CN105087422B - 一种植物乳杆菌jla‑9、及其生产的细菌素、细菌素的生产鉴定方法 - Google Patents
一种植物乳杆菌jla‑9、及其生产的细菌素、细菌素的生产鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌、分离培养方法及其生产的新型细菌素的纯化鉴定方法。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA‑9的菌种保藏编号为(CGMCC NO.10686)，该生产菌株从东北传统发酵食品“酸菜”中分离得到，其能够在MRS培养基里发酵产生一种新型的细菌素，新型细菌素通过四步纯化方式最后经鉴定得到。本发明提供的细菌素可抑制芽孢类细菌以及食品中其他常见的食源性腐败和致病细菌，同时对热及pH稳定，可以被蛋白酶降解，因此安全性较高，不会在人体内残留，可以作为食品防腐剂广泛应用到食品工业中。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物领域，特别涉及一种植物乳杆菌JLA-9、其分泌的新型乳酸菌细菌素及该细菌素的生产、鉴定方法。
背景技术
食品安全目前已经成为全世界范围内的重要课题，随着食品科技的飞速发展，越来越多的化学添加剂应用到食品工业中，给食品安全方面带来了一些潜在危害。同时，食品中微生物的污染也日益严重，世界上每年都有多起食品中微生物污染导致的群体性中毒事件，在我国这种发展中国家问题尤为突出，食源性疾病的不断增加已经日益引起了公众和政府部门的高度重视。因此，食品防腐保鲜方法的研究已经成为目前的热门研究方向。目前，食品防腐主要采用的是化学方法和物理方法，人为的添加化学防腐剂高剂量或者长期的摄入会对人体内产生蓄积毒性作用，对人体的肝脏等会产生有害影响，甚至一些化学防腐剂有致畸性或致癌性等问题。物理防腐如加热灭菌会导致食品的色泽，质构及风味发生一定的变化，从而对食品的品质造成不良的影响。而辐照灭菌等可能会破坏食品中氨基酸结构，引起脂肪的氧化等从而导致食品的营养价值降低。因此，开发出高效、广谱、安全的天然生物防腐剂已经成为食品工业发展的必然趋势。
食品中能引起食品腐败的微生物种类很多，主要有细菌，霉菌和酵母。一般情况下由于细菌的繁殖周期短，因此主要以细菌占优势。其中主要有假单胞菌属，芽孢杆菌属，肠杆菌属，微球菌属及葡萄球菌属等。它们能有分解食品中的各种成分，产气，产色素，产酸等，从而导致食品的腐败。对于包装食品而言，大多数细菌经过商业灭菌之后都能够被杀死，而目前在包装品中导致食品腐败的主要芽孢杆菌类，由于其产生的芽孢具有高度的抗逆性，在正常的巴氏杀菌条件下不能够完全杀死，当环境适宜，芽孢重新萌发，导致微生物迅速繁殖，从而引起包装食品的腐败变质，例如枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌等能够引起面包的粘液化，嗜热脂肪地芽孢杆菌存在果汁及水果罐头中导致产气胀罐，多粘类芽孢杆菌在牛奶中导致牛奶变粘等。还有一些食品中的芽孢杆菌具有致病作用，如存在于豆类食品、肉制品、焙烤食品中的蜡样芽孢杆菌能够产生肠毒素导致人呕吐腹泻，乳粉中的艰难梭菌导致人患上结肠炎，肉类罐头，乳粉中污染的肉毒梭菌能够产生世界上最强的毒素之一肉毒杆菌毒素，导致人体神经麻痹从而导致人体死亡。因此，抑制食品中芽孢杆菌尤为重要，将逐渐成为一个食品保鲜研究领域的一个热点。
乳酸菌作为一种益生菌已经应用到食品工业的各个领域，目前，许多乳酸菌已经也用到了医疗保健方面。从数千年前人们就已经开始利用乳酸菌发酵生产米酒等食品，数千年的应用已经证明乳酸菌是安全无害的，而且对人体有益生保健作用因此，乳酸菌已经被国际上公认为是GRAS(generally recognized as safe)菌。乳酸菌发酵能够产生细菌素，细菌素是由乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，细菌素可以抑制或者杀死生长环境中与其近缘的物种或者其他物种的微生物，但是产生细菌素的细菌本身都具有特异性的自身免疫基因，产生的细菌素不会对细菌自身造成伤害。虽然目前有多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都能产生细菌素，但是由于乳酸菌被认为是安全的(GRAS)，而且大多数产生细菌素的乳酸菌都分离自天然发酵食品中，因此乳酸菌产生的细菌素更适合在食品中应用。
虽然国内外对不同来源的乳酸菌细菌素的研究较多，但是目前很少应用到食品工业中，尤其是专门抑制食品中芽孢杆菌污染的细菌素研究很少，近年来，由芽孢杆菌类导致的食品污染事件逐渐增多，因此，开发一种能够广谱高效的抑制食品中常见的腐败性及致病性芽孢杆菌的乳酸菌新型细菌素显得尤为重要，其将具有巨大的市场应用前景。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中食品污染严重，食品保鲜能力亟待加强以适应巨大市场应用前景。
1.本发明提供一种植物乳杆菌JLA-9，该菌种分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，已于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10686。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.本发明还提供一种新型细菌素，该细菌素由上述1提供的植物乳杆菌JLA-9发酵生产的，经过纯化后应用MALDI-TOF-MS分析确定植物乳杆菌细菌素的分子量为1044Da。
