CN109735459B - 白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药品微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法。白色念珠菌适用性试验菌株仅包含一定量的白色念珠菌。本发明均匀性、稳定性符合适用性试验菌株要求，菌株所含菌数在适用性试验标准要求范围内，最大程度满足药品微生物检测过程中适用性试验、促生长试验等需要，样品的制备方法，工艺简单，成功率高。

Description

白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种白色念珠菌适用性试验菌株及其制备方法。

背景技术

介于药品的特殊性，药品微生物学检验领域的非常特殊，要求每次检测之前培养基等供试品均需进行适用性检查，对试验用菌株有规定的浓度范围要求。目前已有的纯菌株大多数未进行定量，仅可供定性使用，仅有少数的定量菌株。对于该类定量菌株，均匀性和稳定性尤为重要，现有的定量菌株存在稳定性差，且菌含量较高，无法满足试验要求，运输条件要求较高等问题。

白色念珠菌是一种真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道等部位，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。如果制备的白色念珠菌样品中，白色念珠菌易发生变化(繁殖和死亡等)，就会导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性差。因此，综合考虑细菌的生化特性，选取性质相对稳定的白色念珠菌对保证样品的均匀性和稳定性十分重要。白色念珠菌样品制备的工艺技术要求比较高，并且样品的均匀性和稳定性与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。

药品中白色念珠菌指标，直接影响药品的卫生质量与安全。因此，制备均匀性与稳定性俱佳的白色念珠菌适用性试验菌株，可以避免致病风险。如果药品中存在白色念珠菌，极易对患者造成感染等，直接威胁患者的生命。白色念珠菌检验的随意性和不确定性，真实地反映检测实验室的能力，这对提高实验室质量控制水平，保障药品安全，甚至打破国际贸易壁垒、提高我国药品国际竞争力都具有特殊重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种满足药品微生物检测过程中适用性试验要求的具有一定含量范围的白色念珠菌适用性试验菌株；同时，克服白色念珠菌适用性试验菌株中总的活的细菌数目在运输、储存和测试等过程中菌落数都可发生变化的问题，本发明的另一个目的是提供该适用性试验菌株的制备方法，工艺简单，成功率高。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：白色念珠菌适用性试验菌株，其特征是：仅包含一种目标菌：白色念珠菌，目标菌的目标浓度为500～2000CFU/支，每支装有0.2g的冻干粉。

所述样品属药品检查中适用性试验用菌株，应用于药品微生物检测过程中适用性试验。

所述适用性试验菌株以海藻糖、明胶和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、明胶体积分数为1％。

白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的配制、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验、样品定值五个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌液分装—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：

(1)菌株复苏传代

将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在30～35℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；

(2)增菌

目标菌培养至对数生长期末，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成菌液；

(3)菌液分装

将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，配制100mL菌液，将此菌液置于磁力搅拌器上不断搅拌下平均分装到菌液储存瓶中，每瓶5mL，共20瓶，置于液氮中保存备用。

(4)菌悬液配制

按目标菌的目标浓度500～2000CFU/支，取适量上述5mL菌液与1500mL冻干保护剂混合，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶(西林瓶)中，0.3mL/瓶，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；

(5)冻干和包装

将装有菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；

(6)储存

将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。

所述冻干保护剂为含有海藻糖和明胶的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖10％，明胶1％；一次性配制相同浓度的菌液，可重复制备多批次相同量值范围的适用性试验菌株。

所述样品的均匀性和稳定性试验按照均匀性和稳定性试验参照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。

本发明菌种的选择采用白色念珠菌作为目标菌。

本发明的白色念珠菌适用性试验菌株具有以下优势特性：是一种具有一定满足检测方法要求浓度含量的适用性试验菌株，并且从样品稳定性着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究，使活的微生物、数量不发生变化、生化特征不发生变异，从满足特殊运输的条件，形成一套完善的适用性试验菌株制备技术，适合于白色念珠菌适用性试验菌株的制备。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明并不局限于具体实施例。

实施例1

白色念珠菌适用性试验菌株，仅包含一种目标菌：白色念珠菌，目标菌的目标浓度为500～2000CFU/支，每支装有0.2g的冻干粉。所述适用性试验菌株以海藻糖、明胶和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、明胶体积分数为1％。

所述样品属药品检查中适用性试验用菌株，应用于药品微生物检测过程中适用性试验。具体试验过程步骤如下：

样品开启后，立即加入2mL无菌水进行再水化，涡旋震荡充分混匀，取100μL接种到待测的液体培养基或涂布到待测培养基上，30～35℃培养3～5天。观察其生长是否良好，菌落大小、形态特征是否一致。若生长良好，菌落大小、形态特征一致，则说明被测培养基和方法适用于供试品检查，反之则说明被测培养基或方法不适用于供试品检查，应按照方法进行进一步处理措施。

实施例2

如图1所示，一种实施例1中白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法，包括样品添加菌株的配制、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验、样品定值五个步骤，具体步骤如下：

