CN117210413A - 纹带棒状杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种纹带棒状杆菌噬菌体及其应用，此纹带棒状杆菌噬菌体为纹带棒状杆菌噬菌体(Corynebacterium striatum phage)CSP1，保藏编号为CGMCC NO：45598，保藏时间为2023年7月4日，该纹带棒状杆菌噬菌体具有较强的耐受力、生物安全性且携带位点特异性重组功能元件(整合酶和重组位点)，同时能够裂解20株多重耐药纹带棒状杆菌，为后续利用所述纹带棒状杆菌噬菌体作为检验和治疗载体、靶向致病菌或共生菌、诱导免疫调节等医学研究奠定基础。

Description

纹带棒状杆菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种纹带棒状杆菌噬菌体及其应用。

背景技术

抗生素的大量使用会加剧多重耐药菌的传播和进化，耐药菌的耐药种类和强度扩大，可能会出现“超级细菌”，造成现有抗生素药物治疗失效。纹带棒状杆菌感染的对象一般为免疫功能低下人群(长期卧床病人、插管病人)，抗菌药物无法彻底治愈慢性感染或根除病原菌。

目前，尚无治疗多重耐药纹带棒状杆菌感染的指南。最佳的抗菌疗法仍被认为是有争议的。纹带棒状杆菌具有很强的变异性和适应性，可通过与医护人员或医院环境的接触在患者之间传播，易产生多重耐药性，可引起院内传播和爆发。此菌是造成严重的医院获得性肺炎HAP(Hospital-acquired Pneumonia)的主要原因，死亡率很高。其在痰液和分泌物样本中常见，分布于重症医学、神经内科、神经外科、骨科、肾内科、重症监护病房等科室。患者感染高峰期在夏季，疾病诊断主要与免疫功能低下人群相关。

纹带棒状杆菌在临床抗生素治疗中相继出现了对林可胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和复方新诺明高度耐药性。目前万古霉素作为治疗纹带棒状杆菌感染的首选抗生素，单药治疗或与哌拉西林-他唑巴坦联合使用。或者，利奈唑胺、替考拉宁或达托霉素可用于严重感染，而阿莫西林-克拉维酸可用于治疗由纹带棒状杆菌引起的轻度感染。在COVID-19大流行期间，纹带棒状杆菌的患病率增加，增加发生在呼吸道、血培养和表面样本中。且与多种多样不断变化的病原体一起出现，利福平耐药显著增加，但其他种类抗生素耐药性也发生动态变化，包括利奈唑胺。根据耐药性预测，到2030年，万古霉素很可能仍然是目前使用的唯一有效药物。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种纹带棒状杆菌噬菌体及其应用，解决目前尚无治疗多重耐药纹带棒状杆菌感染的指南的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种纹带棒状杆菌噬菌体，所述纹带棒状杆菌噬菌体为纹带棒状杆菌噬菌体(Corynebacterium striatum phage)CSP1，保藏编号为CGMCCNO:45598，已于2023年7月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体株的DNA基因组序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1是由SEQ ID NO.1’-8’合并而成。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体株可在含有生理浓度的氯化钠溶液中稳定有活性。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体株可在pH4-12的溶液中稳定有活性。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体株包括头部和尾巴，所述头部为20面体头部。

可选地，所述头部的直径为48-52nm，所述尾部的长度为240-250nm。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体株的DNA为双链环状。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体的基因组属于HK97型。

可选地，所述纹带棒状杆菌噬菌体的基因组上编码酪氨酸类型整合酶，且存在20bp的重组核心位点。

本发明提出一种所述的纹带棒状杆菌噬菌体在裂解耐药纹带棒状杆菌中的应用。

本发明提供的技术方案中，从医院环境，例如，厕所水洼和下水道中富集、纯化分离出一种纹带棒状杆菌噬菌体(Corynebacterium striatum phage)CSP1。该纹带棒状杆菌噬菌体具有较强的耐受力、生物安全性且携带位点特异性重组的功能元件(整合酶和重组位点)，同时能够裂解20株多重耐药纹带棒状杆菌，为后续利用所述纹带棒状杆菌噬菌体作为检验和治疗载体、靶向致病菌或共生菌、诱导免疫调节等医学研究奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例2中噬菌体株CSP1裂解20株临床纹带棒状杆菌分离株的图；

图2为本发明实施例3中噬菌体株CSP1在不同感染复数下的状态图；

图3为本发明实施例4中噬菌体株CSP1的一步生长曲线图；

图4为本发明实施例5中透射电子显微镜(TEM)下噬菌体株CSP1的形貌图；

图5为本发明实施例6中噬菌体株CSP1的基因酶切鉴定图；

图6为本发明实施例6中噬菌体株CSP1的基因组排布图；

图7为本发明实施例6中噬菌体株CSP1进化分析图；

图8为本发明实施例6中噬菌体株CSP1的质谱TIC图谱；

图9为本发明实施例7中噬菌体株CSP1在不同时间紫外线照射下的状态图；

图10为本发明实施例8中噬菌体株CSP1在不同pH条件下的状态图；

图11为本发明实施例9中噬菌体株CSP1对氯化钠和消毒水的敏感性示意图；

图12为本发明实施例10中噬菌体株CSP1在不同温度下的状态图；

图13为本发明实施例11中不同效价的噬菌体株CSP1与HEK293T(人类胚胎肾293T细胞)细胞孵育培养24h后细胞活力图；

图14为本发明实施例11中不同效价的噬菌体株CSP1与HEK293T细胞孵育培养12h后细胞活力图；

图15为本发明实施例11中不同效价的噬菌体株CSP1与A549(人类肺腺癌细胞系)细胞孵育培养24h后细胞活力图；

图16为本发明实施例11中不同效价的噬菌体株CSP1与A549细胞孵育培养12h后细胞活力图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

