CN111662951A - 棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品及其制备方法，首次采用棉签作为基质，添加目标菌和/或干扰菌制备阳性样品和阴性样品，与通常为冻干粉性质的微生物领域能力验证模拟样品不同的是，本发明可以提供一种可以复现检测流程的实物样品，为在一次性使用卫生用品微生物学能力验证的先例。该样品可用于实验室检测能力的评价，检测过程的质量控制、人员考核、方法验证等，填补了国内外空白。同时本发明的样品，均匀性、稳定性符合能力验证要求，避免棉签中大肠菌群检测样品中活的致病菌在运输、储存和测试等过程中都可发生变化的问题。另外本发明提供的制备方法，工艺简单，制备符合要求的样品成功率高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学检验质量控制技术领域，尤其涉及棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品及其制备方法。
背景技术
棉签属于一次性使用卫生用品，一次性使用卫生用品是指使用一次后即丢弃的、与人体直接或间接接触的、并为达到人体生理卫生或卫生保健(抗菌或抑菌)目的而使用的各种日常生活用品，以其易携带，使用简单而备受消费者青睐，已成为百姓日常生活中不可或缺的一部分。一次性使用卫生用品直接接触皮肤或黏膜，其质量好坏直接影响使用者的身体健康。
定性检测一次性使用卫生用品中微生物的能力，不仅可以直接反映出被微生物污染的程度，也是评价在生产过程中所用的原料、工具设备、工艺流程和操作者的卫生状况的必要手段，是对一次性使用卫生用品进行卫生学评价的综合依据。
由于一次性使用卫生用品微生物学检验领域的特殊性，国内外尚未有组织/机构制备以棉签为基质的大肠菌群定性检测的实物样品，也没有相关的文献报道。
大肠菌群是指一群好氧及兼性厌氧，在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它主要来源于人畜粪便，通常可作为水体粪便污染的指标菌。该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。其中，大肠埃希氏菌是大肠菌群典型的作为粪便污染的指标菌，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等)，因而卫生用品中有粪便污染，则可以推测该卫生用品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着卫生用品中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。因此，急需一种口罩中大肠菌群定性检测能力验证样品。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供了棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品及其制备方法，为一次性使用卫生用品的微生物学能力验证提供重要保证。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明首先提供了棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，所述样品包括阴性样品和阳性样品，其中，阳性样品含有基质、目标菌和干扰菌，阴性样品含有基质和干扰菌；基质为棉签，目标菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，干扰菌为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)中的一种或两种。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品中，样品中的菌浓度为103-106cfu/mL。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品中，所述阳性样品的目标菌与干扰菌按体积比1:2-3的比例混合成混合菌，添加至基质中。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品中，所述样品为冻干样品，冻干保护剂含有体积分数为8-10％的海藻糖、体积分数为3-5％的谷氨酸钠、体积分数为0.5-3％的明胶以及体积分数为2-5％的脱脂乳粉。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品中，每个菌种与冻干保护剂的体积比均为1:9～3:7。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品中，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用。
本发明还提供了上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，包括以下步骤：
S1、菌株复苏传代
将每种菌株进行复苏，并对复苏的菌株进行鉴定；
S2、菌株扩增
复苏后单一的活菌株在36℃±1℃温度下培养36h，用无菌生理盐水洗脱，并逐级稀释至浓度为103-106cfu/mL，按照1:9～3:7的比例与冻干保护剂混合，制成相应单一菌种的冻干菌悬液；
S3、菌悬液配制
阳性样品按目标菌的目标浓度102-105cfu/mL与干扰菌的每种菌目标浓度102-105cfu/mL配制菌悬液，按目标菌和干扰菌体积比1:2-3比例混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
阴性样品的干扰菌按每种菌目标浓度103-106cfu/mL等体积混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
S4、基质处理
取一次性棉签，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用；
S5、冻干
将混合菌悬液滴加在每份棉签基质中，待棉签将液体完全吸收后将其装入样品瓶中冻干，得到冻干样品。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，步骤S1中将每种菌株分别接种至TSA培养基，36℃±1℃温度下有氧培养36h。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，步骤S2的冻干保护剂含有体积分数为8-10％的海藻糖、体积分数为3-5％的谷氨酸钠、体积分数为0.5-3％的明胶以及体积分数为2-5％的脱脂乳粉。