1、样品添加菌株的选择

仅包含一种目标菌：白色念珠菌，所述菌株均购于政府指定的机构，并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性。

2、冻干保护剂的配制

样品以海藻糖、明胶和无菌水为基质(体积分数：海藻糖10％、明胶1％)配制冻干保护剂。

3、样品冻干

(1)菌株复苏传代

将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在30～35℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；

(2)增菌

目标菌培养至对数生长期末，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成菌液；

(3)菌液分装

将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，配制50mL菌液，将此菌液置于磁力搅拌器上不断搅拌下平均分装到菌液储存瓶中，每瓶5mL，共10瓶；

(4)菌悬液配制

按目标菌的目标浓度500～2000CFU/支配制，取适量上述5mL菌液与1500mL冻干保护剂混合，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶(西林瓶)中，0.3mL/瓶，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；

(5)冻干和包装

将装有菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数按如下设置：

冷冻速度(Cooling Rate)0.5℃/min

早期冷冻点(Incipient Freezing Point)-1℃15min

冷冻温度(Cooling temperature)-40℃

共熔点(Melting Point Eutectic temperature)-29℃

加热温度(Heating temperature)20℃120min

启动冷冻干燥机，机器直接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程40h。

当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞；关闭机器。剔除塞子不紧的西林瓶，西林瓶中样品为真空状态；

(6)储存

将样品放置在-18℃条件下避光保存，并对保存的样品进行适当管理和检测，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。

4、样品的均匀性和稳定性试验

对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均匀性和稳定性按照均匀性和稳定性试验按照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：

分别随机选取12个样品，采用Petrifilm^TM快速霉菌酵母测试片(RYM)测试方法，在重复条件测试2×12份样品的白色念珠菌。结果数据用方差分析法进行统计处理，统计步骤及结果如下：

表1方差分析公式

上表中，

表2样品均匀性检测结果

表3样品均匀性试验方差分析结果

结论：在95％置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性是可接受的。

采用两种类型的稳定性试验：一种是在贮存温度(4℃)下的稳定性试验，另一种是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度点，分别为20℃、36℃和42℃。定期检测样品，针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本，将2×3份样品结果的均值(对数转化后)用方差分析法进行统计处理，F值<F_临界值，则说明适用性试验菌株的稳定性符合要求，同时确定在不同温度条件下符合适用性试验菌株要求的最长保存时间。稳定性试验结果见表4和表5。

表4样品短期稳定性检测结果

表5样品短期稳定性试验方差分析结果

5、样品定值

具体步骤为：

采用Petrifilm^TM快速霉菌酵母测试片(RYM)方法，对样品进行检测，依据GB/T15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》中相应原则进行特性值的计算及不确定的评估。

实施例3

本实施例中所述的白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法的各步骤均与实施例2中相同，不同的技术参数为：冻干过程45h。

实施例4

本实施例中所述的白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法的各步骤均与实施例3中相同，不同的技术参数为：冻干过程50h。

Claims (4)

1.白色念珠菌适用性试验菌株，其特征是：仅包含一种目标菌：白色念珠菌，目标菌的目标浓度为500～2000CFU/支，每支装有0.2g的冻干粉；所述样品属药品检查中适用性试验用菌株，应用于药品微生物检测过程中适用性试验；所述适用性试验菌株以海藻糖、明胶和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10%、明胶体积分数为1%。

2.根据权利要求1所述的白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的配制、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验、样品定值五个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌液分装—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：

（1）菌株复苏传代

将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在30~35℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；

（2）增菌

目标菌培养至对数生长期末，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成菌液；

（3）菌液分装

将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，配制100mL菌液，将此菌液置于磁力搅拌器上不断搅拌下平均分装到菌液储存瓶中，每瓶5mL，共20瓶，置于液氮中保存备用；

（4）菌悬液配制

按目标菌的目标浓度500～2000 CFU/支，取适量上述5mL菌液与1500mL冻干保护剂混合，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到西林瓶中，0.3mL/瓶，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；

（5）冻干和包装

将装有菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；冷冻干燥机参数按如下设置：

冷冻速度 (Cooling Rate) 0.5℃/min

早期冷冻点 (Incipient Freezing Point) -1℃ 15min

冷冻温度 (Cooling temperature) -40℃

共熔点 (Melting Point Eutectic temperature) -29℃

加热温度 (Heating temperature) 20℃ 120min；

（6）储存

将样品放置在-18℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给实验室或进行均匀性和稳定性试验。

3.根据权利要求2所述的白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法，其特征是：所述冻干保护剂为含有海藻糖和明胶的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖10%，明胶1%；一次性配制相同浓度的菌液，可重复制备多批次相同量值范围的适用性试验菌株。

4.根据权利要求2所述的白色念珠菌适用性试验菌株的制备方法，其特征是：所述样品的均匀性和稳定性试验按照均匀性和稳定性试验参照GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。

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