抗生素的大量使用会加剧多重耐药菌的传播和进化，耐药菌的耐药种类和强度扩大，可能会出现“超级细菌”，造成现有抗生素药物治疗失效。纹带棒状杆菌感染的对象一般为免疫功能低下人群(长期卧床病人、插管病人)，抗菌药物无法彻底治愈慢性感染或根除病原菌。目前，尚无治疗多重耐药纹带棒状杆菌感染的指南。最佳的抗菌疗法仍被认为是有争议的。纹带棒状杆菌具有很强的变异性和适应性，可通过与医护人员或医院环境的接触在患者之间传播，易产生多重耐药性，可引起院内传播和爆发。此菌是造成严重的医院获得性肺炎HAP(Hospital-acquired Pneumonia)的主要原因，死亡率很高。其在痰液和分泌物样本中常见，分布于重症医学、神经内科、神经外科、骨科、肾内科、重症监护病房等科室。患者感染高峰期在夏季，疾病诊断主要与免疫功能低下人群相关。纹带棒状杆菌在临床抗生素治疗中相继出现了对林可胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类和复方新诺明高度耐药性。目前万古霉素作为治疗纹带棒状杆菌感染的首选抗生素，单药治疗或与哌拉西林-他唑巴坦联合使用。或者，利奈唑胺、替考拉宁或达托霉素可用于严重感染，而阿莫西林-克拉维酸可用于治疗由纹带棒状杆菌引起的轻度感染。在COVID-19大流行期间，纹带棒状杆菌的患病率增加，增加发生在呼吸道、血培养和表面样本中。且与多种多样不断变化的病原体一起出现，利福平耐药显著增加，但其他也发生动态变化，包括利奈唑胺。根据耐药性预测，到2030年，万古霉素很可能仍然是目前使用的唯一有效药物。

鉴于此，本发明提出一种纹带棒状杆菌噬菌体，所述纹带棒状杆菌噬菌体已被送至中国普通微生物菌种保藏与管理中心保藏，地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类名纹带棒状杆菌噬菌体(Corynebacterium striatum phage)CSP1，保藏编号为CGMCC NO:45598，已于2023年7月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，具体地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供的技术方案中，从医院环境，例如，厕所水洼和下水道中富集、纯化分离出一种纹带棒状杆菌噬菌体(Corynebacterium striatum phage)CSP1(以下简称噬菌体株CSP1)。该纹带棒状杆菌噬菌体具有较强的耐受力、生物安全性且携带位点特异性重组功能元件(整合酶和重组位点)，同时能够裂解20株多重耐药纹带棒状杆菌，为后续利用所述纹带棒状杆菌噬菌体作为检验和治疗载体、靶向致病菌或共生菌、诱导免疫调节等医学研究奠定基础。

如图1所示，所述噬菌体株CSP1能够裂解的20株多重耐药纹带棒状杆菌分别为Cs-1、Cs-2、Cs-3、Cs-6、Cs-7、Cs-9、Cs-16、Cs-18、Cs-22、Cs-25、Cs-31、Cs-35、Cs-38、Cs-39、Cs-41、Cs-10、Cs-11、Cs-14、Cs-52、Cs-54。

所述纹带棒状杆菌噬菌体基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1是由SEQ ID NO.1’-8’合并而成(将SEQ ID NO.1拆分成多个基因序列是由于该基因序列过长，无法上传，拆分成多个序列便于上传，但是完整的基因序列，为如下基因序列)：

