CN105838614B - 一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，特别是一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法。其步骤为A.孢子悬浮液的制备，B.无机盐培养基的优化，C.降解玉米赤霉烯酮。使用该方法培养的纯培养物可用于降解各种饲料中污染的真菌毒素玉米赤霉烯酮，其降解率达到99%，并且制备及应用方法简单，操作方便。为动物饲料除去霉菌毒素（玉米赤霉烯酮）提供了有效方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮（zearalenone）又称为F-2毒素，是由Stob等人在1962年首次从污染了禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的发霉玉米中分离得到的真菌毒素（mycotoxin）。玉米赤霉烯酮是主要由镰刀菌属的真菌如禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌（Fusarium roseum）、串珠镰刀菌（Fusarium maniliborme）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）等合成、分泌的次级代谢产物，是一种具有强烈致畸作用的生殖系统毒素，会导致家畜繁殖障碍、流产死胎、免疫抑制、生长速度下降等严重后果，给畜牧业带来巨大的危害。由于镰刀菌属的真菌生态适应性强，既能寄生生活又能腐生生活，因此，从田间作物到饲料都存在着因镰刀菌的侵染而发展到污染玉米赤霉烯酮的可能性。同时，不仅玉米，小麦、燕麦、大米、大麦、荞麦、高粱等作物也都易受玉米赤霉烯酮的污染，使得玉米赤霉烯酮在饲料和饲料原料中的危害作用影响特别深远。包括美国、澳大利亚在内的多国研究都表明受玉米赤霉烯酮污染的作物及饲料抽检阳性率高于60%，而在我国，受玉米赤霉烯酮污染的作物及饲料抽检阳性率高达80%以上，且在小麦、大麦、玉米等多种谷物样品中检测到，已经成为危害粮食及畜牧业生产和发展的重大污染源。解决玉米赤霉烯酮污染对农业可持续发展和人类及牲畜健康具有重要意义。
鉴于玉米赤霉烯酮所带来的严重危害性，目前已发展出不少针对玉米赤霉烯酮进行脱毒的技术手段。玉米赤霉烯酮去除方法从原理上可分为脱毒（decontamination）和解毒（detoxification）两种，按方法可大致分为化学方法、物理方法和生物学方法。玉米赤霉烯酮脱毒是指去除或中和被污染饲料中玉米赤霉烯酮的方法，玉米赤霉烯酮解毒是指去除玉米赤霉烯酮毒性的方法。化学去除方法是通过酸碱溶液或其他化合物对玉米赤霉烯酮进行处理，物理去除方法包括机械分类处理、高温失活、放射处理或提取被污染物和吸附剂等，生物学解毒方法主要是利用微生物来降解毒素。然而，化学去除方法会改变饲料性状，而且成本较高，不适合应用于饲料及其原料中。物理去除方法中的机械分类处理、高温失活、放射处理或提取被污染物等方法也存在着成本高、操作难等缺点而难以大规模使用。因此，目前对于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的解脱毒研究主要集中在吸附法和生物降解法上。又因为吸附法仍无法将玉米赤霉烯酮进行解毒，使污染有可能二次发生，相比之下，生物降解法则具有诸多优势，利用微生物或其代谢产物进行解毒，生物酶的专一性强，成本低廉，清除率高，持续时间长，对环境和农作物都没有污染，利于大规模生产，是理想的防治玉米赤霉烯酮的方法。
然而目前有关玉米赤霉烯酮生物降解的研究比较少，如果直接使用菌粉则容易降解，且因为有活的菌体，不能使用在食品中。相比较而言，降解玉米赤霉烯酮的酶制剂产品安全、脱毒、效率高，易于保存，且能加入到食品中，有着更大的应用前景空间。现有的能降解玉米赤霉烯酮的纯酶制剂尚未有报道，深入挖掘降解玉米赤霉烯酮的酶及其相关基因，优化其发酵生产条件，提高其降解活性及效率，是大规模生产和应用的基本前提。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法。