3.上述2提供的新型细菌素，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
4.上述2或3提供的新型细菌素的生产方法，包括下列步骤：
(1)将保藏号为CGMCC NO.10686的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9按体积百分比1∶100接种于MRS培养基中，37℃进行静止培养36h后，得到含有细菌素的发酵液；
(2)含细菌素发酵液经离心后收集上清液，萃取分离，将有机相进行真空浓缩，得细菌素粗提物；
(3)细菌素粗提物经过Sephadex LH-20和Sephadex G-25分离收集活性馏分；
(4)细菌素活性馏分通过HPLC分离纯化细菌素。
5.上述4提供的生产方法，其中，细菌素发酵液的具体获得步骤如下：
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9接种于试管斜面MRS琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化；然后将活化好的菌种接种于MRS液体培养基，37℃、静止培养16～20h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/ml的种子液；将植物乳杆菌JLA-9种子液以1％浓度接种于MRS发酵培养基中，在37℃静止条件下培养36h，得到细菌素发酵液。
6.上述4提供的生产方法，其中，将细菌发酵素发酵液用正丁醇进行萃取分离，具体包括如下：发酵液在9000g下离心30min除去菌体，然后用与上清液3倍体积的正丁醇以萃取法抽提两次后，将有机相经过真空浓缩，即为获得的细菌素粗提物。
7.上述6提供的生产方法，其中，细菌素粗提物进行分离纯化，包括如下步骤：
Sephadex LH-20纯化：将正丁醇萃取得到的细菌素粗提取，经浓缩后上样于Sephadex LH-20柱表面，打开恒流泵，调整好流速3ml/8min，采用体积比80％的色谱纯甲醇进行洗脱，利用自动收集器收集活性馏分，得到一个活性洗脱峰。具体步骤为：让样品完全进入凝胶柱内部后用自动收集器开始收集洗脱下来的样品，样品在凝胶柱洗脱3h，将自动收集器设置为每9min接1管(4ml的离心管)，收集每管，以蜡样芽孢杆菌为指示菌做抑菌实验，其中第35管到第50管收集的组分具有抑菌活性，洗脱时间为495min-630min；
(3)Sephadex G-25纯化：将经过Sephadex LH-20纯化得到的活性馏分经过浓缩20倍后(浓缩采用真空离心浓缩仪进行浓缩，加热温度为37℃，)上样于Sephadex G-25，采用蒸馏水进行洗脱，流速控制3ml/8min，采用自动收集器收集活性馏分，得到一个活性洗脱峰。具体步骤为：让样品完全进入凝胶柱内部后，用自动收集器开始收集洗脱下来的样品，将自动收集器设置为每9min接1管(4ml的离心管)，样品在凝胶柱洗脱3h，收集每管做抑菌实验，其中第17管到第25管收集的组分具有抑菌活性，洗脱时间为333min-405min；
(4)HPLC纯化：将经过Sephadex G-25纯化得到的活性馏分经浓缩20倍后(浓缩采用真空离心浓缩仪进行浓缩，加热温度为37℃)，采用RP-C18柱进行分离纯化；纯化条件：洗脱液为含0.1％质量的三氟乙酸的水和乙腈溶液；时间，50min，95％体积的水+5％体积的乙腈等浓度洗脱；流速为0.3ml/min；检测波长为259nm；细菌素HPLC洗脱保留时间为20min；
8.上述7提供的方法，其中，HPLC纯化步骤中高效液相色谱仪为美国AGILENT1100series，配备DVD检测器。
9.本发明还提供上述2或3所述的新型细菌素的鉴定方法，其中，将经过分离纯化后的细菌素利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)测定其分子量和鉴定其结构，其中，质谱分析采用MALDI-TOF-MS分析，仪器为使用德国BRUKER公司的Re Flex TM MALDI-TOF质谱仪；质谱基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸；质谱条件：波长355nm的Nd YAG激光器，加速电压20kV，激光强度4100，正离子谱检测，线性高分子模式。