TGGGCGAATGAGCCGGCCTAATATTTGCCACCATTCCCCCGACCTTTTGTTTTTCTATAGCCGCAGGTCAAGAGTGTGCCACCTCCGCCACCTTTGCCACCTCCGGCAGGGTTGTCAGCCCGTTTGCGGGATCTTTGCGGGATCGGTGAATACGCCAAGTCTCCCCATTCGCCCCCATACCACCCCCATGTTGACGCGAAGCGCGACAGGGATTAATGTTAGTCATGTCAGAAAGAAAGAGACCGGCACAAAGCCAGTCCAAACCGGAAAGGAATCCGAAATGACCACCCTCACCTACTCCGCAGAGCTGGAACTCGCCAACAACGGAATCACCCACACCACCGCAACCATCGACACCTACGGCGACACCGCCGCAGAAGTCACCAAAGACATGCTCAACTTCTTCAACTCCCCCGACTATGAGGGCAGCCTGCAAGACTTCGAGGTCGTAACCCAGGAGGTCGACGAGGACTTTGCAGAGATCATCATCCAGGGCACCATCGCAGAAGCCGACGAGGACACCAACGAGGAAACCGAATACATCGCAACCGTCACCATCATTGGACGCTAAACCAACAGCCCCGGCCATACCGCCGGGGCGCACTTATATCACCATGGATATTTACGAAACCTCATATGACGAATACGGCCCCGAATGGCACGCCACCCTACCCGATGATGTGCGCAAGCCAGTATTCCCCCACAATCCAGCGCACGCCCCACGCAGTGGCCTAGCCCTACGCGTAGCCCGCGAATCATTAGGAATCAGTGCAGCATACCTAGCCGAATACCTAGGGGTAGGTAAGCGCACGGCAGAGCGGTGGGAGAAGCTCGATGAAATCCCCGGGTGGGTAGAAACTGCTCTCCGCAAAATCACCTTTGCTACCCAGGTGTGGGAATCGGATTTACAGGATGCTGGGCAGGTCATGATCCACACCGGCGGCTACCGCATGCTGGATGGTCGGCCACTACCTGAATCGTGGTGGATACACCTTGTGGGCCAGGCCATGCGCACTAATGCAACTATCATCCCAATCGCTGACTAAAAGCAGCCCTGCCGCCCCTGAGGTGGTGGGGTTTTCCTTTGATATAAACAATGTTTGCAACCCGGGTTGACACCGCAACCGGGATGGCATATAATGGGGTTGTAAGCAAGAAAAGGAGCAAAAAATGACCACCTACTACCGCATCCAGTCCCAGAACCGCCCCAACATCCTCGACCCGGAAAACCAGTACTCCTACTCCTGGAACGACCTGGGCGCAGACCCACGCCACGGCATCAGCGTCATGGACGACCGCGAATCCCTCGCAGAGTACATCGCCCAGACCGGCATCCAGTGGGACGAGACCTGGGAGCTGCTCGAAGTCGAGGGCACCACCTCCGAGGATGAGGACGAGGACGCACACATGGGGGCTCGCCTCATCATCCCCACCGCCATCATCTCCCGCGAGCCACTCACCGACGGCTTCATGGAAGAAATCTTCGATGCCTTCGAGCAGCTCGCAGCCTAACCCCCACCATCACAGAAAGGAGCACACAATGACCACCCAGACTTTTACCCTCCGAGATATAGCCATCGCCGCCAACGCAAAGCACGGAATGGACACCACGGCCGCTGAGGACATCGCCCGCACCTACCTTGACCAGATGGACGCTGAAGACGGTATTGAGCGCGATGAGGACGAAATCACCCAAGATGATTTCGATTTCCTGCTGGGCGCTATCGATTCCGCCCGCCGCGCCGGTGACCTCGGACTGCATGAGCTAGACCTGATTTCCGAGGCCGCGCTTGAAATGCAATCGCAGGAGGACAGGCTACGCGCCGCCCGTGATGAGCGTGACGCCGCTATCCGCGCCGCTGTCCACGCCGGGGCACGCATCCAAGATGTGGCCACCGCTGCGGGTATCTCCCGCCAAGCGGTAGACAAAATCATCCGCGCATGAAACCCGGCGACAAAGACGGACACGGCCGGTACGGCTACCTCGATGGTGATGATGCGCGCATCATCTGCCATGAGTGCGGGGGGCTGTACCGGGCGTTGGCCCCGCACCTTATTAAAGCCCACGACATGACCGCAGCAGAATACAAGCAAGCGCACGGGTTGCCACGCGGCATGGGGCTAGTAGCCCCTGAGACGAGGCGCGCCAAGTCACGCCAAGCCCTAAGCCATGTGGGTACACCGGAGTGGGATCGGATGGTAGAAAAGCGCGACCCCACAGCCGCATCACACGCCCGAACAGAAGAGTCATTCACCACCCGTGGTGTGGTTGCTGAGCAGAAAACAGCGACGGCGCGAGAAAACATCAAAGGGGTGAAAAAGCCTGTCACACGCCGCTGTATAGTCTGCGGAAAGCTGCTTACTGAGGTGCGCGGGCGCGCCACATGTAGCGACCGGTGCTATCGCATTCAGCTGTATGAGCGGACCGCGAAGCCAGGCGCGAGGGCATGGATGCAGCGCCGAGACGCGGGCGAATCACTATCGGAGATAGGACGTAGCGCGGGCGTATCCCATGTGGCGGTGCGGGTGCGGATTGAGAGATTCCGGGCCTATCTCAGCTTGTGCGAAGAGCTTGGGCGCACACCTATAGAGTAAAACGACGAAAAGACCCCCACCACAAGGGGTGAGGGTCGGTAGTTACTTCTGTGTCGTCTCCGGGTATTTTTGCTTTATCCACTCCGGGTAGCTCATGAATGGTGGCGGCGGTAGCGTCAGGCCCTTATCTACCGCCCAGAACTCCAAGCCGCGCCACAAACCAGCAACCCACAATTGATACTCATGGTGTCGGGATTCTTTCGTCCGCAGCTCAGCCACTTCCCTATCGAGGCGCTGGATTGTTTTCTCCAGGCGGTCTAGGCGGCGGGCGTCGCTGGCTTCATCCGCGGCGATAGCGTCCTCTTTGTGCTGGCGTATAGCGCGGGCCGCTTTACCAAAGATACCGCCATAGTCCGCCGCGGCCTTAGACATCAACCCTGAGACCAGGGCGAGGATGATGAGGATGGTGAGGAGGAAGCCGCCCGGCGTCCTAGAGTTGGTGAGGAAGCTAAGCAGATCTGTGGTCTCCATCCTTCCCCTTCCTATGCTTGATTACGGCGATCCGTATCGTGAGTGACCACGCGATCACAGCCCACATGAACGCGGCGGAAATATACCCGGTGAAGAATCGCCAATCATCCACTGGCCCTTGCATGTACACGTCATCGAAGACCATCACGGCGAAAGCGCCGTAGATCGCGGCGGCGAGGACAGCCCCGGCGCGCACAATCCGTGGGCACTGTTTTAGTAGCCCGATAGCGACGATGAGGGCTGCGATGATACAGGCCGCACCCCACACGACAGGCGGGGTAACATCACGAACACGGAACGCGCCCACCCCCTGGTTTGGGTTGCCGAGGATGTAATCCATGCCTCGCGAAAGCATCTGAAATGCGAGCGCCCCGATAATGCATTGAAGCGTGCGAGTCATCATGCCTCGTTGGTGGTGGGGCCGGTGTAGACCGGCAGAGTTGCGAGCTGCGGGGCGGTTTTCTGCTCCTGGTATTCTGCTTGGGTTGCAAGGCGCGGCGCCATGCTTGGGGTGACACCATCGACGGTGAGCCGGTTGACTAGCGCGGTGATGAAATAACCGATTGCGCCAGCCGCAAAAATAGTCCATTCCGGGGCATCTGCAAGCATGACGGGCAGCGCGCCAGCGACCCACGCTAGGGCCTGCAAAGCAAGCATGATTGAGCCTTTGTAGCGTAGCCACCACGGCTGCTCCCTAAGCTCCGCTGCTACCGCTACTGCGATGCGCCCCGAAACGTCGTTAATCAGGGCTTGATTGTAGTGACGTGCCATTACTTCTTGCCTCTCTTGATTCCGTTCACGTCTGCCTGGATTTGTGCGAGCTGCTGGCGGATAGCCGCGAGCGCGTCCACCGGGGTGAGGTTCTGTCCCTGCGCGTTTTGGCCTAGCTGCTCCCAGCCTTTGCCGCCGGGGCCGCGTAGCTGAGTCCAGATTTCCTGAATGGCCTTAATCTGAGGACCTAAATAGCCGGTCAGAAAGTCGGTGAAAAATTTAGTGGTCATTTCTTCTCCCTCATGATGTTGTTTACCTCCGTAGAACAGGGCGCGTAGCTCATCCCGGCTGCCGCGGTAGGCGTTGATGTCCACGTTGTAGCCCGCAACCTGCGCATTGCTGCCGTATTGCCACAGTGCGGGTTTTTGATTGCCGAGCGGGTAGTCCCACTGGCTAGCGCTGTCGCCGGGGTAAATATTGGCTGGCGTGCCTGTGCGGTTTGACCCGTGGGCCGCGACCCAGAAAGCGCCGAACTCGTGGCTGTCCGGCTCGCCGGGGGCGATGCTGCCCTCCCAATACGGCACGTAGGAATACGCGCCGATAACGCGCACGCCGCGGCGCTCAAACTCGCGCTTCGCTTCGCGGATGTGGTCAACGTGCAAACCGGCGGGCGTCTCGCAATCAAGCCACATGGGGCGTTTCTTGTCGCCCATGACTTCAAGTGCTGCCTGTACCTGCTGCGCTATGGTGGTGCCCTCGCTAGGGTTGCGGAGATAGTGATACGCCGCCGTGATTAGGCCCGCGCTCTCCGCGTCATCAAGGTGAGAACGATAGCAGCGATCCTTATAGGTGCCGTCCGTGGTGCGGATAATCGCGAAGTCAATCCCCTCACTGGCGGCGCGTTTCAGGCTCATTCCGTCCTGGTGAGAAGATACATCCACGCCGAAAATAGTGCCGTCCCGCTTCCCCACAGGGCGAGCGGTGGACTCGCCGGGCCACTTCGCACCACGTAGAACCTGCTGCGGGTCGAGAATCGTTTGCCCCACTACTCGCTGGCCCGGGCCAACCCACGAGTACTTATACACCTCAATGTGTAGGTGAGGGGCCACACCGCCGTTAGTTGCCGAGTTAGGATTAATCCTGCCGATACGCTGCCCCTCACGCACCTGCTGCCCCTCACGAACTTCGGGGATAATATGCCCGTAGACTGACTCATTACCCCC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将所述噬菌体株CSP1噬菌体的基因组序列(SEQ ID NO.1)在NCBI数据库中blast(BLASTn)。结果显示，所述噬菌体CSP1与纹带棒状杆菌216株(Corynebacterium striatumstrain 216)具有最高的序列相似性，覆盖度为82％，序列一致性高达95.31％。其次是温和型噬菌体IME1320_01，序列覆盖度为41％，序列一致性为92.16％。

