CN107219110A - 适用于maldi‑tof检测的微生物培养液处理方法及快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适用于MALDI‑TOF检测的微生物培养液处理方法及快速鉴定方法，具体步骤为：将血培养阳性菌悬液加入冰醋酸裂解红细胞，离心去除上清，沉淀加入体积分数10％的冰醋酸溶液裂解红细胞，混匀后再次离心，去上清，沉淀即为待测物，处理步骤简单，试剂成本低；本发明还公开了血培养阳性瓶中微生物的快速鉴定方法，耗时短，能在短时间给予临床可靠鉴定结果，可更好地指导临床抗生素的使用，减少抗生素的滥用。

Description

适用于MALDI-TOF检测的微生物培养液处理方法及快速鉴定 方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及适用于MALDI-TOF检测的微生物培养液处理方法，还涉及血培养阳性瓶中微生物的快速鉴定方法。

背景技术

血流感染是一种严重的全身感染性疾病，病院微生物在循环血液中呈一过性、间接性或持续存在，对机体所有脏器，特别是心脏瓣膜、关节等造成损害，严重者可导致休克、多器官衰竭、弥散性血管内凝血，甚至死亡。目前血培养是诊断血流感染的金标准。血培养是把新鲜离体的血液标本接种到一个或多个培养瓶或培养管中，在一定温度和湿度等条件下，使对营养要求较高的细菌或真菌生长繁殖并对其进行鉴别，从而确定病原微生物的一种人工培养法。可用来发现和识别可培养分离的微生物，如肠杆菌科、葡萄菌属、念珠菌属等。如何快速检测出血流感染患者血液中的病原微生物对感染性疾病的诊断、治疗和预后有重要的临床意义。

在我国绝大部分二级以上医院都已使用全自动血培养系统，主要有法国梅里埃的Bact_Alert 3D、美国BD的Bactec FX和美国赛默飞的VersaTREK等型号，用于接种血液标本的培养容器统称为血培养瓶，接种过血液的血培养瓶，可通过培养仪自动监测其中的微生物生长情况，对有微生物生长的血培养瓶，仪器自动报阳，随后工作人员再对阳性瓶进行处理。传统的血培养阳性瓶中微生物鉴定流程主要为：血培养仪报阳后，转钟适宜平皿，培养直到长出可见菌落，再对其进行鉴定。流程中根据微生物种类的不同，培养时间存在较大差异，如肠杆菌科18到24小时可见明显菌落，而对于一些厌氧菌则需要两到三天甚至更久，对于血流感染患者来说时间就是生命，因此血培养阳性瓶中微生物的快速鉴定对于临床非常重要。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪近几年来在我国临床微生物检测方面广泛使用，该仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，从而检测离子的分子量。分子量是有机化合物最基本的理化性质参数，MALDI-TOF可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量，如多肽、蛋白质等。其主要优点有检测速度快、灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，目前在我国绝大部分临床微生物室主要用于微生物的快速鉴定。

现阶段，细菌耐药已成为全球的公共卫生安全问题，在我国已上升到国家高度，国家卫计委连续几年下发了抗生素合理使用的相关文件。血液标本是细菌耐药监测最重要的细菌来源之一，因此做好存在血流感染患者抗生素的合理使用显得尤为重要。血流感染患者一般病情较重，传统的血培养阳性瓶中微生物的鉴定流程时间较长，往往医生需要在鉴定结果出来之前给予病人经验用药，这样错误用药的概率较高。因此急需一种微生物的快速鉴定方法，可在较短时间内确定微生物种类，结合耐药监测数据，可有效降低经验用药错误的风险，减少抗生素的滥用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种适用于MALDI-TOF检测的血培养阳性菌悬液处理方法；本发明的目的之二在于提供基于MALDI-TOF快速鉴定血培养阳性瓶中微生物的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、适用于MALDI-TOF检测的血培养阳性菌悬液处理方法，包括如下步骤：将血培养阳性菌悬液加入冰醋酸裂解红细胞，离心去除上清，沉淀加入体积分数10％的冰醋酸溶液裂解红细胞，混匀后再次离心，去上清，沉淀即为待测物。