10.本发明还提供上述2或3提供的新型细菌素在食品防腐保鲜或者抗菌药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明首次提供了一种产新型乳酸菌细菌素的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JLA-9菌株。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9分离自中国吉林省传统发酵食品酸菜，酸菜具有悠久的食用历史，因此从安全上讲植物乳杆菌发酵产的细菌素应用到食品中是安全的。此外植物乳杆菌产的细菌素对多种革兰氏阳性细菌(尤其是芽孢类细菌)、阴性菌具有很高的抑菌活性，可以替代化学防腐剂的使用，延长食品的保质期。同时植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产的细菌素，性质比较稳定，在pH2-7的范围内，80℃以下其抑菌活性基本保持不变，有利于其在食品中的应用。本发明采用的植物乳杆菌是被公认为GRPS，已经在食品工业中得到了广泛的应用，而植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产的细菌素属于微生物天然抗菌肽，对人类健康和食品安全性高，作为食品防腐剂，在食品加工和农产品贮藏保鲜等领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产的细菌素经过SephadexLH-20分离纯化洗脱图。
图2是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产的细菌素经过SephadexG-25分离纯化洗脱图。
图3是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产的细菌素HPLC图。
图4是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产的细菌素MALDI-TOF-MS图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。
实施例1 抗芽孢杆菌乳酸菌的筛选
1.乳酸菌的分离纯化：将采集的酸菜样品(中国吉林省传统发酵方法制作的食品酸菜)25克放入225ml的无菌生理盐水中进行10倍梯度稀释，分别取10-4，10-510-6三个浓度各取0.1ml涂布于含有2％的碳酸钙(100ml培养基里2g的碳酸钙)的MRS固体培养基平板上。随机挑取出现钙溶圈的单菌落，将得到的单菌落进一步在含有碳酸钙的MRS固体培养基平板上划线分离纯化，挑选钙溶圈明显的(即以肉眼能看到有透明圈产生)单菌落，进一步通过过氧化氢酶测试以及革兰氏染色，选取过氧化氢酶测试呈阴性，革兰氏染色阳性的的单菌落，进一步采用甘油管保藏的方式将菌置于-70℃保藏，方法是将500微升对数期的菌液和500微升50％的甘油(甘油和水的体积比)放入菌种保藏管中混匀，置于-70℃保藏。
2.指示菌的准备与培养条件
抗芽孢杆菌乳酸菌菌株的初筛选择蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌两种指示菌，复筛中指示菌包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌以及多粘类芽孢杆菌五种。分别将上述指示细菌培养于营养琼脂培养基上，采用37℃培养12h；各指示菌在接种前，用无菌生理盐水调整菌体浓度至OD600nm＝0.5。
3.抗芽孢杆菌乳酸菌菌株的初筛
将步骤1)分离得到的乳酸菌分别划线于MRS固体培养基平板上，37℃培养36h后，以无菌打孔器于生长菌落旁取出5mm直径的琼脂块，贴放于含有蜡样芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的指示平板表面，于37℃温度下培养12-16h后测定抑菌圈大小，初筛获得抑菌圈直径大于的8mm的菌株，保留，共得到165株菌株。
4.抗芽孢杆菌乳酸菌菌株的复筛
将经初筛具有抗菌活性的菌株分别于100mlMRS液体培养基中，37℃静止培养36h。90000g离心30min获得发酵上清液，上清液经0.45μm孔径的细菌滤器过滤，在上清液中加入过氧化氢酶除去过氧化氢，去除过氧化氢抑制；同时，由于发酵上清液由于含有乳酸等，pH在4.0左右，用氢氧化钠将上清液的pH值调节到6.5，从而排除酸对抑菌活性的影响，采用琼脂孔扩散法(100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基中混入1ml指示菌菌液，倾倒平板待其冷却后，用5mm直径的无菌打孔器打取平板上的琼脂块，取滤液50μl注入琼脂孔中，指示细菌于相应的培养条件下培养后，通过游标卡尺测其抑菌圈的直径，以抑菌圈的直径表示发酵液的抗菌活性)测定发酵液的抗菌活性，从初筛得到的165株中经复筛，共得到49株具有抑菌活性的菌株。以抑菌圈大小确定抑菌活性大小，最终，本实验得到五株抑菌活性较好的的菌株，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9(表中A-9)的抑菌活性最好，结果见表1。
表1 筛选得到的五株菌抑菌活性结果
5.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9菌株的鉴定方法
生理生化鉴定：根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对筛选出来的菌株进行革兰氏染色及生理生化特征鉴定。
结果表明，菌株为无芽孢的革兰氏阳性菌，无鞭毛，呈短杆状，过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性，不产气，产酸，接触酶呈阴性，不能够液化明胶，硝酸盐呈阴性能够发酵利用阿拉伯糖、纤维二糖、七叶苷、乳糖、蔗糖、木糖、菊糖、麦芽糖、水杨苷等，不能够发酵利用鼠李糖。性质比较稳定，在pH2-7的范围内，80℃以下其抑菌活性基本保持不变。具体结果表2.