在本发明的技术方案中，所述纹带棒状杆菌噬菌体可在含有氯化钠的溶液中有活性，相较于在含有消毒剂戊二醛的溶液中，在含有氯化钠溶液的培养基中活性状态更稳定，优选地，氯化钠的浓度为0.9％时，即在人体生理盐浓度下所述噬菌体株CSP1保持效价稳定。

进一步地，所述纹带棒状杆菌噬菌体株可在pH4-12的培养基中有活性，状态稳定，当pH的值为4或12时，所述噬菌体株CSP1的效价下降了大约一个数量级。

如图4所示，所述纹带棒状杆菌噬菌体株包括头部和尾巴，所述头部为20面体头部，进一步地，所述头部的直径为48-52nm，所述尾部的长度为240-250nm。

如图5所示，所述噬菌体株CSP1为环状双链DNA，进一步测序后进行序列分析确定所述噬菌体株CSP1的环状双链DNA为HK97型。所述噬菌体株CSP1属于HK97型，是一个非常适合研究壳聚体组装的系统，在其自然宿主中表达HK97门蛋白、蛋白酶和主要衣壳蛋白基因会导致组装壳在不同的组装阶段大量产生。目前有学者提出噬菌体形成三个多源进化谱系(PRD1-like,HK97-like和BTV-like)，其中有尾噬菌体属于HK97-like。

