素的方法
CN109295036A (zh) * 2017-07-25 2019-02-01 上海复华兴生物技术有限公司 一种重组人溶菌酶工业化纯化工艺
CN112876547A (zh) * 2021-01-20 2021-06-01 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法
CN112957771A (zh) * 2021-01-20 2021-06-15 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110054669B (zh) * 2019-01-25 2021-08-24 浙江工业大学 一种不含氯离子Nisin盐及其制备与应用

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101701034B (zh) * 2009-09-22 2012-06-06 浙江银象生物工程有限公司 一种高纯度乳酸链球菌素的制备方法
CN104095777A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海珍馨化工科技有限公司 一种三色菫营养面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104095778A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海珍馨化工科技有限公司 一种白芨营养面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104095779A (zh) * 2013-04-03 2014-10-15 上海珍馨化工科技有限公司 一种人参营养面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116654A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 上海珍馨化工科技有限公司 一种紫草面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116700A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 上海珍馨化工科技有限公司 一种灵芝面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116657A (zh) * 2013-04-26 2014-10-29 上海珍馨化工科技有限公司 一种茯苓面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116700B (zh) * 2013-04-26 2016-10-05 广州今盛美精细化工有限公司 一种灵芝面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN104116654B (zh) * 2013-04-26 2016-11-23 上海珍馨化工科技有限公司 一种紫草面贴膜用乳液、面贴膜及其制备方法
CN107056903A (zh) * 2017-07-04 2017-08-18 安泰生物工程股份有限公司 一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取医药级超高纯度乳酸链球菌素的方法
CN107056903B (zh) * 2017-07-04 2021-02-05 安泰生物工程股份有限公司 一种利用琼脂糖凝胶亲和层析色谱提取医药级超高纯度乳酸链球菌素的方法
CN109295036A (zh) * 2017-07-25 2019-02-01 上海复华兴生物技术有限公司 一种重组人溶菌酶工业化纯化工艺
CN112876547A (zh) * 2021-01-20 2021-06-01 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种制备型高效液相色谱纯化乳酸链球菌素的方法
CN112957771A (zh) * 2021-01-20 2021-06-15 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN100554276C (zh) 2009-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1876674A (zh) 一种天然防腐剂的工业化纯化工艺
Wicks et al. Carbohydrate signatures of aquatic macrophytes and their dissolved degradation products as determined by a sensitive high-performance ion chromatography method
US11717586B2 (en) Compositions and methods for reducing bioburden in chromatography
CN101302504B (zh) 一种抗体亲和层析纯化溶葡萄球菌酶的方法
Guner et al. A novel, fast-growing Borrelia sp. isolated from the hard tick Hyalomma aegyptium in Turkey
Bowler et al. An integrated approach to methicillin-resistant Staphylococcus aureus control in a rural, regional-referral healthcare setting
CN105838614B (zh) 一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法
CN1178693C (zh) 一种蚯蚓抗菌肽的制取方法
CN101270344B (zh) 防治油菜菌核病的枯草芽胞杆菌及抗菌物质分离
Gurbuz et al. Microcystin removal by a naturally-occurring substance: pumice
Chu et al. Studies on degradation of imazalil enantiomers in soil using capillary electrophoresis
CN100485031C (zh) 一种溶葡萄球菌酶工业化纯化工艺
CN1170836C (zh) 一种制备高纯度阿卡波糖的方法
Lee et al. Enterococcus raffinosus bacteremia: clinical experience with 49 adult patients
Ismaeel et al. Hydrophobic properties of Providencia stuartii and other Gram‐negative bacteria measured by hydrophobic interaction chromatography
CN1634952A (zh) 药用含锌配合物及其制备方法
Benincasa et al. High-performance liquid chromatography of cyclic β (1→ 2)-D-glucans (cyclosophoraoses) produced by Rhizobium meliloti and Rhizobium trifolii
CN1796551A (zh) 一种新型亲和载体的制备方法
Eid Virulence Factors Assessment for Some Xanthomonas campestris Strains Causing Black Rot in Cabbage
CN110054669B (zh) 一种不含氯离子Nisin盐及其制备与应用
CN101352673A (zh) 一种用于分离溶菌酶的亲和层析介质及其制备方法
CN101067131A (zh) 一种利用亲和层析法分离纯化纤溶酶的方法
CN1876810A (zh) 一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法
Yu et al. Research progress of biofouling extracellular polymeric substances in cooling water system
Araki et al. Decomposition of dextran sulfate sodium under alkaline, acidic, high temperature and high pressure conditions

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20181106

Address after: 201206 Pudong New Area 4-5, B, 501 Jin Gang Road, Pudong New Area, Shanghai.

Patentee after: Shanghai Gaoke Bio-engineering Co., Ltd.

Address before: 201206, No. 3, block B, 501 Jingang Road, Shanghai, Pudong

Patentee before: Shanghai Gaoke Union Biotechnology Development Co., Ltd.