本发明的目的是通过如下途径实现的：一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，其降解方法如下：
A.孢子悬浮液的制备：
将黑曲霉菌株在察氏高盐培养基平板上进行划线，在30°C培养箱中培养5天后，使用无菌接种环接取气生菌丝上的黑色孢子，并将孢子接入一毫升无菌水中，最后通过梯度稀释和血球计数板计数，最终稀释到1×107 CFU/mL的浓度；
B.无机盐培养基的处方：
所述培养基的主要成分为：1L超纯水含：蔗糖20-40 g，K2HPO4•3H2O 0.5-1.5 g，NH4Cl 2-4 g，KCl 0.5-1 g，MgSO4•7H2O 0.25-0.75 g，FeSO4 0.01-0.02 g，ZnSO4•7H2O0.075-0.125 g，CuSO4•5H2O 0.01-0.03 g, Na2MoO4•2H2O 0.075-0.125g；
培养基最佳处方：1L超纯水含：蔗糖30 g，K2HPO4•3H2O 1 g，NH4Cl 3 g，KCl 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，ZnSO4•7H2O 0.1 g，CuSO4•5H2O 0.03 g, Na2MoO4•2H2O0.1 g；
C. 降解玉米赤霉烯酮：
将黑曲霉菌株1×107 CFU/mL接种到含有玉米赤霉烯酮的无机盐培养基中，该菌株的接种量为无机盐培养基溶液体积的1-2%;在30±2℃培养3-5天。
本发明一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，与现有技术相比具有以下主要优点：
其一，首次发现了能够完全降解玉米赤霉烯酮的黑曲霉菌株，若按照1×107 CFU/mL的孢子悬液1-2%的接种量接种并培养后，该培养物能在3-5天内降解玉米赤霉烯酮，降解率达到99%。
其二，该黑曲霉菌株的功能鉴定为玉米赤霉烯酮污染的生物治理提供了宝贵的菌种资源，为今后研究生物对玉米赤霉烯酮的代谢途径，以及从分子生物学水平揭示其降解玉米赤霉烯酮的降解机制提供了材料，并为获得治理玉米赤霉烯酮污染酶制剂的研发提供了可能性。
其三，对无机盐培养基的优化使得仅用几种价格低廉的无机盐就能使该菌在降解玉米赤霉烯酮时效率提高，降解玉米赤霉烯酮的能力进一步提高。
其四，该黑曲霉菌株的制备及应用方法简单，成本低廉，操作方便。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细说明：
图1是含有10毫克每升的玉米赤霉烯酮的无机盐培养基在接入黑曲霉菌株孢子后1分钟时，上清液的高效液相色谱图;
图2是含有10毫克每升的玉米赤霉烯酮的无机盐培养基在接入黑曲霉菌株孢子后培养3天时，上清液的高效液相色谱图;
图3是含有10毫克每升的玉米赤霉烯酮的无机盐培养基在接入黑曲霉菌株孢子后培养5天时，上清液的高效液相色谱图;
图4是黑曲霉分别在蔗糖，葡萄糖，甘油和柠檬酸钠四种不同碳源生长时降解玉米赤霉烯酮的曲线图;
图5是黑曲霉分别在NaNO3，NH4Cl，酵母粉和蛋白胨四种不同氮源生长时降解玉米赤霉烯酮的曲线图;
图6是黑曲霉在添加了四种不同金属离子后降解玉米赤霉烯酮速率的折线图;
图7是黑曲霉在优化后的无机盐培养基中加入玉米赤霉烯酮时的生长曲线和玉米赤霉烯酮降解曲线图。
具体实施方式
本发明一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法, 其降解方法如下：
A.孢子悬浮液的制备：
将黑曲霉菌株在察氏高盐培养基平板上进行划线，在30°C培养箱中培养5天后，使用无菌接种环接取气生菌丝上的黑色孢子，并将孢子接入一毫升无菌水中，最后通过梯度稀释和血球计数板计数，最终稀释到1×107 CFU/mL的浓度；
