CN106065396A - 一种蔬菜芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蔬菜芽孢杆菌及其培养方法和应用，该蔬菜芽孢杆菌的名称为Bacillus oleronius，保藏号为CCTCCM NO.2015642，从鸡肠道中分离纯化筛选得到，所述蔬菜芽孢杆菌与黄曲霉毒素B1反应6小时，对其降解率可达60％以上，反应72小时后对B1的降解率可达到80％以上，蔬菜芽孢杆菌在pH＝7、温度37℃、100/300mL接种量、6％接种量、10mmol/L Mg2+、Ba2+金属离子添加量的发酵条件下降解率高，综合降解率可达到80％以上。本发明的蔬菜芽孢杆菌降解活性强，作用温和，生物安全性高，适用于添加到饲料中以去除饲料中的黄曲霉毒素B1。

Description

一种蔬菜芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及生物菌株领域，具体涉及一种蔬菜芽孢杆菌及其培养方法和应用。

背景技术

黄曲霉毒素(aflatoxin，简称AFT)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、集蜂曲霉(Aspergillus nomius)和溜曲霉(Aspergillustamarii)等丝状真菌产生的一类结构类似的强毒性次级代谢产物，其中AFB1毒性最强，也最为常见，于1993年被世界卫生组织癌症研究机构(IARC)划定为IA类致癌物。AFT广泛分布于自然界中，主要侵染花生、玉米等粮油作物，每年给全球造成巨大的经济损失。

去除黄曲霉毒素的方法主要有紫外线照射、热处理、吸附剂脱毒等物理法，及强碱、强酸、抗氧化剂处理等化学法，近年来，微生物去毒法成为近年来的研究热点。微生物去毒是利用细菌、真菌等微生物及其代谢产物降解饲料、食品中污染的霉菌毒素。生物去毒法对原料无污染、具有高度专一性、同时避免毒素重新产生，因此是一种高效、安全的去毒方法。目前国内外已报道的降解AFT的真菌包括假蜜环菌、糙皮侧耳等食用真菌，树状指孢霉等孢霉属菌及黑曲霉等曲霉属菌。能降解AFT的细菌主要有红串红球菌、橙色粘球菌、枯草芽孢杆菌及弯曲乳杆菌等。大部分降解菌是通过分泌降解酶与毒素反应，达到解毒的作用，降解效率受作用时间、溶液pH值、发酵时间、降解时间、金属离子浓度等发酵条件的影响。

至今为止，未见关于蔬菜芽孢杆菌及其所产胞外酶降解黄曲霉毒素的报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种蔬菜芽孢杆菌及其培养方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种蔬菜芽孢杆菌，其名称为Bacillus oleronius，保藏号为CCTCCM N0.2015642

从鸡肠道中分离纯化筛选得到，其理化性质见下表：

其形态特征为：营养琼脂培养基上为灰白色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面膜状有同心环轻度隆起，显微镜下细胞形态为杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性。

本发明提供所述蔬菜芽孢杆菌的降解特性鉴定方法。分离发酵液各组分，添加毒素至浓度为2.5μg/ml，35℃降解72h。菌液与去除胞体的上清液降解能力很强，达80％以上；菌悬液与胞内液也有一定的降解能力，但相对较弱，仅为20％左右，由此判断，该菌株降解AFB1不是依赖胞体的吸附作用，而是细胞代谢产生并分泌至胞外的活性物质主导的生物酶解作用。

本发明还提供了上述蔬菜芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

S1、称取蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 8.5g，磷酸二氢钾1g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL混合后，得pH值为6.5-7.5的培养基；

S2、将上述菌株种子液，接种到步骤S1所得的培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度25-45，发酵时间6-72h，pH值4.0-9.0，装液量25-200ml，接种量1-12％，转速100-200r/min，得蔬菜芽孢杆菌发酵液。

优选地，所述摇瓶发酵条件为：发酵温度35℃，发酵时间48h，pH值7.0，装液量100ml，接种量6％，转速160r/min。

上述蔬菜芽孢杆菌可用于降解黄曲霉毒素B1，具体方法为：取上述蔬菜芽孢杆菌发酵液975ul，加入黄曲霉毒素B1 25ul，将反应体系pH调节为7.0，在35℃反应72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素B1，其中，黄曲霉毒素B1溶液的浓度为2.5μg/ml。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的蔬菜芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1的效率高，特异性强，对黄曲霉毒素B1降解率可达80％以上。