如图6所示，所述噬菌体株CSP1的基因组上编码酪氨酸类型整合酶(Tyrosine-type recombinases/integrase)，存在20bp的重组位点(Attachment site,att:TGGGCGAATGAGCCGGCCTA)。

本发明提供一种所述的纹带棒状杆菌噬菌体在裂解耐药纹带棒状杆菌中的应用。

所述的纹带棒状杆菌噬菌体具有所述纹带棒状杆菌噬菌体的全部有益效果，在此不再一一赘述。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实验材料

所述噬菌体株CSP1的样品最初采集于湖北省襄阳市中心医院的下水道和厕所的水洼处；

半固体LB：10g/L Tryptone、5g/L Yeast extract、5g/L NaCl、7g/L Agar。

200μL SM Buffer：pH7.5，200mM NaCl、10mM MgSO₄、50mM Tris-HCl。

实施例1噬菌体株CSP1的分离、纯化、浓缩

本发明中所述噬菌体株CSP1的样品最初采集于湖北省襄阳市中心医院的下水道和厕所的水洼处，采集液体和固体(淤泥)状态的样品总共8份。对于液体样本首先低速4℃离心后，用0.22μm滤器过滤，得上清液；对于固体(淤泥)样品，加入无菌的PBS溶液搅拌混匀1h后离心，处理过程同液体状态样品，获得上清液。

噬菌体的富集：每份样品取20mL上清液，分别加入至100mL对数期混合好的临床纹带棒状杆菌菌液中，于37℃、200r/min振荡培养10h，12000r/min离心5min收集上清并过滤，重复3次完成环境中噬菌体样本的富集。

噬菌体初筛：分别取50μL宿主菌(Cs-11)与4mL半固体培养基混合后倒双层平板，凝固后，分别吸取2-3μL已富集的8份样品的滤液点在双层平板上，30℃条件下培养过夜。次日，观察有无噬菌斑产生。

噬菌体的分离：用无菌牙签沾取双层平板上的独立、清晰的噬菌斑于1mL液体无菌培养基中，在涡旋振荡混合均匀后进行10倍梯度稀释至10^-6，分别取原液和各梯度稀释液100μL与50μL宿主菌混合倒双层平板，37℃培养箱培养过夜，观察双层平板上噬菌斑。重复此步骤至少3次，直至同一双层平板上得到噬菌斑外观形貌和大小基本一致。

噬菌体的浓缩：可使用超滤浓缩法或PEG浓缩法

超滤浓缩法的步骤为：取20mL噬菌体过滤原液转移到50mL超滤离心管(15mL，10KDa，Millipore UFC901096)中，3000rpm、20min低速离心；当浓缩的超滤管中只剩1500μL时，继续加入待浓缩的噬菌体液。重复离心，可以根据体积浓缩30倍左右；从超滤管中取出最终的噬菌体浓缩液，注意冰上操作，用黄枪头(200μL)取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打，混匀噬菌体液。注意吸取浓缩液切勿触碰到超滤膜，管底剩下的少量浓缩液用10μL枪头吸取，吸不干净的残液可弃去。

PEG浓缩法的步骤为：取20mL噬菌体过滤原液转移到无菌的离心管中，至室温。加入NaCl至终浓度为1M，混合物溶解并在冰上放置1小时。4℃，11000rpm离心15min。而后收集上清液于干净的离心管中，加入PEG 8000(终浓度为10％(W/V))。通过磁力搅拌珠慢慢搅拌至PEG 8000缓慢溶解(冰上搅拌1h或4℃过夜)，处理后的混合物于4℃下11000rpm离心2h，回收含有噬菌体颗粒的沉淀(离心结束迅速弃上清，倒扣在铺好的厚卫生纸上，将有沉淀颗粒的地方用记号笔圈出)。加入200μL SM Buffer(200mM NaCl、10mM MgSO₄、50mM Tris-HClpH7.5)浸没沉淀，冰上放置过夜(如果沉淀少就加入100μL SM Buffer；沉淀多则增加至500μL)，次日重悬吹打混匀后即为浓缩的噬菌体液(噬菌体株CSP1溶液)。

实施例2稀释点板法检测噬菌体株CSP1宿主谱

1、分装菌液：分别吸取活化后的52株Cs(多重耐药纹带棒状杆菌)菌液50μL至10mLEP管中，每种菌分装3管(即3次平行)；

2、制备点板的上层半固体LB和细菌混合物：上述含菌液的10mL EP管中加入5mL的半固体LB培养基，立即将混合物倒入固体LB底板上，均匀铺开；

3、噬菌体株CSP1上清点板：将噬菌体株CSP1上清稀释成不同梯度(即100～10^-4)，分别吸取2μL噬菌体株CSP1原液及稀释液点板于不同Cs菌株的双层平板上。

4、观察稀释点板结果：观察待检Cs菌株双层平板上产生的空斑情况，如图1所示。

实施例3噬菌体株CSP1最佳感染复数(MOI)的测定

活化和转接菌株：分别吸取不同Cs菌液50μL至5mL液体LB试管中，放入37℃摇床中培养至对数中期(OD₆₀₀nm：0.8～1.0)，再转接50μL至5mL液体LB试管中，3h后测菌液的OD₆₀₀nm数值(即取1mL上述菌液加入比色皿中测量菌液的OD₆₀₀nm数值)。根据Cs菌株的生长曲线，计算OD₆₀₀nm数值下细菌的个数。