B.无机盐培养基的处方：
所述培养基的主要成分为：1L超纯水含：蔗糖20-40 g，K2HPO4•3H2O 0.5-1.5 g，NH4Cl 2-4 g，KCl 0.5-1 g，MgSO4•7H2O 0.25-0.75 g，FeSO4 0.01-0.02 g，ZnSO4•7H2O0.075-0.125 g，CuSO4•5H2O 0.01-0.03 g, Na2MoO4•2H2O 0.075-0.125g；
培养基最佳处方：1L超纯水含：蔗糖30 g，K2HPO4•3H2O 1 g，NH4Cl 3 g，KCl 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，ZnSO4•7H2O 0.1 g，CuSO4•5H2O 0.03 g, Na2MoO4•2H2O0.1 g；
C. 降解玉米赤霉烯酮：
将黑曲霉菌株1×107 CFU/mL接种到含有玉米赤霉烯酮的无机盐培养基中，该菌株的接种量为无机盐培养基溶液体积的1-2%;在30±2℃培养3-5天。
一、玉米赤霉烯酮降解能力的初步鉴定
在灭菌的无机盐培养基中加入色谱级玉米赤霉烯酮，使其终浓度达到10毫克每升，将稀释后的孢子悬浮液接种到含有玉米赤霉烯酮的无机盐培养基中，使孢子的终浓度达到1×105 CFU/mL。在30°C摇床中培养，转速为200转每分钟。在培养五天后，使用灭菌滤纸对培养物进行过滤，所得滤液再进行高速离心10分钟，转速为12000转每分钟，离心后吸取上清液，使用高效液相色谱鉴定上清液中玉米赤霉烯酮的含量。高效液相色谱的检测条件为：色谱仪为Agilent 3000RS高效液相色谱系统，色谱柱为C18反相柱（250×4.6 mm, 5μm），流动相为甲醇和水，梯度洗脱，流速为1毫升每分钟，检测波长为200 nm到600 nm。从图1中看出玉米赤霉烯酮在16.41分钟出峰，最大吸收峰在242 nm左右。对比图2可以看出，在培养3天后，该浓度的玉米赤霉烯酮已经降解，降解率达到70%。而对比图3可以看出，在培养5天后，该浓度的玉米赤霉烯酮已经被完全降解，降解率达到99%。
二、无机盐培养基的优化
1.在进行碳源的筛选时，分别选取了蔗糖，葡萄糖，甘油和柠檬酸钠四种具有代表性的碳源，探索黑曲霉AS 3.350菌株利用双糖、单糖、醇和有机酸时降解玉米赤霉烯酮能力的变化。在培养基其他组分不变的情况下，在一升体系中分别加入总量30克的不同碳源，然后接入等量的孢子悬浮液，并加入等量的玉米赤霉烯酮，在30度摇床培养。在培养过程中，每隔24小时进行取样，并使用上述HPLC检测方法对体系内的玉米赤霉烯酮含量进行检测。检测的结果如图4所示，在四种不同碳源培养的条件下，黑曲霉AS 3.350降解玉米赤霉烯酮的能力有显著不同，其中在蔗糖中有最佳降解速率，说明该菌对双糖的适应力最好。同时可见其在甘油和柠檬酸钠中降解速率几乎为零，分析原因这可能是该菌无法利用这些碳源，从而无法生长也无法行使降解能力。
2.在进行氮源的筛选时，选取了NaNO3，NH4Cl，酵母粉和蛋白胨四种具有代表性的氮源，探索黑曲霉AS 3.350菌株利用酸性氮源、碱性氮源、有机复合氮源和氨基酸类氮源时降解玉米赤霉烯酮能力的变化。在培养基其他组分不变的情况下，在一升体系中分别加入总量1克的不同氮源，然后接入等量的孢子悬浮液，并加入等量的玉米赤霉烯酮，在30度摇床培养。在培养过程中，每隔24小时进行取样，并使用上述HPLC检测方法对体系内的玉米赤霉烯酮含量进行检测。检测的结果如图5所示。在四种不同氮源培养的条件下，黑曲霉AS3.350降解玉米赤霉烯酮的能力也有显著不同，其中在NH4Cl中有最佳降解速率，说明该菌对碱性的氮源的适应力最好，分析原因，有可能是利用碱性氮源时，其调整了玉米赤霉烯酮大内酯环的水解程度，使其被利用的几率增大。