表2 菌株生理生化测定结果
6.菌株的16S rDNA鉴定
采用原核生物16S rRNA扩增的通用引物(由上海生工生物公司合成)，正向引物：fD1 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物：rP1 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，经PCR扩增得到的目的片段，送去南京金斯瑞生物公司测序，得到1541bp的碱基对(GenBank登录号：KP406154)将所得到的16S rRNA基因序列，在www.ncbi.nlm.nlh.gov网站中使用BLASTN2.211[MAY-05-2005]在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因库中进行同源性搜索，所得结果中，相似性最高的4个菌株均为植物乳杆菌而且相似性均达到100％，如表3。因此，结合生理生化试验以及16S rRNA同源性比较结果可以确定该菌株为植物乳杆菌。
表3
实施例2 新型乳酸菌细菌素的鉴定
1.植物乳杆菌的发酵培养产细菌素
(1)植物乳杆菌JLA-9种子液的制备：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9接种于试管斜面MRS琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化；然后活化好的菌种接种于MRS液体培养基，37℃、静止培养16～20h，至对数生长期，制成浓度为107～108cfu/ml的种子液；
(2)植物乳杆菌JLA-9产细菌素的发酵：将植物乳杆菌JLA-9种子液以1％浓度接种于MRS发酵培养基中，在37℃静止条件下培养36h，得到细菌素发酵液。
2.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产细菌素的分离
(1)正丁醇萃取分离：首先将植物乳杆菌的发酵液在9000g下离心30min除去菌体，然后将发酵上清液浓缩5倍，用与上清液3倍体积的正丁醇以萃取法抽提两次后，将有机相经过真空浓缩，即为获得的细菌素粗提物；
(2)Sephadex LH-20纯化：将正丁醇萃取得到的细菌素粗提物经过浓缩2倍后，上样1mL于Sephadex LH-20柱表面，打开恒流泵，调整好流速(3ml/8min)，采用80％体积比的色谱甲醇进行洗脱，利用自动收集器收集馏分，以蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌为指示菌，通过检测抑菌活性，得到一个活性洗脱峰见(图1)。由图1可以看出，由第35管到第50管收集得到的组分具有抑菌活性，将所有活性组分合并后经浓缩20倍，用于下一步的分离纯化；
(3)Sephadex G-25纯化：将经过Sephadex LH-20纯化得到的活性馏分经过浓缩20倍上样于Sephadex G-25，采用蒸馏水进行洗脱，流速控制3ml/8min，采用自动收集器收集活性馏分，以蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌为指示菌，通过检测抑菌活性，得到一个活性洗脱峰见(图2)，由图2可以看出，由第17管到第25管收集得到的组分具有抑菌活性，将所有活性组分合并后经浓缩20倍，用于下一步的分离纯化；
(4)HPLC纯化：将经过Sephadex G-25纯化得到的活性馏分经浓缩后采用RP-C18柱进行分离纯化，纯化条件：洗脱液为含0.1％质量的三氟乙酸的水和乙腈溶液，Time：50min，95％体积的水+5％体积的乙腈等浓度洗脱；流速为0.3ml/min；检测波长为259nm；细菌素HPLC洗脱保留时间约为20min，见图3，由图3可以看出，经RP-HPLC进行最终纯化，得到一个单一的活性峰，保留时间为20min，将其收集后浓缩10倍，用于下一步的质谱鉴定。
3.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9产细菌素的鉴定
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9细菌素活性馏分经HPLC分离后，抑菌活性峰再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)测定其分子量为1044Da见图4。利用N-端氨基酸测序得到该细菌素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例3 新型乳酸菌细菌素的抗菌活性