不同比例的噬菌体株CSP1和菌液混合：根据噬菌体株CSP1效价和菌液中细菌个数，设置MOI比值分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100。噬菌体株CSP1(1mL)和菌液(1mL)混合物接入100mL新鲜的LB液体培养基中，37℃培养8小时后测噬菌体株CSP1的效价。噬菌体株CSP1效价计算公式为：CSP1的效价＝双层平板上CSP1噬菌斑数目*稀释浓度*10。通过测噬菌体株CSP1效价的方法来计算哪一种MOI比值下噬菌体株CSP1的释放量最高，即为最佳感染复数，如图2所示。

其中，噬菌体效价的测定方法：用于测定效价的CSP1需要使用0.22μm滤器过滤除菌。首先准备好固体LB底板；将不同稀释梯度的CSP1上清100μL与50μL菌液加入4.5mL EP管中混匀后，再加入4mL半固体LB培养基(温度50-55℃)后一同倒入已准备好的固体LB底板中，均匀铺开。待培养基凝固后，转移至37℃培养箱培养12h，通过观察、计数双层平板上的噬菌斑的数量来表征噬菌体株CSP1的效价(pfu/mL)。

Multiplicity of infection(MOI)是指在病毒感染的实验条件下，给定的细胞中存在的病毒颗粒数量与该细胞数量之间的比率。通常用于描述病毒实验的感染程度和效率。例如，如果在一个含有100个细胞的培养皿中加入100个病毒颗粒，则MOI为1，这表示每个细胞平均被感染了1个病毒颗粒。

实施例4噬菌体株CSP1一步生长曲线的测定

在噬菌体株CSP1最佳MOI的基础上，探究CSP1在扩增过程中的爆发点的时间。

噬菌体株CSP1吸附细菌：将CSP1和Cs-11菌液以最佳MOI(MOI为0.1)的比值加入液体LB中，37℃培养30min后，使用高速离心管13000rpm离心20分钟后弃上清，去除未吸附的噬菌体株CSP1。

洗涤重悬菌体沉淀：用新鲜的液体LB洗涤沉淀两次，然后将沉淀吹打重悬在新鲜的液体LB中，并在37℃摇床中继续培养。

取样测效价：将重悬后的培养物每隔10分钟取一次样(1mL)测效价，持续时间为100min，即11次样品(其中重悬后培养前取样作为0时刻)。取出样本通过13000rpm离心5min后，用0.22μL的滤菌器过滤。测定噬菌体株CSP1的效价，可设置如下噬菌体株CSP1稀释梯度10⁰-10^-6。37℃培养12h后查看双层平板上噬菌斑的个数，从而确定哪一个时间段是噬菌体株CSP1的爆发期，结果如图3所示。

其中，噬菌体株CSP1效价的测定方法与实施例3中的类似。

实施例5噬菌体株CSP1形貌观察

取10μL PEG浓缩后噬菌体株CSP1滴于干净的保鲜膜上，将300-mesh carbon-coated nickel grids置于液滴上，2min后取下镍网，用滤纸从镍网侧面将多余液体吸干。取10μL 2％磷钨酸滴于封口膜上，将沾有CSP1的镍网置于磷钨酸液滴上，1min取下，再用滤纸从侧面吸干多余染液，将镍网放在滤纸上自然干燥，正面朝上，室温下放置15-20min。用透射电子显微镜在80KV显微镜配套软件观察噬菌体株CSP1形态并拍照，如图4所示。

实施例6噬菌体株CSP1基因组提取和鉴定

噬菌体株CSP1基因组提取：使用试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit(全式金Code#ER201-01)。200μL的噬菌体株CSP1浓缩样本(效价达到10¹⁰以上，最好达到10¹⁴)中加入0.8μL DNase酶、2μL RNase酶和4μL Dnase buffer酶消化4h，PCR仪37℃控温孵育。吸取20μL Proteinase K于一个无菌的1.5mL离心管中，加入200μL BB5，涡旋混匀微离15秒，在离心管中加入已上述酶消化处理过的200μL噬菌体株CSP1样本，涡旋混合微离15秒，56℃孵育15分钟。放至室温后加入250μL无水乙醇(此时可能会出现絮状沉淀)，涡旋混合微离15秒，室温放置5分钟，将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000rpm离心1分钟，弃掉流出液。(如溶液总体积>650μL，可分成两次上柱)，向离心柱加入500μL WB5，12000rpm离心1分钟，弃掉流出液，重复前一步骤一次(再向离心柱加入500μL WB5，12000rpm离心1分钟，弃掉流出液)，室温12000rpm离心1分钟，彻底去除残留的乙醇开盖晾2分钟，将离心柱转入一个新的1.5mL RNase-free的离心管中，并向离心柱中央加入35μLRNase-free Water，室温静置2-5分钟，室温放置12000rpm离心2分钟，洗脱DNA。

提取出来的基因组跑胶检测：制作0.7％的琼脂糖凝胶跑胶上样，跑胶上样5μL噬菌体株CSP1基因组+2μL 5×Loading Buffer，5μL的15K maker作为指示标尺，跑胶110V45min，跑胶后扫胶保存图片。将噬菌体株CSP1基因组DNA置于-20℃或-70℃保存。