3.在对无机盐和金属离子进行筛选时，选择了ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，MnSO4·H2O和Na2MoO4·2H2O这几种具有代表性且可作酶辅因子的金属离子。在筛选过程中，对每种金属离子均检测了低中高三种不同的浓度，并使用L9（34）正交法对其进行检测，正交数据如表1所示。
检测结果如图6所示，黑曲霉菌AS 3.350在培养基添加了低浓度的ZnSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和高浓度的Na2MoO4·2H2O时具有较好的降级玉米赤霉烯酮的速率，而添加MnSO4·H2O对其降解速率影响不大。
4.检测了在培养基中添加表面活性剂对酶活的影响作用。在试验中，还检测了表明活性剂TWEEN-20对其降解酶活力的影响。在加入了0.1%的TWEEN-20的培养基中，黑曲霉AS 3.350的生长受到一定程度的抑制，同时通过检测其降解玉米赤霉烯酮的情况，分析得出其相比对照组降解更慢，故表明活性剂对降解玉米赤霉烯酮没有促进作用。
综上所述，我们得出优化后的培养基的成分及含量，如下所示：
蔗糖 30克，K2HPO4·3H2O 1克，NH4Cl 3克，KCl 0.5克，MgSO4·7H2O 0.5克，FeSO40.01克，ZnSO4·7H2O 0.1克，CuSO4·5H2O 0.03克和Na2MoO4·2H2O 0.1克，溶于1升超纯水，灭菌后使用。
三、利用优化后的无机盐培养基进行黑曲霉菌AS 3.350的生长和降解玉米赤霉烯酮的实验。
依照结果1中的步骤，使用优化后的无机盐培养基接种黑曲霉AS 3.350的孢子悬浮液并加入玉米赤霉烯酮。对体系进行定时取样，测定其细胞干重和玉米赤霉烯酮浓度的测定，得到其生长和降解曲线，如图7所示。
黑曲霉，收藏时间：1993-12-17，保藏地点：中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号：CCTCC AF 93295，属名：Aspergillus，种名：niger。
Claims (2)
1.一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：其降解方法如下：
A.孢子悬浮液的制备：
将黑曲霉菌株在察氏高盐培养基平板上进行划线，在30°C培养箱中培养5天后，使用无菌接种环接取气生菌丝上的黑色孢子，并将孢子接入一毫升无菌水中，最后通过梯度稀释和血球计数板计数，最终稀释到1×107 CFU/mL的浓度；
B.无机盐培养基的处方：
所述培养基的主要成分为：1L超纯水中添加：蔗糖20-40 g，K2HPO4•3H2O 0.5-1.5 g，NH4Cl 2-4 g，KCl 0.5-1 g，MgSO4•7H2O 0.25-0.75 g，FeSO4 0.01-0.02 g，ZnSO4•7H2O0.075-0.125 g，CuSO4•5H2O 0.01-0.03 g, Na2MoO4•2H2O 0.075-0.125g；
C. 降解玉米赤霉烯酮：
将黑曲霉菌株1×107 CFU/mL接种到含有玉米赤霉烯酮的无机盐培养基中，该菌株的接种量为无机盐培养基溶液体积的1-2%;在30±2℃培养3-5天;
所述的黑曲霉现保藏于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC AF 93295。
2.如权利要求1所述的一种利用黑曲霉菌降解玉米赤霉烯酮的方法，其特征在于：所述的培养基最佳配比方案为：1L超纯水中添加：蔗糖30 g，K2HPO4•3H2O 1 g，NH4Cl 3 g，KCl0.5 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，ZnSO4•7H2O 0.1 g，CuSO4•5H2O 0.03 g, Na2MoO4•2H2O 0.1 g。
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