(2)本发明降解黄曲霉毒素B1的方法操作简单，生物安全性高，有效的解决了传统去毒方法存在的问题。

附图说明

图1为本发明实施例中各组降解黄曲霉毒素B1图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种蔬菜芽孢杆菌，其特征在于，其名称为Bacillusoleronius，保藏号为CCTCCM N0.2015642

从鸡肠道中分离纯化筛选得到，其理化性质见下表：

其形态特征为：营养琼脂培养基上为灰白色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面膜状有同心环轻度隆起，显微镜下细胞形态为杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性。

本发明提供所述蔬菜芽孢杆菌的降解特性鉴定方法。分离发酵液各组分，添加毒素至浓度为2.5μg/ml，35℃降解72h。菌液与去除胞体的上清液降解能力很强，达80％以上；菌悬液与胞内液也有一定的降解能力，但相对较弱，仅为20％左右，由此判断，该菌株降解AFB1不是依赖胞体的吸附作用，而是细胞代谢产生并分泌至胞外的活性物质主导的生物酶解作用。

本发明实施例还提供了上述蔬菜芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

S1、称取蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 8.5g，磷酸二氢钾1g，葡萄糖1g，蒸馏水1000mL混合后，得pH值为6.5-7.5的培养基；

S2、将上述菌株种子液，接种到步骤S1所得的培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度25-45，发酵时间6-72h，pH值4.0-9.0，装液量25-200ml，接种量1-12％，转速100-200r/min，得蔬菜芽孢杆菌发酵液。

优选地，所述摇瓶发酵条件为：发酵温度35℃，发酵时间48h，pH值7.0，装液量100ml，接种量6％，转速160r/min。

上述蔬菜芽孢杆菌可用于降解黄曲霉毒素B1，具体方法为：取上述蔬菜芽孢杆菌发酵液975ul，加入黄曲霉毒素B1 25ul，将反应体系pH调节为7.0，在35℃反应72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素B1，其中，黄曲霉毒素B1溶液的浓度为2.5μg/ml。

实施例

1.AFB1色谱图检测方法：Agilent 1100型高效液相色谱仪测定样品。制备样品：蔬菜芽孢杆菌发酵上清液经0.22μm滤膜过滤处理。色谱条件：色谱柱为C18反向吸附柱(4.6mm×250mm，5μm)，进样量20μL，流动相水∶甲醇＝1∶1(V/V)，流速1mL/min，检测波长365nm。图1为AFB1检出峰的出锋时间和响应值的关系图。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种蔬菜芽孢杆菌，其特征在于，其名称为Bacillus oleronius，保藏号为CCTCCMNO.2015642

从鸡肠道中分离纯化筛选得到，其理化性质见下表：

其形态特征为：营养琼脂培养基上为灰白色的圆形菌落，菌落边缘整齐，表面膜状有同心环轻度隆起，显微镜下细胞形态为杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性。

2.如权利要求1所述的一种蔬菜芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、称取蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 8.5g，磷酸二氢钾1g，葡萄糖1g，蒸馏水1 000mL混合后，得pH值为6.5-7.5的培养基；

S2、将上述菌株种子液，接种到步骤S1所得的培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度25-45，发酵时间6-72h，pH值4.0-9.0，装液量25-200ml，接种量1-12％，转速100-200r/min，得蔬菜芽孢杆菌发酵液。

3.如权利要求2所述的一种蔬菜芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述摇瓶发酵条件为：发酵温度35℃，发酵时间48h，pH值7.0，装液量100ml，接种量6％，转速160r/min。

4.如权利要求1所述的一种蔬菜芽孢杆菌的应用，其特征在于，可用于降解黄曲霉毒素B1。

5.如权利要求4所述的一种蔬菜芽孢杆菌的应用，其特征在于，取上述蔬菜芽孢杆菌发酵液975ul，加入黄曲霉毒素B1 25ul，将反应体系pH调节为7.0，在35℃反应72h后即可去除溶液中的黄曲霉毒素B1，其中，黄曲霉毒素B1溶液的浓度为2.5μg/ml。