核酸类型鉴定：取噬菌体株CSP1基因组8μL，分别在不同20μL酶切体系中加入0.5μL DNaseI、0.5μL RNase A、0.2μL(0.1μg/μL)绿豆核酸酶、0.5μLExonuclease III(ExoIII)，除了绿豆核酸酶体系是30℃消化30min外，其余酶都是37℃水浴1h。从而分别判断噬菌体株CSP1基因组类型和基因组结构(Exonuclease III消化线性DNA片段；绿豆核酸酶消化单链DNA)，结果如图5所示。

限制性片段多态性分析:取噬菌体株CSP1基因组8μL，分别在不同20μL快速限制性内切酶的酶切体系中加入BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、XbaI、SalI、MluI、NdeI对噬菌体株CSP1基因组进行酶切处理，37℃孵育2h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果如图5所示。

基因组测序：将提取的噬菌体株CSP1基因组随机打断为约500bp片段，收集所需长度的DNA片段，之后使用NEB标准建库试剂盒选择特定接头，对样本进行文库制备并使用aglent2100检测文库片段大小，qpcr检测文库摩尔浓度。库检合格后Illumina NovaSeq进行PE 2*150测序。本次测序属于高深度测序(Ultra-deep NGS)。项目采用Spades软件用于序列拼接。得到的矫正后最终结果作为标准序列。统计cleaning数据mapping率，序列如SEQID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1是由SEQ ID NO.1’-8’合并而成。

基因组注释和分析：得到的校正后最终的序列基于现在的NCBI nr数据库进行了最新的注释，并且基于KEGG数据库、NCBI数据库进行了逐一人工复核和校对。注释时蛋白全长覆盖度达到80％以上、相似度不低于60％(最好是不低于80％)，取用该注释信息，否则认定为新蛋白(hypothetical protein)，结果如图6所示。。对于噬菌体株CSP1基因组的进化分析，采用VCTOR在线分析(https://ggdc.dsmz.de/victor.php)，结果如图7所示。

噬菌体株CSP1蛋白质谱分析：

噬菌体株CSP1蛋白样本制备：取纯化浓缩后的噬菌体株CSP1溶液500μL，首先10000rpm/min离心3min，去除沉淀，在上清中加入50μL 5×SDS loading buffer(含DTT)，混合后95℃加热10min，保存于-20℃。

制作SDS-PAGE蛋白胶：噬菌体株CSP1质谱分析所用10％的蛋白(分离)胶(成分如表1所示)，无堆积胶。跑胶后用考马斯亮蓝染液显色。即取蛋白样20μL上样至分离胶孔内(共上了8个孔)，跑胶电压和时间分别为80V、40in。跑胶完成后加入考马斯亮蓝染液染色，染色后用去离子水清洗两遍，切取显色位置的蛋白胶块。送北京维百奥生物科技有限公司进行质谱分析鉴定，包括样品胶内胰蛋白酶消化解，使用液质联用串联质谱进行分析鉴定(HPLC:Dionex Ultimate 3000RLSCnano System,MS/MS:Orvitrap Exploris480，ThermoScientific)。利用Proteome Discoverer 2.0产生MS/MS峰值列表，最小信噪比为1.5。所有的串级谱图通过X！Tandem V3.0(GPM Furry,Craig and Beavis,2004)搜索引擎进行数据库(噬菌体株CSP1 fasta文件)检索。

表1

实施例7噬菌体株CSP1对紫外线敏感性的测定

准备一系列无菌平皿，将噬菌体株CSP1 1mL倒入无菌平皿(开盖)，在超净工作台中(内部尺寸L*D*H:1340mm*540mm*545mm)垂直于紫外灯(30W)下水平放置(同一位置)。依次测定0，2，4，6，7，8，10，15min，不同紫外灯照射时长处理后的噬菌体株CSP1效价(每组重复三次实验)，结果如图9所示，其中，效价的测定方法类似于实施例3。

实施例8噬菌体株CSP1对pH敏感性的测定

配置不同pH的培养基：将1M的氢氧化钠溶液和盐酸溶液用于调节培养基的pH，分别配置2.0-12.0的pH，分别分装至5mL试管(灭菌后pH变化不明显)；并分装5mL未调节pH的培养基于试管中，灭菌后作为对照组。将噬菌体株CSP1分别加入不同pH的液体培养基中孵育，即50μL噬菌体株CSP1上清加入5mL不同pH的液体培养基试管中37℃1h后，与宿主菌混合孵育，倒双层平板确定噬菌体株CSP1效价(每组重复三次实验)，结果如图10所示，其中，效价的测定方法类似于实施例3。

实施例9NaCl浓度、消毒剂对噬菌体株CSP1效价影响

将待检测的噬菌体株CSP1原液以1％的比例分别加入至0.9％的NaCl溶液、2％的戊二醛中，分别室温孵育1h。将处理后的噬菌体株CSP1及其稀释液与宿主菌混合孵育后，倒双层平板检测噬菌体株CSP1效价(每组重复三次实验)，结果如图11所示，其中，效价的测定方法类似于实施例3。