本发明中，优选为将血培养阳性菌悬液加入相当于菌悬液体积0.2倍的冰醋酸裂解红细胞，在12000g条件下离心2min，去上清，再向沉淀中加入体积分数10％的冰醋酸溶液，混匀，再次12000g离心2min，去上清，沉淀即为待测物。

2、基于MALDI-TOF快速鉴定血培养阳性瓶中微生物的方法，

(1)将血培养标本收到血培养瓶后放入全自动血培养系统进行检测，仪器报阳性后，取出阳性血培养瓶，无菌条件下从培养瓶中取出培养液，制成菌悬液；

(2)将步骤(1)制成的菌悬液按照权利要求1或2所述的方法处理，制得待测物；

(3)将步骤(2)制得的待测物均匀涂布于质谱靶板上，风干，再加入体积分数70％的甲酸溶液，风干，最后加入α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液(10mg/mL)，风干；风干后，将靶板放入质谱仪，用标准品对仪器进行校正后对样品进行质谱数据采集；

(4)将采集的质谱数据与数据库中的质谱数据进行比对，得出质谱评分，记录质谱评分及对应的微生物的种属，实现微生物的鉴定。

优选的，步骤(3)中，所述标准品由以下方法制备：将标准品溶液加到质谱靶板上，风干，再加入α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液风干即可；α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液浓度优选为10mg/mL。

更优选的，步骤(3)中，所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的浓度为10mg/mL。

本发明的有益效果在于：本发明公开了适用于MALDI-TOF检测的血培养阳性菌悬液处理方法，处理试剂成本低，处理流程简单，可以去除菌悬液中的杂蛋白，能够直接用于MALDI-TOF检测，能够解决传统技术耗时太长，不能在短时间给予临床可靠鉴定结果的缺陷，更好地指导临床抗生素的使用，减少抗生素的滥用。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为大肠埃希菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

图2为肺炎克雷伯菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

图3为铜绿假单胞菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

图4为金黄色葡萄球菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

图5为口腔链球菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

图6为粪肠球菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

图7为脆弱拟杆菌质谱采集数据及鉴定比对结果图(A：质谱采集数据图；B：鉴定对比图)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明使用的实验材料和设备如下：Bactec FX全自动血培养系统购自美国BD公司(美国)，含树脂需氧瓶、厌氧瓶和儿童瓶均购自美国BD公司(美国)，冰醋酸(CH₃COOH)购自重庆川东化工有限公司(中国重庆)，H-1微型混合器购自上海康禾光学仪器有限公司(中国上海)，Z36HK高速冷冻离心机(德国)，Microflex LX/SH全自动快速生物质谱检测系统购自德国布鲁克公司(德国)，标准品IVD BTS(大肠杆菌裂解蛋白、肌红蛋白、RNA酶)(购于德国布鲁克公司，货号：8290190)、甲酸、标准溶剂(乙腈50％、水47.5％和三氟乙酸2.5％)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)均购自德国布鲁克公司(德国)。

加样枪、50mL烧杯、EP管和去离子水实验室自备。

菌悬液处理液：体积分数10％的冰醋酸溶液。

质谱检测相关试剂：标准溶剂(乙腈50％、水47.5％和三氟乙酸2.5％)，体积分数70％的甲酸溶液，基质HCCA(10mg/mL)。

实施例1、血培养阳性瓶中微生物快速鉴定的方法

血培养阳性瓶中微生物快速鉴定的方法，具体步骤如下：

(1)血培养阳性菌悬液的收集：将血培养标本(均来自临床送检标本)收到血培养瓶后放入Bactec FX全自动血培养系统进行检测，仪器报阳性后，取出阳性血培养瓶，在生物安全柜中消毒瓶口，混匀后用注射器取1mL瓶中培养液，注入1.5mL EP管中制成菌悬液，待处理；