上述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，步骤S5中冻干时间为40-50h。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，首次采用棉签作为基质，添加目标菌和/或干扰菌制备阳性样品和阴性样品，与通常为冻干粉性质的微生物领域能力验证模拟样品不同的是，本发明可以提供一种可以复现检测流程的实物样品，为在一次性使用卫生用品微生物学能力验证的先例。该样品可用于实验室检测能力的评价，检测过程的质量控制、人员考核、方法验证等，填补了国内外空白。同时本发明的样品，均匀性、稳定性符合能力验证要求，避免棉签中大肠菌群检测样品中活的致病菌在运输、储存和测试等过程中都可发生变化的问题。另外本发明提供的制备方法，工艺简单，获得CNAS—GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》要求的样品成功率高。
具体实施方式
本发明提供了棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，所述样品包括阴性样品和阳性样品，其中，阳性样品含有基质、目标菌和干扰菌，阴性样品含有基质和干扰菌；目标菌就是考核样品的主要检测菌，干扰菌为目标菌生化相似或形态相似的细菌。能够准确分离并区分目标菌和背景菌为主要考核目标。
其中，基质为棉签，目标菌为大肠埃希氏菌，干扰菌为粪肠球菌、蕈状芽孢杆菌中的一种或两种。本发明采用的大肠埃希氏菌(ATCC 25922)、粪肠球菌(ATCC 29212)、蕈状芽孢杆菌(ATCC 10206)均购于ATCC，保证了菌株的溯源性，以上菌株只作为本发明实施方式的示范性举例，均可换成等效菌株。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
实施例1棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备
包括以下步骤：
S1、菌株复苏传代
将将每种菌株分别接种至TSA培养基，36℃±1℃温度下有氧培养36h，并对复苏的菌株进行鉴定；
S2、菌株扩增
复苏后单一的活菌株在36℃±1℃温度下培养36h，此时目标菌大肠埃希氏菌培养至稳定期，其他干扰菌培养至对数生长期末，稳定期与对数生长末期的细菌其生化特性较对数生长期的细菌更为典型，对冷冻干燥过程中机械性损伤抵抗能力较强，再用无菌生理盐水洗脱，并逐级稀释至菌浓度为103cfu/mL，按照1:9的比例与冻干保护剂混合，制成相应单一菌种的冻干菌悬液；冻干保护剂含有体积分数为8％的海藻糖、体积分数为3％的谷氨酸钠、体积分数为0.5％的明胶以及体积分数为2％的脱脂乳粉，用无菌水配置灭菌后使用；
S3、菌悬液配制
阳性样品按目标菌的目标浓度102cfu/mL与干扰菌的每种菌目标浓度102cfu/mL配制菌悬液，按目标菌和干扰菌体积比1:2比例混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
阴性样品的干扰菌按每种菌目标浓度103cfu/mL等体积混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
S4、基质处理
取一次性棉签，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用；
S5、冻干
将混合菌悬液滴加在每份棉签基质中，待棉签将液体完全吸收后将其装入样品瓶(西林瓶)中开盖放入冻干机中，冻干40h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态，关机后对胶塞外压制一次性可撕铝盖，得到冻干样品。冷冻干燥机参数按如下设置：冷冻速度1℃/min；早期冷冻点-1℃15min；冷冻温度-45℃；共熔点-31℃；加热温度15℃180min。启动冷冻干燥机，机器直接进入程序化的冷冻干燥过程，整个冻干过程40h。
S6、包装和储存
冻干样品放置在4℃的温度下保存。
实施例2棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备
包括以下步骤：
S1、菌株复苏传代
将将每种菌株分别接种至TSA培养基，36℃±1℃温度下有氧培养36h，并对复苏的菌株进行鉴定；
S2、菌株扩增
复苏后单一的活菌株在36℃±1温度下培养36h，用无菌生理盐水洗脱，并逐级稀释至菌浓度为104cfu/mL，按照2:8的比例与冻干保护剂混合，制成相应单一菌种的冻干菌悬液；冻干保护剂含有体积分数为9％的海藻糖、体积分数为4％的谷氨酸钠、体积分数为1％的明胶以及体积分数为3％的脱脂乳粉，用无菌水配置灭菌后使用；
S3、菌悬液配制
阳性样品按目标菌的目标浓度103cfu/mL与干扰菌的每种菌目标浓度103cfu/mL配制菌悬液，按目标菌和干扰菌体积比1:3比例混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
阴性样品的干扰菌按每种菌目标浓度104cfu/mL等体积混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
S4、基质处理
取一次性棉签，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用；
S5、冻干
将混合菌悬液滴加在每份棉签基质中，待棉签将液体完全吸收后将其装入样品瓶(西林瓶)中开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数通实施例1，冻干45h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态，关机后对胶塞外压制一次性可撕铝盖，得到冻干样品。
S6、包装和储存
冻干样品放置在4℃的温度下保存。
实施例3棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备
包括以下步骤：
S1、菌株复苏传代
将将每种菌株分别接种至TSA培养基，36℃±1℃温度下有氧培养36h，并对复苏的菌株进行鉴定；
S2、菌株扩增
复苏后单一的活菌株在36℃±1℃温度下培养36h，用无菌生理盐水洗脱，并逐级稀释至菌浓度为106cfu/mL，按照3:7的比例与冻干保护剂混合，制成相应单一菌种的冻干菌悬液；冻干保护剂含有体积分数为10％的海藻糖、体积分数为5％的谷氨酸钠、体积分数为3％的明胶以及体积分数为5％的脱脂乳粉，用无菌水配置灭菌后使用；
S3、菌悬液配制
阳性样品按目标菌的目标浓度105cfu/mL与干扰菌的每种菌目标浓度105cfu/mL配制菌悬液，按目标菌和干扰菌体积比1:3比例混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
阴性样品的干扰菌按每种菌目标浓度106cfu/mL等体积混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
S4、基质处理
取一次性棉签，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用；