实施例10噬菌体株CSP1对温度敏感性的测定

将噬菌体株CSP1放入不同温度的水浴锅中：将1mL的噬菌体株CSP1上清加入1.5mL的EP管中，并分别放入-40℃、-20℃、4℃、25℃、37℃、42℃、55℃、60℃中，37℃培养1h后，每组重复三次实验，使用双层平板法测噬菌体株CSP1的效价。观察噬菌体株CSP1测效价结果：通过上述的倒双层平板测噬菌体效价的方法来计算噬菌体株CSP1在不同温度的溶液中培养后效价变化情况，来判断噬菌体株CSP1在不同温度的溶液中活性情况(噬菌体株CSP1稀释梯度为10^-2、10-4、10^-6、10^-8、10^-10)(每组重复三次实验)，结果如图12所示，其中，效价的测定方法类似于实施例3。

实施例11噬菌体株CSP1毒性测定

使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(GLPBIOGK10001)试剂盒。在96孔板中接种100μL细胞悬液HEK293T或A549(5000个细胞/孔)，每孔加入10μL待测物质(不同效价的噬菌体株CSP1)。噬菌体株CSP1初始效价是3×10¹²pfu/mL,依次稀释4个梯度，每个梯度噬菌体株CSP1数量即为3x10¹⁰、3x10⁹、3x10⁸、3x10⁷。对照组为100μL细胞悬液与10μL LB混合液。将96孔板在细胞培养箱中培养孵育12h或24h，加入CCK8 37℃孵育1h后测OD₄₂₀。(每组重复三次实验)，结果如图13-16所示，其中，效价的测定方法类似于实施例3。

结果

1、稀释点板法检测噬菌体株CSP1宿主谱

通过图1可以看出，所述噬菌体株CSP1能够裂解Cs-1、Cs-2、Cs-3、Cs-6、Cs-7、Cs-9、Cs-16、Cs-18、Cs-22、Cs-25、Cs-31、Cs-35、Cs-38、Cs-39、Cs-41、Cs-10、Cs-11、Cs-14、Cs-52、Cs-54。

2、噬菌体株CSP1最佳感染复数(MOI)的测定

如图2所示，所述噬菌体株CSP1的最佳MOI值为0.1。

3、噬菌体株CSP1一步生长曲线的测定

如图3所示，一步生长曲线显示噬菌体株CSP1潜伏期约10min，裂解期为30min，释放噬菌体CSP1效价为10⁹pfu/mL。

4、噬菌体株CSP1形貌观察

如图4所示，该噬菌体株CSP1在双层平板上能形成直径1-1.5mm的噬菌斑；透射电子显微镜下观察此噬菌体呈现出20面体头部(直径约50nm)、细长尾巴(长约245nm)。

5、噬菌体株CSP1基因组提取和鉴定

如图5和6所示，提取浓缩后的噬菌体株CSP1基因组，酶切分析为环状双链DNA(图5)，进一步测序分析确定为具有39752bp的双链环状DNA基因组，属于HK97型。预测编码61个开放阅读框(orf)和1个tRNA(tRNA-Lys)。噬菌体株CSP1基因组上编码酪氨酸类型整合酶(Tyrosine-type recombinases/integrase)，存在20bp的重组位点(Attachment site,att:TGGGCGAATGAGCCGGCCTA)(图7)。将噬菌体株CSP1的基因组序列(SEQ ID NO.1)在NCBI数据库中blast(BLASTn)。结果显示，噬菌体株CSP1与纹带棒状杆菌216株(Corynebacterium striatum strain 216)具有最高的序列相似性，覆盖度为82％，序列一致性高达95.31％。其次是温和型噬菌体IME1320_01，序列覆盖度为41％，序列一致性为92.16％。挑取NCBI中blast相似度最高的前三位物种(已知噬菌体)的序列，运用VICTOR软件分析表明噬菌体株CSP1属于Siphoviridae长尾噬菌体科，是不同于IME1320_01的新种，如图7所示。噬菌体蛋白质谱分析鉴定到32个可信的噬菌体蛋白，如图8所示的双份样品质谱TIC图谱。

6、噬菌体株CSP1敏感性的测定

如图9-11所示，发现在紫外照射下0-10min，40℃-55℃孵育1h，效价仍保持稳定；在0.9％ NaCl和2％戊二醛溶液中孵育1h，只有在氯化钠溶液中保持效价稳定，而2％戊二醛中丧失活性；在pH5-11中稳定，pH4和pH12时效价下降了大约一个数量级；不同效价的噬菌体株CSP1与HEK293T、A549细胞孵育培养12h、24h，CCK8试剂盒测定细胞活力，如图12-15所示，表明噬菌体株CSP1对细胞无毒性。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体为纹带棒状杆菌噬菌体(Corynebacterium striatum phage)CSP1，保藏编号为CGMCC NO:45598，保藏时间为2023年7月4日。

2.如权利要求1所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体株的DNA基因组序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1是由SEQ ID NO.1’-8’合并而成。

3.如权利要求1所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体株可在含有生理浓度的氯化钠溶液中稳定有活性。

4.如权利要求1所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体株可在pH4-12的溶液中稳定有活性。

5.如权利要求1所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体株包括头部和尾巴，所述头部为20面体头部。

6.如权利要求5所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述头部的直径为48-52nm，所述尾部的长度为240-250nm。

7.如权利要求1所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体株的DNA为双链环状。

8.如权利要求7所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体的基因组属于HK97型。

9.如权利要求1所述的纹带棒状杆菌噬菌体，其特征在于，所述纹带棒状杆菌噬菌体的基因组上编码酪氨酸类型整合酶，且存在20bp的核心重组位点。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的纹带棒状杆菌噬菌体在裂解耐药纹带棒状杆菌中的应用。