(2)菌悬液处理：在无菌条件下(生物安全柜)，向装有菌悬液的EP管中加入200μL体积分数100％的冰醋酸溶液，漩涡震荡混匀30秒；混匀后，放入离心机，在12000g条件下离心2min，完全去上清，向沉淀中加入1mL配置好的体积分数10％的冰醋酸溶液，用加样枪反复吹打，直到彻底混匀；混匀后，再次12000g离心2min，完全去上清，待检；

(3)质谱检测：按照试剂说明书，将50μL标准溶剂加入到装有标准品IVD BTS固体颗粒的管子中，配置成标准品溶液，取配置好的标准品溶液1μL加到质谱靶板上，风干，再加入1μL基质HCCA风干；将处理后的菌悬液沉淀，用无菌牙签反复搅动混匀后，挑取少许，均匀涂布于质谱靶板上，风干，再加入1μL体积分数70％的甲酸溶液，风干，最后加入1μL基质HCCA，风干；风干后，将靶板放入质谱仪，首先使用FlexControl软件，用标准品对仪器进行校准，校准通过后，再对样本孔进行质谱数据采集。

(4)鉴定：将采集的样本质谱数据通过Biotyper 3.0软件，与数据库中的质谱数据进行比对，得出质谱评分，记录质谱评分及对应的微生物的种属，达到鉴定微生物的目的。

该方法可有效鉴定肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、厌氧菌等细菌。根据质谱仪说明书，当结果评分大于2.3时，为高可信度的种水平，评分在2.0到2.3之间，为可靠的属，可信的种水平，当评分在1.7到2.0之间时，为可信的属水平，评分低于1.7时，结果不可信。

按照上述相同的方法检测大肠埃希菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图1所示。

按照上述相同的方法检测肺炎克雷伯菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图2所示。

按照上述相同的方法检测铜绿假单胞菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图3所示。

按照上述相同的方法检测金黄色葡萄球菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图4所示。

按照上述相同的方法检测口腔链球菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图5所示。

按照上述相同的方法检测粪肠球菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图6所示。

按照上述相同的方法检测脆弱拟杆菌，质谱采集数据及鉴定比对结果如图7所示。

从上述结果看出，本发明的处理菌悬液后能够用于血培养阳性菌悬液快速检测。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.适用于MALDI-TOF检测的血培养阳性菌悬液处理方法，其特征在于，包括如下步骤：将血培养阳性菌悬液加入冰醋酸裂解红细胞，离心去除上清，沉淀加入体积分数10％的冰醋酸溶液裂解红细胞，混匀后再次离心，去上清，沉淀即为待测物。

2.根据权利要求1所述适用于MALDI-TOF检测的血培养阳性菌悬液处理方法，其特征在于，包括如下步骤：将血培养阳性菌悬液中加入相当于菌悬液体积0.2倍的冰醋酸裂解红细胞，在12000g条件下离心2min，去上清，再向沉淀中加入体积分数10％的冰醋酸溶液，混匀，再次12000g离心2min，去上清，沉淀即为待测物。

3.基于MALDI-TOF快速鉴定血培养阳性瓶中微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将血培养标本收到血培养瓶后放入全自动血培养系统进行检测，仪器报阳性后，取出阳性血培养瓶，无菌条件下从培养瓶中取出培养液，制成菌悬液；

(2)将步骤(1)制成的菌悬液按照权利要求1或2所述的方法处理，制得待测物；

(3)将步骤(2)制得的待测物均匀涂布于质谱靶板上，风干，再加入体积分数70％的甲酸溶液，风干，然后加入α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液，风干；最后将靶板放入质谱仪，用标准品对仪器进行校正后对样品进行质谱数据采集；

(4)将采集的质谱数据与数据库中的质谱数据进行比对，得出质谱评分，记录质谱评分及对应的微生物的种属，实现微生物的鉴定。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述标准品由以下方法制备：将标准品溶液加到质谱靶板上，风干，再加入α-氰基-4-羟基肉桂酸基质风干即可。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液的浓度为10mg/mL。