S5、冻干
将混合菌悬液滴加在每份棉签基质中，待棉签将液体完全吸收后将其装入样品瓶(西林瓶)中开盖放入冻干机中，冷冻干燥机参数通实施例1，冻干50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态，得到冻干样品。
S6、包装和储存
冻干样品放置在4℃的温度下保存。
实施例4棉签中大肠菌群均匀性和稳定性验证
对样品中目标菌的均匀性和稳定性检查是验证样品制备过程有效性的主要方法。检查样品均匀性和稳定性按照CNAS—GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》进行。
所得样品均匀性和稳定性检测方法及结果如下：
分别随机选取实施例1的10个样品，采用GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验，大肠菌群计数》第二法平板计数法，对目标菌进行检测，在重复条件测试2×10份样品的大肠埃希氏菌。结果数据用方差分析法进行统计处理，统计步骤及结果如表1。
表1样品中大肠埃希氏菌检测结果
表2样品中大肠埃希氏菌方差分析统计结果
结论：F临界值F0.05(9,10)＝3.02。计算得出的F值为1.32，样品F值＜临界值，这表明在0.05显著水平时，该样品中目标菌的分布是均匀的。实施例2和3的所得样品的均匀性结果与实施例1近似。
稳定性采用两种类型的试验：一种是在贮存温度(4℃)下的稳定性试验，另一种是在高的温度(模拟样品的运输条件)下的稳定性试验，选用三个温度点，分别为25℃、36℃和42℃。随机取实施例1的样品，定期检测样品，针对不同温度点不同的保存时间测试3个样本，稳定性测试中样品的检测值与指定值均为一致时，则说明该能力验证样品的稳定性符合要求，同时确定在不同温度条件下符合该能力验证样品要求的最长保存时间。稳定性试验结果见下表3。
表3稳定性试验结果
结论：4℃低温储存120天和42℃高温储存20天，样品检测结果全部符合要求，稳定性好。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，其特征在于，包括阴性样品和阳性样品，其中，阳性样品含有基质、目标菌和干扰菌，阴性样品含有基质和干扰菌；基质为棉签，目标菌为大肠埃希氏菌，干扰菌为粪肠球菌、蕈状芽孢杆菌中的一种或两种。
2.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，其特征在于，样品中的菌浓度为103-106cfu/mL。
3.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，其特征在于，所述阳性样品的目标菌与干扰菌按体积比1:2-3的比例混合成混合菌，添加至基质中。
4.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，其特征在于，所述样品为冻干样品，冻干保护剂含有体积分数为8-10％的海藻糖、体积分数为3-5％的谷氨酸钠、体积分数为0.5-3％的明胶以及体积分数为2-5％的脱脂乳粉。
5.如权利要求4所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，其特征在于，每个菌种与冻干保护剂的体积比均为1:9～3:7。
6.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品，其特征在于，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用。
7.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌株复苏传代
将每种菌株进行复苏，并对复苏的菌株进行鉴定；
S2、菌株扩增
复苏后单一的活菌株在36℃±1℃温度下培养36h，用无菌生理盐水洗脱，并逐级稀释至菌浓度为103-106cfu/mL，按照1:9～3:7的比例与冻干保护剂混合，制成相应单一菌种的冻干菌悬液；
S3、菌悬液配制
阳性样品按目标菌的目标浓度102-105cfu/mL与干扰菌的每种菌目标浓度102-105cfu/mL配制菌悬液，按目标菌和干扰菌体积比1:2-3比例混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
阴性样品的干扰菌按每种菌目标浓度103-106cfu/mL等体积混合，制成混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌；
S4、基质处理
取一次性棉签，所述棉签为脱脂棉构成，棉签灭菌后备用；
S5、冻干
将混合菌悬液滴加在每份棉签基质中，待棉签将液体完全吸收后将其装入样品瓶中冻干，得到冻干样品。
8.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，其特征在于，步骤S1中将每种菌株分别接种至TSA培养基，36℃±1℃温度下有氧培养36h。
9.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，其特征在于，步骤S2的冻干保护剂含有体积分数为8-10％的海藻糖、体积分数为3-5％的谷氨酸钠、体积分数为0.5-3％的明胶以及体积分数为2-5％的脱脂乳粉。
10.如权利要求1所述的棉签中大肠菌群定性检测能力验证样品的制备方法，其特征在于，步骤S5中冻干时间为40-50h。
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|---|---|---|---|---|
| CN113308432A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-27 | 广西大学 | 一种稻曲病菌薄壁分生孢子的转移和分散方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107190046A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-09-22 | 中国检验检疫科学研究院 | 药品中大肠埃希菌能力验证样品及其制备方法 |
| CN107227338A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-10-03 | 中检科（北京）实验室能力评价有限公司 | 生活饮用水中大肠埃希氏菌能力验证样品及其制备方法 |
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2020
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Patent Citations (2)
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