将纯化得到的细菌素分别选用表4(分别来源于CMCC.ATCC，CICC等菌种保藏中心)所述的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌为指示菌株，测定其抑菌活性。结果表明，植物乳杆菌JLA-9产的细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌效果，尤其对芽孢类细菌具有较广谱的抑菌效果。
表4 植物乳杆菌JLA-9产细菌素的抑菌谱
Claims (8)
1. 一种植物乳杆菌JLA-9，其特征在于：该菌种分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，已于2015 年4 月2 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10686。
2.一种细菌素，其特征在于：该细菌素氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
3.权利要求2所述的细菌素的生产方法，其特征在于包括下列步骤：
(1) 将保藏号为CGMCC NO.10686 的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9按体积百分比1 ：100 接种于MRS 培养基中，37℃进行静止培养36h 后，得到含有细菌素的发酵液；
(2) 含细菌素发酵液经离心后收集上清液，用正丁醇萃取分离，将有机相进行真空浓缩，得细菌素粗提物；
(3) 细菌素粗提物经过Sephadex LH-20 和Sephadex G-25 分离收集活性馏分；
(4) 细菌素活性馏分通过HPLC 分离纯化细菌素。
4.权利要求3 所述的生产方法，其特征在于，细菌素发酵液的具体获得步骤如下：将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)JLA-9 接种于试管斜面MRS 琼脂培养基上，37℃培养24h，将菌种活化；然后将活化好的菌种接种于MRS 液体培养基，37℃、静止培养16 ～20h，至对数生长期，制成浓度为107～ 10 8cfu/ml 的种子液；将植物乳杆菌JLA-9 种子液以1％浓度接种于MRS 发酵培养基中，在37℃静止条件下培养36h，得到细菌素发酵液。
5.权利要求3 所述的生产方法，其特征在于，将细菌发酵素发酵液用正丁醇进行萃取分离，具体包括如下：发酵液在9000g 下离心30min 除去菌体，然后用与上清液3 倍体积的正丁醇以萃取法抽提两次后，将有机相经过真空浓缩，即为获得的细菌素粗提物。
6.权利要求5 所述的生产方法，其特征在于：细菌素粗提物进行分离纯化，包括如下步骤：
Sephadex LH-20 纯化：将正丁醇萃取得到的细菌素粗提取，经浓缩后上样SephadexLH-20 柱表面，打开恒流泵，调整好流速3ml/8min，采用体积比80％的色谱纯甲醇进行洗脱，利用自动收集器收集活性馏分，每9min 接1 管，洗脱3h，得到一个活性洗脱峰；同时，收集每管做抑菌实验，其中第35 管到第50 管收集的组分具有抑菌活性，其洗脱时间为495min-630min ；
(3)Sephadex G-25 纯化：将经过Sephadex LH-20 纯化得到的活性馏分经过真空离心浓缩仪在37℃条件下进行浓缩20 倍，之后，上样于Sephadex G-25，采用蒸馏水进行洗脱，流速控制3ml/8min，采用自动收集器收集活性馏分，每9min 接1 管，洗脱3h，得到一个活性洗脱峰；同时，收集每管做抑菌实验，其中第17 管到第25 管收集的组分具有抑菌活性，其洗脱时间为333min-405min ；
(4)HPLC 纯化：将经过Sephadex G-25 纯化得到的活性馏分在37℃条件下浓缩20 倍后，采用RP-C18 柱进行分离纯化，纯化条件：洗脱液为含0.1％质量的三氟乙酸的水和乙腈溶液；时间，50min，95％体积水+5％体积乙腈等浓度洗脱；流速为0.3ml/min ；检测波长为259nm ；细菌素HPLC 洗脱保留时间为20min。
7.根据权利要求6 所述的方法，其特征在于HPLC 纯化中高效液相色谱仪为美国AGILENT 1100series，配备DVD 检测器。
8.权利要求2 所述的细菌素的鉴定方法，其特征在于：将经过分离纯化后的细菌素利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定其分子量和鉴定其结构，其中，质谱分析采用MALDI-TOF-MS 分析，仪器为使用德国BRUKER 公司的Re Flex TM MALDI-TOF 质谱仪；质谱基质为α- 氰基-4- 羟基肉桂酸；质谱条件：波长355nm 的Nd YAG 激光器，加速电压20kV，激光强度4100，正离子谱检测，线性高分子模式。
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